建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染

《建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

学校代码：１０２８５ｒＶ学号：２０１５５２３２０５４ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶ（专业学位）＿■建立和应用多重ＰＣＲ方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染ＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｕｌｔｉｐｌｅｘＰＣＲＡｓｓａｙｔｏＳｔｕｄｙｅａｒｌＭＨｅｒｅＴ＿ｙｅｐ研究生姓名姬玉涵指导教师姓名吴小津专业名称内科学（血液病学）研究方向造血干细胞移植苏州大学附属第一医院．所在院部＿论文提交日期２０１８年３月國 苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名：日期： 苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，即：学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所（含万方数据电子出版社）、中国学术期刊（光盘版）电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文□本学位论文属在年月解密后适用本规定。非涉密论文□论文作者签名：日期：导师签名：日期： 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染中文摘要第一部分建立多重PCR方法检测八种人类疱疹病毒【目的】建立能同时扩增八种人类疱疹病毒的多重PCR方法。【方法】通过NCBI数据库找到八种疱疹病毒的保守序列，基于这些保守序列运用软件进行疱疹病毒引物探针的设计，将设计好的引物探针进行可行性验证，经过对PCR反应体系和条件的优化，建立稳定的多重PCR扩增方法。随机选取造血干细胞移植后患者的外周血标本200份，采用Lab-Aid824核酸提取Mini试剂抽取全基因组DNA，建立的多重PCR方法对八种疱疹病毒同时进行扩增。对HSV-1、HSV-2、EBV、CMV四种疱疹病毒，采用与已有的国际标准品比对的方法进行特异性检验，对目前没有国际标准品的VZV、HHV-6、HHV-7、HHV-8四种疱疹病毒，则采用一代测序的方法进行特异性检验。采用不同浓度的质控品对已建立的多重PCR方法进行敏感性检验。【结果】（1）成功设计多重PCR的引物探针，建立稳定的多重PCR反应体系，同时扩增八种人类疱疹病毒，扩增条件通过优化后，提高了扩增效率。（2）多重PCR方法与目前已有的单一疱疹病毒检测试剂盒对HSV-1、HSV-2、EBV、CMV四种疱疹病毒的检测结果比较，差异无统计学意义（P>0.05）。VZV、HHV-6、HHV-7、HHV-8四种疱疹病毒，多重PCR方法扩增的阳性样本产物进一步行一代测序，经过序列比对显示扩增序列为此四种疱疹病毒的序列，该方法具有较强的特异性。（3）将合成的质控品分别稀释成1x105、1x104以及1x103的拷贝数进行敏感度检验，显示多重PCR方法可以检测出低于1x103的样本，该方法具有较高的敏感度。I 【结论】建立的多重PCR方法可同时扩增并鉴别八种人类疱疹病毒，具有较强的特异性和较高的敏感度。【关键词】疱疹病毒；多重PCR方法；特异性；敏感度第二部分造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染的临床研究【目的】应用多重PCR方法同时检测八种人类疱疹病毒，分析造血干细胞移植（Hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT）90天内八种人类疱疹病毒的感染状况，并探讨造血干细胞移植后多种疱疹病毒感染与临床因素的相关性及其对移植后并发症和预后的影响。【方法】以苏州大学附属第一医院血液科2017年2月～2017年8月行HSCT的90例患者为研究对象，收集其移植预处理前和移植后90天内不同时间点的外周血标本共734份，Lab-Aid824核酸提取Mini试剂抽提全基因组DNA，应用多重PCR方法同时扩增八种人类疱疹病毒，分析造血干细胞移植前和移植后早期单一和多种疱疹病毒感染的状况，并采用多种统计方法分析移植后早期多种疱疹病毒感染与临床因素的相关性及其对移植后并发症和预后的影响。【结果】（1）90例患者中男53例，女37例，中位年龄为29.9（9～51）岁。至随访终点，中位随访时间为192（35～308）天；发生0-Ⅰ度aGVHD的患者有58例（64.4%），发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的患者有32例（35.6%）；粒系植入中位时间为12（8～23）天，巨核系植入中位时间为14（9～36）天；HSCT后患者的总体生存（OS）率为90.6%，移植后复发率为11.7%，无疾病进展生存(PFS)率为88.3%，移植后非复发死亡(NRM)率为5.6%。（2）90例患者中，造血干细胞移植前疱疹病毒感染发生率为35.6%（32/90），其中1种病毒感染发生率为12.2%（11/90），多种病毒感染发生率为23.3%（21/90）。HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，CMV，HHV-6，HHV-7，HHV-8的样本检出率分别为II 20%（18/90），4.4%（4/90），3.3%（3/90），26.7%（24/90），5.6%（5/90），4.4%（4/90），2.2%（2/90），3.3%（3/90），同时检出多种疱疹病毒的样本检出率为23.3%（21/90）。造血干细胞移植后早期HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，CMV，HHV-6，HHV-7，HHV-8的样本检出率分别是12.4%（80/644），1.6%（10/644），1.7%（11/644），20.5%（132/644），17.4%（112/644），5.7%（37/644），2.2%（14/644），1.4%（9/644），同时检出2种病毒的样本检出率为8.3%（62/644），同时检出3种病毒的样本检出率为1.7%（11/644），相同样本未同时检出4种疱疹病毒。90例患者中，移植后疱疹病毒感染发生率为77.8%（70/90），其中1种疱疹病毒感染发生率为20%（18/90），多种疱疹病毒感染发生率为57.8%（52/90）。在多种疱疹病毒感染的患者中2种病毒感染的有30例（57.7%），3种病毒感染的有18例（34.6%），4种病毒感染的有4例（7.7%）。（3）造血干细胞移植后34例患者出现病毒感染相关的临床表现，主要为出血性膀胱炎（HC）的有27例，间质性肺炎的有3例，肠炎的有2例，病毒性脑炎的有3例，不明原因发热的有3例。其中27例HC患者中，有2例合并有间质性肺炎，1例合并有病毒性脑炎，1例合并有不明原因发热。27例HC患者中有20例患者检出疱疹病毒感染，其中4例检出单一病毒感染，16例检出多种病毒感染；发生间质性肺炎的3例患者均检出多种疱疹病毒感染；发生肠炎的2例患者也均检出多种疱疹病毒感染；3例病毒性脑炎的患者中，2例检出疱疹病毒感染；3例不明原因发热的患者中，2例检出疱疹病毒感染。（4）我们分析了八种疱疹病毒间发生感染的相关性，结果显示HSV-1和HSV-2两种病毒感染存在相关性（r=-0.279，P=0.046）；HHV-6和HHV-7两种病毒感染也存在相关性（r=0.381，P=0.007）。分析了患者的年龄，性别，疾病类型，发病时间等临床因素与移植前八种疱疹病毒感染的相关性，结果显示移植前患者的年龄与HSV-1感染发生具有一定的相关性（r=0.44，P=0.035），移植前其他的单一疱疹病毒感染和多种疱疹病毒感染均未统计出与临床因素存在明显的相关性（P>0.05）。分析了供受体年龄，性别，血型，HLA配型，受体疾病类型，预处理方式，II-IV度aGVHD等因素与移植后常见单一疱疹病毒感染（HSV-1，EBV，CMV，HHV6）及多种疱疹病毒感染的相关性，结果显示常见单一疱疹病毒感染均未见与临床因素存在相关性，≥2种疱疹病毒感染与HLA不全相合（P=0.003），使用ATG（P=0.048）和II-IV度aGVHD（P=0.022）呈正相关。多因素分析显示HLA不全相合（P=0.003，OR=7.572，95%CI：III 2.029-28.255）和II-IV度aGVHD（P=0.016，OR=6.415，95%CI：1.422-29.264）是≥2种疱疹病毒感染发生的独立危险因素。（5）我们分析了移植后常见单一疱疹病毒感染和≥2种疱疹病毒感染对移植后植入，II-IV度aGVHD，复发，NRM，PFS和OS的影响。结果显示≥2种疱疹病毒感染(P=0.028)和伴有HHV-6感染(P=0.006)均可增加II-IV度aGVHD发生率。【结论】造血干细胞移植前后均存在一种和多种疱疹病毒感染；其中HSV-1和HSV-2，HHV-6和HHV-7病毒感染两两间存在一定的相关性；HLA不全相合和II-IV度aGVHD增加了≥2种疱疹病毒感染发生率，而伴有HHV-6感染和≥2种疱疹病毒感染可增加II-IV度aGVHD发生率。【关键词】多重PCR方法；造血干细胞移植；多种疱疹病毒作者：姬玉涵导师：吴小津IV EstablishmentandApplicationofMultiplexPCRAssaytoStudyearlyMultipleHerpesvirusesinfectionduringHSCTAbstractPARTⅠEstablishmentofmultiplexPCRassayforeightherpesviruses【Objective】ToestablishamultiplexPCRassaytodetecteightherpesvirusesatthesametime.【Methods】Theconservedsequenceofthe8viruseswereidentifiedfromNCBI.Properprobesandprimersweredesignedbysoftwareandthefeasibilityoftheprimersandprobeswerechecked.TwohundredbloodsamplesfrompatientsafterhematopoieticstemcelltransplantationwerecollectedrandomlytotestthesensitivityandspecificityofthemultiplexPCRassay.Intheexperiment,forHSV-1,HSV-2,EBV,andCMV,thespecificitywithmultiplexPCRassaywerecomparedwiththeirstandardkits.Forthoseviruseswithoutstandardkits,the1stgenerationsequencingwasdone.【Results】（1）Inthestudy,wedesignedprobesandprimersofthemultiplexPCRassay,successfully.Itcoulddetecteightherpesvirusesatthesametime.Aftertheimprovementofthereactionconditionsandsystem,theamplificationefficiencyofmultiplexPCRwasfeasible.（2）TherewerenodifferenceofspecificitybetweenmultiplexPCRassayandHSV-1,HSV-2,EBV,CMVkit.ForVZV,HHV-6,HHV-7andHHV-8positivesamples,theresultsof1stgenerationsequencingshowedacorrectsequenceofthoseviruses.Thespecificityoftheassaywasstrong.（3）ThemultiplexPCRassaycoulddetectthesampleswithunder1×103copies.Itshowedthatthesensitivityoftheassaywashigh.【Conclusion】TheestablishedmultiplexPCRassayissensitiveandspecifictodetecteighthumanV herpesvirusesatthesametime.【Keywords】Humanherpesvirus;MultiplexPCRassay;Sensitivity;SpecificityPARTⅡClinicalstudyofearlyMultipleherpesvirusesinfectionduringhematopoieticstemcelltransplantationusingmultiplexPCRassay【Objective】Tostudytheprevalenceofeightherpesvirusesinfectionwithin90daysafterHSCTwiththemultiplexPCRassayandtoexploretheassociationbetweenmultipleherpesvirusesinfectionandclinicalcharacteristicsinHSCTpatientsanditsimpactonpost-transplantcomplicationsandprognosis.【Methods】NinetyconsecutivepatientsundergoingHSCTattheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversitybetweenFebruary2017andAugust2017wereenrolledinthestudy,734peripheralbloodspecimenswereobtainedbeforeandwithin90daysaftertransplantationatdifferenttimepoints,Lab-Aid824NucleicAcidExtractionMiniReagentwasusedtoextractDNAandmultiplexPCRassaywasusedtodetecteighthumanherpesvirusesatonce.Weanalyzedtheprevalenceofmultipleherpesvirusesinfectionwithin90daysafterHSCTandexploredthecorrelationbetweenmultipleherpesvirusesinfectionandclinicalcharacteristicsinHSCTpatientsanditsimpactonpost-transplantcomplicationsandprognosisbyvariousstatisticalmethods.【Results】1.Therewere53maleand37femalepatientswithamedianageof29.5yearsold(range:9-51).Themedianfollow-uptimewas192days(range:35-308).Thirty-two(35.6%)patientssufferedfromgradeII-IVaGVHD.Themediantimeofneutrophilengraftmentwas12days(range:8-23).Themediantimeofplateletrecoverywas14days(range:9-36).ThecumulativeincidenceofrelapseandNRM(non-relapsemortality)were11.7%and5.6%,respectively.Theoverallsurvival(OS)andprogressionfreesurvival(PFS)were90.6%and88.3%,respectively.2.MultiplexPCRdetectedHSV-1in18(20%),HSV-2in4(4.4%),VZVin3(3.3%),EBVin24(26.7%),CMVin5(5.6%),HHV-6in4(4.4%),HHV-7in2(2.2%),HHV-8inVI 3(3.3%)samplesof90bloodsamplesbeforeHSCT.Multipledetectionof≥2kindsofviruseswasobservedin21(23.3%)samples.MultiplexPCRdetectedHSV-1in80(12.4%),HSV-2in10(1.6%),VZVin11(1.7%),EBVin132(20.5%),CMVin112(17.4%),HHV-6in37(5.7%),HHV-7in14(2.2%),andHHV-8in9(1.4%)samplesof644bloodsamplesfromallpatientswithin90daysafterHSCT.Meanwhile,twovirusesinfectionwasdetectedsimultaneouslyin8.3%(62/644)samples,and3kindsofvirusessimultaneouslywasobservedin1.7%(11/644)samples.Therewere77.8%(70/90)patientssufferingfromherpesvirusesinfection.TheinfectionratesofHSV-1,HSV-2,VZV,EBV,CMV,HHV-6,HHV-7andHHV-8afterHSCTwere28.9%(26/90),5.6%(5/90),5.6%(5/90),50%(45/90),46.7%(42/90),14.4%(13/90),5.6%(5/90),6.7%(6/90),respectively.Multipledetectionof3viruseswasobservedin34.6%(18/52)patients.ThemostfrequentcoinfectioninallpatientswasacombinationofHSV-1,EBVandCMV(38.9%,7/18).Thecoinfectionof4kindsofviruseswasobservedin4cases.3.34patientsinourstudyexperiencedclinicalsymptomsassociatedwithviralinfection.Themainmanifestationswerehemorrhagiccystitis(HC)in27patientsinterstitialpneumoniain3patients,enteritisin2patients,viralencephalitisin3patientsandunexplainedfeverin3patients.Herpesvirusinfectionwasdetectedin20of27HCpatients,coinfectionwithEBVandCMVwasthemostcommoninpatientswithHC.Multipledetectionof≥2kindsofviruseswasobservedinallpatientswithinterstitialpneumonia.CoinfectionofHSV-1,CMV,HHV-6,andHHV-7anddualinfectionofHSV-1andHHV-6weredetectedin2patientswithenteritis.Amongthepatientsofviralencephalitis,dualinfectionofHSV-1andEBVandmixedinfectionofHSV-2,EBVandHHV-8wereobservedin2cases.HSV-1andEBVweredetectedin2patientsofunexplainedfever,respectively.4.TherewasacorrelationbetweenHSV-1andHSV-2infection.ThecorrelationbetweenHHV-6andHHV-7infectionwasalsoobserved.Thecorrelationbetweentheherpesvirusinfectionandclinicalcharacteristicswasanalyzed.TheageofpatientswascorrelatedwiththeincidenceofHSV-1infectionbeforetransplantation.Theresultsshowedthat≥2kindsofvirusescoinfectionwasassociatedwithHLAmismatch(P=0.003)，gradeII-IVaGVHD(P=0.022)andtheuseofATG(P=0.048).MultivariateanalysisshowedthatHLAmismatchandgradeII-IVaGVHDwereindependentriskfactorsfor≥2kindsofvirusescoinfection.VII 5.Weanalyzedtheimpactofherpesvirusinfectiononengraftment,theincidenceofgradeII-IVaGVHD,relapse,NRM,PFSandOSaftertransplantation.TheresultsshowedthatwithHHV-6infectionand≥2herpesvirusesinfectionincreasedtheincidenceofgradeII-IVaGVHD.【Conclusion】Theinfectionofsingleandmultipleherpesvirusesexistsbeforeandaftertransplantion.ThereisacorrelationbetweenHSV-1andHSV-2infection.HHV-6andHHV-7infectionhavethecorrelationtoo.HLAmismatchandgradeII-IVaGVHDcanincreasetheincidenceof≥2kindsofvirusescoinfection.WithHHV-6infectionand≥2herpesvirusesinfection,whichbothincreasetheincidenceofgradeII-IVaGVHD.【Keywords】MultiplexPCRassay;Hematopoieticstemcelltransplantion;MultipleherpesvirusesWrittenby:JiYuhanSupervisedby:WuXiaojinVIII 目录前言........................................................................................................................................1参考文献............................................................................................................................3第一部分建立多重PCR方法检测八种人类疱疹病毒....................................................71.引言.................................................................................................................................72.材料和方法.....................................................................................................................73.结果...............................................................................................................................134.讨论...............................................................................................................................18参考文献..........................................................................................................................20第二部分造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染的临床研究..................................221.引言...............................................................................................................................222.病例和方法...................................................................................................................223.结果...............................................................................................................................264.讨论...............................................................................................................................32参考文献..........................................................................................................................34综述..................................................................................................................................37参考文献..........................................................................................................................41英文缩略词汇表..................................................................................................................45攻读学位期间公开发表的文章..........................................................................................46致谢..................................................................................................................................47 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染前言前言造血干细胞移植（Hematopoieticstemcelltransplantation，HSCT）作为治疗血液系统疾病的有效手段，现广泛应用于临床，不仅可以治疗血液系统恶性肿瘤及实体肿瘤，同时也可以治疗血液系统非恶性疾病，如再生障碍性贫血（AA）、地中海贫血、代谢病及先天性免疫缺陷综合征等[1,2]。随着HSCT的广泛应用，移植后感染性并发症的问题日益突出，是目前常见的移植相关并发症和主要死亡原因之一，其中人类疱疹病毒（Humanherpesvirus，HHV）是主要的感染病原体[3,4,5,6]。人类疱疹病毒包括单纯疱疹病毒1型和2型（Herpessimplexvirus，HSV-1andHSV-2），水痘-带状疱疹病毒（Varicella-zostevirus，VZV），EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV），人类巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV），疱疹病毒6，7，8型（HHV-6，7，8）。根据其生物学特性又可分为α、β、γ三个亚科。人类疱疹病毒原发感染后可在宿主体内长期潜伏，HHV1-3（HSV-1，HSV-2，VZV）主要潜伏在感觉神经节，其他的疱疹病毒（EBV，CMV，HHV6-8）则主要潜伏在淋巴细胞、单核细胞、有时也可在上皮细胞[7]。当机体免疫功能受到抑制，尤其是造血干细胞移植后，潜伏性感染的病毒可再次激活，引起相关疾病[8,9]。HSV感染通常发生在移植后第一个月内，发生率为24％～34％，主要表现为口腔，生殖器或肛周疾病[10,11]。好发于移植后期的VZV的感染率为33%～41%，使用阿昔洛韦预防性治疗后，感染率可下降至20%～32%[12]。EBV感染可引起病毒性脑炎，肺炎，感染等疾病，还可以导致潜在致命性并发症，如淋巴细胞增殖性疾病（Lymphoproliferativedisease，PTLD），相关研究表明HSCT后EBV的感染率为8.8%～65.0%，PTLD的发生率为1%-30%[13]。CMV感染及其合并症是影响HSCT患者预后的重要原因，其在HSCT患者的发生率至20%～60%[14]。EBV和CMV感染发生相对较晚，通常在移植后28～56天[14]。国外学者研究发现HSCT后，HHV-6的感染率约为40%[15,16,17]。关于HHV-7感染的研究较少，但相关文献报道可发生在0~46％的HSCT患者中[18]。HHV-6和HHV-7感染大多发生在移植后2～4周，相对于CMV感染发生早[18,19]。与其他疱疹病毒不同，HHV-8感染并不常见[20]。因此早诊断、早治疗对控制人类疱疹病毒感染，降低移植受者的发病率和死亡率极为重要。1 前言建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染人类疱疹病毒感染，病原体及感染灶常不明确，临床表现常不典型，并且相关病原学检测对实验室条件要求高，从而使人类疱疹病毒感染的诊断极为困难。现HSCT患者疱疹病毒感染的诊断有以下几个方面：临床表现、流行病学、病原学检测以及组织活检等。现国内外对于HSCT后疱疹病毒感染暂没有统一的诊断标准，同时疱疹病毒感染的临床表现缺乏特异性，从而使病原学检测在移植后疱疹病毒感染的诊断中极其重要。目前临床采用的病原学检测方法主要有病毒培养、抗体检测、病毒抗原、病毒DNA检测等。病毒培养被认为是目前病毒感染诊断的“金标准”，但病毒培养所需时间较长、敏感度低、标本的稳定性差，故很难指导临床治疗。聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）方法检测病毒DNA负荷量因其灵敏度及特异度高，近年来广泛应用于病毒活动性感染的检测以及抗病毒治疗效果的评价。普通PCR方法只能检测一种病毒DNA，会导致同时对多种病毒的检测消耗大量的财力、人力和时间。相关研究表明，可以利用不同的荧光色素对多种病毒同时进行检测即多重PCR方法[21,22,23,24]。多重PCR方法已应用于人类疱疹病毒相关疾病的检测，如脑炎、脑膜炎以及先天性综合征[25,26,27]。多重PCR方法在检测病毒感染及评估疗效上具有显著的优势，因为在一个反应体系中它可以对多种病毒同时实行扩增[21,22,23]。多重PCR方法对于移植后病人尤为实用，这类病人易于发生多种病毒感染，需定期对多种病毒进行同时检测。KaoruWada等学者研究表明多重PCR方法同单一荧光定量PCR方法一样具有灵敏性和特异性[28]。多重PCR方法的应用可以在早期发现多种病毒感染，从而采取积极的治疗措施，阻止其进展为严重的疾病，提高患者的生存质量，改善患者的预后。目前有研究发现造血干细胞移植后存在多种疱疹病毒感染，并且与临床结果存在相关性。ChapenkoS等人认为CMV和HHV-7混合感染是CMV疾病的高危因素[29]。A.M.Sampaio等学者研究发现CMV和HHV-6混合感染不仅是CMV疾病的高危因素，同时也是移植失败，真菌感染等的危险因素[30]。国内学者应用巢氏PCR方法对72例HSCT患者进行CMV和HHV-6的检测，发现造血干细胞移植后CMV和HHV-6混合感染状态普遍存在[31]。国外学者研究表明HHV-6和HHV-7有可能作为共同因素参与CMV感染再激活[32]。宋铁梅等学者研究发现CMV和EBV共激活在HLA不全相合移植及发生急性移植物抗宿主病（acutegraft-versus-hostdisease,aGVHD）患者中更多见，可能是异基因造血干细胞移植后早期死亡的高危因素[33]。除了EBV，CMV和2 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染前言HHV-6外，目前国内外对于多种疱疹病毒感染的研究鲜有报道，多种疱疹病毒感染状况并不清楚，因此有必要对HSCT后多种疱疹病毒感染与临床因素的相关性及其对移植后并发症和预后的影响进行研究。本研究基于NCBI数据库中的保守序列，设计八种人类疱疹病毒的引物探针，经过对PCR方法的优化，最终建立了能够同时检测八种人类疱疹病毒的多重PCR方法。通过建立的多重PCR方法，对造血干细胞移植患者进行八种人类疱疹病毒的检测，分析造血干细胞移植90天内八种人类疱疹病毒的感染状况，并探讨多种疱疹病毒感染与临床因素的相关性以及对移植后并发症和预后的影响。旨在为HSCT后人类疱疹病毒感染的管理提供参考，改善HSCT患者的预后。参考文献1.LjungmanP,BregniM,BruneM,etal.Allogeneicandautologoustransplantationforhaematologicaldiseases,solidtumoursandimmunedisorders:currentpracticeinEurope2009[J].Bonemarrowtransplantation,2010,45(2):219-234.2.ZallioF,PrimonV,TamiazzoS,etal.Epstein-Barrvirusreactivationinallogeneicstemcelltransplantationishighlyrelatedtocytomegalovirusreactivation[J].ClinicalTransplantation,2013,27(4):E491-497.3.dePagterPJ,SchuurmanR,VisscherH,etal.Humanherpesvirus6plasmaDNApositivityafterhematopoieticstemcelltransplantationinchildren:animportantriskfactorforclinicaloutcome.[J].BiologyofBlood&MarrowTransplantationJournaloftheAmericanSocietyforBlood&MarrowTransplantation,2008,14(7):831-839.4.PapadopoulouA,GerdemannU,KatariUL,etal.Activityofbroad-spectrumTcellsastreatmentforAdV,EBV,CMV,BKV,andHHV6infectionsafterHSCT[J].Sciencetranslationalmedicine,2014,6(242):242ra83.5.LoutfySA,AlamEl-DinHM,IbrahimMF,etal.Seroprevalenceofherpessimplexvirustypes1and2,Epstein-Barrvirus,andcytomegalovirusinchildrenwithacutelymphoblasticleukemiainEgypt[J].SaudiMedicalJournal,2006,27(8):1139-1145.6.BoeckhM,LeisenringW,RiddellSR,etal.Latecytomegalovirusdiseaseandmortalityinrecipientsofallogeneichematopoieticstemcelltransplants:importanceofviralloadandT-cellimmunity[J].Blood,2003,101(2):407-414.7.ArvinA,CampadellifiumeG,MocarskiE,etal.Humanherpesviruses:biology,therapy,3 前言建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染andimmunoprophylaxis[M].CambridgeUniversityPress,2007:595–596.8.ArvinAM.Varicella-Zostervirus:pathogenesis,immunity,andclinicalmanagementinhematopoieticcelltransplantrecipients[J].Biologyofbloodandmarrowtransplantation,2000,6(3):219-230.9.GriffithsPD,ClarkDA.Betaherpesvirusesintransplantrecipients[J].TheJournalofantimicrobialchemotherapy,2000,45SupplT3:29-34.10.SinghN,DummerJS,KusneS,etal.InfectionswithCytomegalovirusandOtherHerpesvirusesin121LiverTransplantRecipients:TransmissionbyDonatedOrganandtheEffectofOKT3Antibodies[J].JournalofInfectiousDiseases,1988,158(1):124-131.11.GaneE,SalibaF,ValdecasasGJ,etal.Randomisedtrialofefficacyandsafetyoforalganciclovirinthepreventionofcytomegalovirusdiseaseinliver-transplantrecipients.TheOralGanciclovirInternationalTransplantationStudyGroup[corrected][J].Lancet,1997,350(9093):1729-1733.12.SzerJ.Varicella-zosterinfectionafterallogeneicbonemarrowtransplantation:incidence,riskfactorsandpreventionwithlow-doseaciclovirandganciclovir[J].BoneMarrowTransplantation,2000,25(6):657-664.13.鲍协炳,朱倩,仇惠英,等.异基因造血干细胞移植后EBV感染临床危险因素分析[J].中华血液学杂志,2016,37(2):138-143.14.JenkinsFJ,RoweDT,JrCRR.HerpesvirusInfectionsinOrganTransplantRecipients[J].ClinDiagnLabImmunol,2003,10(1):1-7.15.HentrichM,OruzioD,JägerG,etal.Impactofhumanherpesvirus-6afterhaematopoieticstemcelltransplantation.[J].BritishJournalofHaematology,2005,128(1):66-72.16.ImbertmarcilleBM,TangXW,LepelletierD,etal.Humanherpesvirus6infectionafterautologousorallogeneicstemcelltransplantation:asingle-centerprospectivelongitudinalstudyof92patients.[J].ClinicalInfectiousDiseases,2000,31(4):881-886.17.ZerrDM,CoreyL,KimHW,etal.Clinicaloutcomesofhumanherpesvirus6reactivationafterhematopoieticstemcelltransplantation[J].ClinicalInfectiousDiseasesAnOfficialPublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica,2005,40(7):932-940.18.Dockrell,DavidH,Paya,CarlosV.Humanherpesvirus‐6and‐7in4 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染前言transplantation[J].ReviewsinMedicalVirology,2001,11(1):23-36.19.SinghN,CarriganDR.HumanHerpesvirus-6inTransplantation:AnEmergingPathogen[J].AnnalsofInternalMedicine,1996,124(12):1065-1071.20.LuppiM,BarozziP,SchulzTF,etal.Bonemarrowfailureassociatedwithhumanherpesvirus8infectionaftertransplantation.[J].NewEnglandJournalofMedicine,2000,343(19):1378-1385.21.AdelsonME,FeolaM,TramaJ,etal.Simultaneousdetectionofherpessimplexvirustypes1and2byreal-timePCRandPyrosequencing.[J].JournalofClinicalVirology,2005,33(1):25-34.22.PradeauK,CoutyL,SzelagJC,etal.Multiplexreal-timePCRassayforsimultaneousquantitationofhumancytomegalovirusandherpesvirus-6inpolymorphonuclearandmononuclearcellsoftransplantrecipients[J].JournalofVirologicalMethods,2006,132(1-2):77-84.23.TempletonKE,ScheltingaSA,BeersmaMF,etal.Rapidandsensitivemethodusingmultiplexreal-timePCRfordiagnosisofinfectionsbyinfluenzaaandinfluenzaBviruses,respiratorysyncytialvirus,andparainfluenzaviruses1,2,3,and4[J].Journalofclinicalmicrobiology,2004,42(4):1564-1569.24.TraversoM,MalnatiM,MinettiC,etal.Multiplexreal-timePCRfordetectionofdeletionsandduplicationsindystrophingene[J].Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2006,339(1):145-150.25.CasasI,PozoF,TralleroG,etal.ViraldiagnosisofneurologicalinfectionbyRTmultiplexPCR:asearchforentero-andherpesvirusesinaprospectivestudy[J].Journalofmedicalvirology,1999,57(2):145-151.26.ZhangY,KimuraT,FujikiK,etal.Multiplexpolymerasechainreactionfordetectionofherpessimplexvirustype1,type2,cytomegalovirus,andvaricella-zostervirusinocularviralinfections[J].JapaneseJournalofOphthalmology,2003,47(3):260-264.27.AshshiAM,KlapperPE.Detectionofhumancytomegalovirus,humanherpesvirustype6andhumanherpesvirustype7inurinespecimensbymultiplexPCR[J].TheJournalofinfection,2003,47(1):59-64.28.WadaK,KubotaN,ItoY,etal.SimultaneousquantificationofEpstein-Barrvirus,cytomegalovirus,andhumanherpesvirus6DNAinsamplesfromtransplantrecipientsbymultiplexreal-timePCRassay.[J].JournalofClinicalMicrobiology,2007,5 前言建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染45(5):1426-1432.29.ChapenkoS,FolkmaneI,TomsoneV,etal.Co-infectionoftwobeta-herpesviruses(CMVandHHV-7)asanincreasedriskfactorfor'CMVdisease'inpatientsundergoingrenaltransplantation[J].Clinicaltransplantation,2000,14(5):486-492.30.SampaioAM,GuardiaAC,MilanA,etal.Co-infectionandclinicalimpactofhumanherpesvirus5and6inlivertransplantation.[J].TransplantProc,2012,44(8):2455-2458.31.王立茹,董陆佳,陆道培.异基因造血干细胞移植后人类疱疹病毒6型感染及其与巨细胞病毒感染的相关性[J].中国实验血液学杂志,2006,14(6):1204-1209.32.DzieciatkowskiT,TomaszewskaA,PrzybylskiM,etal.Analysisofthesheddingofthreeβ-herpesvirusesDNAinPolishpatientssubjectedtoallogeneichematopoieticstemcelltransplantation:Six-yearfollowup[J].JournalofClinicalVirologytheOfficialPublicationofthePanAmericanSocietyforClinicalVirology,2016:30-35.33.宋铁梅,陈广华,张翔,等.异基因造血干细胞移植后CMV与EBV共激活患者临床预后分析[J].中华医学杂志,2014(40):3135-3139.6 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第一部分第一部分建立多重PCR方法检测八种人类疱疹病毒1.引言人类疱疹病毒是造血干细胞移植后病毒感染的常见病原体[1,2,3,4]，造血干细胞移植患者因免疫受到抑制，易发生疱疹病毒感染，疱疹病毒感染可引起严重的并发症[5]。因此对疱疹病毒进行早期检测，及时干预，防止疾病进展，显得尤为重要。但疱疹病毒感染，临床表现常不典型，且目前国内外对于疱疹病毒感染暂没有统一的的诊断标准，使得人类疱疹病毒感染的诊断极为困难。快速全面的病毒检测手段对于临床诊断非常重要，目前虽然已有针对HHV1-2，EBV和CMV的定量检测试剂盒，但是一次只能检测一种病毒，存在明显的使用局限性，郑之北等学者[6]报道可以使用PCR-基因芯片的方法同时检测HHV1-6型疱疹病毒，但是检测成本高，目前仍未得到推广，因此本研究试图建立一种具有可行性的多重PCR方法来同时检测八种疱疹病毒。2.材料和方法2.1样本来源从苏州大学附属第一医院血液科随机收集造血干细胞移植患者的外周血标本200份，采用Lab-Aid824核酸提取Mini试剂抽取疱疹病毒全基因组DNA，并置于-40℃冰箱保存备用。Lab-Aid824核酸提取Mini试剂抽取病毒DNA方法如下：（1）打开Lab-Aid824核酸提取仪电源，仪器启动后，仪器控制屏出现初始界面。（2）将试剂条在桌面上轻轻磕碰，使各试剂落入管底，然后从核酸提取仪中取出试管条架，将试剂条放在试管条架上，撕去封管膜。（3）在各试剂条的左边第一孔中加入待处理全血样本200uL和30uLDTT溶液。（4）将试管条架放入仪器中，向里至推不动为止，向下使试管条架紧贴试管条架轨道下壁。然后将磁棒套插入，将磁棒套卡到位。（5）根据程序选择引导界面，选择实验运行程序“NA-DNA-1”后，点“开始”运行程序，仪器自动提取。（6）程序运行完成后，取出试管条架，在各试剂条的左边起第9孔是洗脱的DNA，用移液器取出，放入离心管中。7 第一部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染（7）使用紫外分光光度计测定DNA浓度，并置于-40℃冰箱保存备用。2.2主要仪器及试剂2.2.1主要试剂Lab-Aid824核酸提取Mini试剂：厦门致善生物科技公司TaqDNA聚合酶：美国Fermantus公司MLV逆转录酶：美国Fermantus公司2×Mix：QuantiFast公司缓冲液ATL：厦门致善生物科技公司洗脱液：厦门致善生物科技公司DTT溶液：厦门致善生物科技公司2.2.2主要仪器超纯水系统：法国Milipore公司电子分析天平和PH计：美国Mettler公司-40℃低温冰箱：青岛海尔集团公司微量取样枪：德国Eppendorf公司超净工作台：苏州净化设备一厂低温高速离心机：美国Beckman公司PCR扩增仪（ABI7500）：美国ABI公司超声波清洗仪：海门其林贝尔公司微型离心机：海门其林贝尔公司Lab-Aid824核酸提取仪：厦门致善生物科技公司试管条架：厦门致善生物科技公司漩涡器：AOSHENG公司低速自动平衡离心机：北京医用离心机厂生物安全柜：青岛海尔公司紫外分光光度计：美国Thermo公司2.3方法2.3.1八种疱疹病毒DNA保守序列的比对和筛选8 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第一部分通过NCBI数据库下的Nucleotide数据库，分别找到HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，CMV，HHV-6，HHV-7和HHV-8的保守序列。八种人类疱疹病毒的部分保守序列见表1。9 第一部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染表1.八种人类疱疹病毒的部分保守序列病毒病毒病毒保守序列病毒保守序列名称名称2821atcctctactcggtcctccagcacctcgcccccaggctacctgacggggggcacgacggg181cagcttgcctccccaccgggtccatcaggccggccggagggaccccggcggcccggtgtc2881cccccgtagtcccgccatgcgccagggcgccgcgcgggggtgccggtggttcgtcgtatg241agtcccccctgcagccgcccagtctctgcctccaggcaagggcgccagcttttctcccccHSV-12941ggcgctcttggggttgacgctgggggtcctggtggcgtcggcggctccgagttcccccggCMV301cagcctgaggcccaggctcctgtgcactgtctgtaaagtccagcctcccacgcccgtcca3181cctgcgcgagcacctgcgggacatcaaggcggagaacaccgatgcaaacttttacgtgtg361cggctcccgggcccagccccgtccacccctccccacggtggacaggccctctgtccaccc3361gtacaagttcaaggccaccatgtactacaaagacgtcaccgtttcgcaggtgtggttcgg421gggccatccccgcccccctgtgtccaccccagtcccgtccaggggggactttatgtgacc1561cctgctgacgacccccaagtttaccgtggcctgggactgggtgccgaagcgaccggcggt95461aaatatcgatgccgctctggataatttggctttgtcgtttgcgaacaaaaaatcaaaaaa1621ctgcaccatgaccaagtggcaggaggtggacgagatgctccgcgccgagtacggcggctc95521gatggctagaacgtatttgctgcagaacgtttcgcggactcaagatcaacaagttgccatHSV-21681cttccgcttctcctccgacgccatctcgaccaccttcaccaccaacctgaccgagtactcHHV-695581ttcggggacgtacattttatatacaaaaaaacacattgaaacgtctttgatgctcgataa1741gctctcgcgcgtcgacctgggcgactgcatcggccgggatgcccgcgaggccatcgaccg95641gacgaagttagttaaacaaattcttgagtatgccgagacccctaatctgttagggtatac1801catgtttgcgcgcaagtacaacgccacgcacatcaaggtgggccagccgcagtactacca95701cgatgtgcgtgatcttgaatgtttactttggttggtgttctgtggccctaaaagtttttg601atgataacacaaaatgatgcaacgttaaatggagacaagaacgcttttcatggtacctcg361acctagacaaaatgtcactgggaaaaattctgttttatatacaattacctagagtcgcta661tttaaaagcgcatctccagaaagctttcgcgttgaggttattgagcgcacagatgtttat421caggaaacgacgtaactgcgcctaaagaaacaaccgtactggttaccaagtattcagaaaVZV721tactacgatacacagccatgtgcgttttacagggtgtattctccctcatctaaatttacaHHV-7481agcatcctatcaatatatcgtttgaattaagtgctgcttgtttagcgcatttagaaaaca781aattatctttgtgataactttcacccggagttgaaaaagtatgaaggtcgggtagacgct541cctttaaaaacacaatttttgatgaaatgctcaacatgaatgcgattcatacggtgttac841accactcgttttctaatggataatcccggctttgttagttttggttggtatcaactaaaa661ctattcttaagaaggcaccgccacagttactgaaaaccatgttagaaaacaaagtcaaca78061agttgcacacggccgacggtggtttccgcgccctcttctttgccggctctcctcctctcc361ccgtgccttcgaggccaggccctgcatccggcaccacgcccgggggccaggactcactgg78661tgccgatgtaacgtttcttgcagatcatcataagagagacgaagaccttttcaaactcca421gggtctcgggaagcagtataaccaccctgtcctctggtccccattcattgtcgccggcgtEBV78901ccggtaacgcgctgctctcctccgaatccccctcccgcgttcccactacatagtcttcctaHHV-8481cagacattctcacaaccctctcatccacgacggaaacggccgcccccgcggtggccgacg78481cgccgtacttcttgacttcatcgagtgagaggcgcgacaggcgcacggctgcttccgaga541cgaggaaacccccctctggcaaaaagaaataggcaacgattggacaaccgtggagtcaca78901ccggtaacgcgctgctctcctccgaatccccctcccgcgttcccactacatagtcttcct601agtaccacttctttattctgtcaaccgtctccgccagggacgccgatagggcggccactt10 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第一部分2.3.2八种人类疱疹病毒引物探针的设计根据以上的保守序列用Primerexpress软件设计八种人类疱疹病毒的引物探针，具体见表2。表2.八种人类疱疹病毒引物及探针序列VirusPrimersequenceProbesequence(5'-3')HSV-1F:5’-CCTYCTCAGCAACACGCTC-3’P:FAM-ACACCTCCGAGAGCAGAGCCGCA-BHQ1R:5’-GAGGAGGTGGTCTTGATGC-3’HSV-2F:5’-GGTCACCAACATGGTTCTG-3’P:ROX-ACTCTCCGCTCCACAACGAGGAC-BHQ2R:5’-ATACACAAGCCCAGCTCCC-3’VZVF:5’-CGAGCTTAGTCGTCCACC-3’P:CY5-ACCGTCGCTTGGCTCACTTAACAG-BHQ1R:5’-GATTTGACCCTGTCTCATTAC-3’EBVF:5’-CTACACCTCGCTGCTRGAC-3’P:FAM-TCCYTGCCCYAACCACTACAGCAAAG-BHQ1R:5’-GACATCTGAAACATRGCCGC-3’CMVF:5’-ACTGAGGAGGGCATGAAGC-3’P:JOY-TCCCACCCAGACTAGCCCCCAGG-BHQ2R:5’-GAAGAGGAGGTGGTAAGCG-3’HHV-6F:5’-AGTAAGACGGGATATAATGCC-3’P:ROX-TGCCTCCGTATCTKTACGAATGC-BHQ2R:5’-TACACATCTGTGACGCTACC-3’HHV-7F:5’-TCGGAACTCCTAATACGATTC-3’P:CY5-ACGCCCTATCGCAACACATTTCAC-BHQ1R:5’-TGCCATAAGAAACAGGTACAG-3’HHV-8F:5’-ACGCCCTATCGCAACACATTTCAC-3’P:JOE-TCGCTCCTGGATMACGGGGTCTC-BHQ2R:5’-GGGAAGTGTTCCTSCTGAG-3’2.3.3PCR反应体系及条件的优化（1）八种人类疱疹病毒的引物探针由上海生工生物科技有限公司（中国）合成。同时由上海生工生物科技有限公司分别合成八种疱疹病毒的一段DNA保守序列，并将整个DNA序列整合到pGEMEX-1载体中。经转入大肠杆菌扩增后提取质粒得到的DNA纯化后用紫外分光光度计检测浓度拷贝数。拷贝数的计算公式如下：N×总体积×6.02×1023650×碱基11 第一部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染（2）将质粒DNA分别稀释成拷贝数为1×105、1×104、1×103的溶液作为质控品，用于引物探针的验证和PCR反应体系及条件的优化。（3）本研究中单一PCR检测采用25ul反应体系。反应体系见表3。表3.单一PCR反应体系反应体系用量（ul）Mix12.5上游引物1下游引物1探针0.5水5模板5（4）本研究中多重PCR方法采用25ul反应体系。反应体系见表4。表4.多重PCR反应体系反应体系用量（uL）Mix12.5上游引物0.5下游引物0.5探针0.25水2.5模板5（5）首先采用普通的反应条件进行扩增，即预变性设定为95℃5min共1个循环，变性95℃15s和退火延伸60℃45s共45个循环。通过调整引物探针的浓度和退火温度对PCR反应体系及条件进行优化。然后用1×104拷贝数的质控品检测，并观察扩增曲线。2.3.4多重PCR方法特异性和敏感度的检验（1）特异性的检验：HSV-1、HSV-2、EBV和CMV四种疱疹病毒，因为存在有临床注册的产品，所以将这四种疱疹病毒的阳性结果与目前已有的单一疱疹病毒试剂盒进行比对。而VZV、HHV-6、HHV-7和HHV-8四种疱疹病毒现无临床注册产品，将其测得的阳性样本进行一代测序，测序的结果与疱疹病毒的基因序列进行比对。12 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第一部分（2）敏感度的检验：分别检测拷贝数为1×105、1×104及1×103的质控品，观察并记录扩增曲线与Ct值。2.3.5一代测序验证检测到的阳性标本经过多重PCR方法扩增，阳性表达的样本通过一代测序的方法进一步验证。一代测序由上海生工生物科技有限公司完成。2.4统计学分析采用Student-Newman-Keulsa,,b检验分析数据，GraphPadPrism5软件（GraphPadSoftwareInc.）作统计分析并绘图。P<0.05认为差异具有统计学意义。3.结果3.1引物探针可行性检验选取拷贝数为1x104的质控品，采用普通的PCR反应体系和条件对合成的引物探针进行检测。即预变性设定为95℃5min共1个循环，变性95℃15s和退火延伸60℃45s共45个循环。检测结果显示，八种人类疱疹病毒的引物探针对质控品的反应均为阳性，但由于采用普通的PCR反应体系和条件，整体扩增效率较低，需要进一步优化。检测结果见图1。HSV-1HSV-2VZVCMVEBVHHV-6HHV-7HHV-8图1.未优化的PCR反应体系及条件对疱疹病毒1-8型检测的相应质控品图谱13 第一部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染3.2PCR反应体系及条件的优化从图1可以看出，普通的PCR反应体系及条件整体扩增效率低，需进一步优化。主要从以下几点对其进行优化：1.Taq酶的浓度；2.引物的浓度；3.探针的浓度；4.延伸反应的温度；5.延伸反应的时间。HSV-1、EBV和CMV三种疱疹病毒将延伸温度由60℃提升至65℃（图2A，D，E）；HSV-2和HHV-6则由60℃提升至62℃（图B和F），其他反应条件不变。其余的疱疹病毒将探针浓度由0.5uL提升至0.75uL。然后用1x104拷贝数的质控品进行检测。检测结果显示：通过优化，PCR反应的扩增效率有了明显提升。检测结果见图2。HSV-1HSV-2VZVCMVEBVHHV-6HHV-7HHV-8图2.通过优化PCR反应体系及条件后对疱疹病毒1-8型检测的相应质控品图谱3.3多重PCR方法及其优化本研究将HSV-1、HSV-2、VZV、CMV四种疱疹病毒联合检测，EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8四种疱疹病毒作为另外一组联合检测。采用普通的反应体系和条件进行检测，检测结果见图3A和图3C。从图3A可以看到，VZV和CMV的扩增效率明显偏低，可能是四种引物探针对酶的竞争所致。因此本体系中，将VZV和CMV探针的浓度从0.25uL提高至0.5uL，再次进行检测，显示扩增效率明显提升（图3B）。对于EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8四种病毒的反应体系和条件，图3C显示扩增效率可，本研究只将EBV探针的浓度由0.25uL降至0.2uL，检测结果见图3D。综上所述，通过优化多重PCR反应体系中的探针浓度，能够提高多重PCR方法的扩增效率。14 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第一部分未优化的多重PCR方法检测图谱优化后的多重PCR方法检测图谱HSV-1、HSV-2、VZV、CMVHSV-1、HSV-2、VZV、CMVEBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8图3.HSV-1、HSV-2、VZV、CMV四种病毒联合检测及EBV、HHV-6、HHV-7、HHV-8四种病毒联合检测的图谱3.4多重PCR方法特异性的检验（1）HSV-1、HSV-2、EBV和CMV四种疱疹病毒已在临床上广泛检测，且目前已有取得中国食品药品监督管理局认证的单一疱疹病毒检测试剂盒。因此，对于这四种疱疹病毒特异性的检验，本研究采用与目前已有的单一疱疹病毒检测试剂盒进行比对。研究结果显示：两种方法对此四种疱疹病毒的检测结果无统计学差异（P>0.05）具体见表5-8。检测结果见图4。表5.多重PCR方法与单一疱疹病毒检测试剂盒结果(HSV-1)单一疱疹病毒检测试剂盒HSV-1+－P=1.0+11多重PCR－2196表6.多重PCR方法与单一疱疹病毒检测试剂盒结果(HSV-2）单一疱疹病毒检测试剂盒HSV-2+－P=1.0+21多重PCR－219515 第一部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染表7.多重PCR方法与单一疱疹病毒检测试剂盒结果(EBV)单一疱疹病毒检测试剂盒EBV+－P=0.8+401多重PCR－3156表8.多重PCR方法与单一疱疹病毒检测试剂盒结果(CMV)单一疱疹病毒检测试剂盒CMV+－P=0.9+352多重PCR－1162（2）200份样本中VZV检出20份，HHV-6检测10份，HHV-7检出4份，HHV-8检测2份。目前国际上暂没有VZV、HHV-6、HHV-7和HHV-8四种疱疹病毒的标准品，因此本研究采用一代测序的方法对这四种疱疹病毒进行特异性检验。对用多重PCR方法检测为阳性的所有样本均进行一代测序。委托上海生工生物科技有限公司进行一代测序比对。检测结果见图5和图6。3.5多重PCR方法敏感度的检验为了进一步检验多重PCR方法的敏感度，本研究又用1x103和1x105拷贝数的质控品进行检测。检测结果见图7。16 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第一部分本研究中的多重PCR方法单一疱疹病毒检测试剂盒HSV-1HSV-1HSV-2HSV-2EBVEBVCMVCMV图4.多重PCR方法与单一疱疹病毒检测试剂盒VZVHHV-6HHV-7HHV-8图5.多重PCR方法检测的四种疱疹病毒阳性样本17 第一部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染HHV-6VZVHHV-8HHV-7图6.四种疱疹病毒阳性样本的一代测序结果HSV-1HSV-2VZVCMVEBVHHV-6HHV-7HHV-8图7.八种疱疹病毒1x105、1x104和1x103拷贝数的质控品的扩增曲线4.讨论人类疱疹病毒是常见的感染病原体，目前认为包括HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，CMV，HHV-6，HHV-7和HHV-8八种疱疹病毒。现临床采用的检测方法有病毒培养，抗体检测，病毒抗原等。病毒培养所需时间久，耗时长，敏感度低，且标本的稳定性差，很难应用于临床。血清学诊断方法因其敏感性及特异性低，不宜用于早期诊断[7,8,9]。PCR方法检测病毒DNA负荷量因灵敏度及特异度高，近年来广泛应用于病毒感染的18 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第一部分检测以及抗病毒治疗效果的评价。但普通PCR方法，难以在一种体系内对多种病毒同时进行检测[10,11]。PCR-核酸分子杂交，PCR-限制性内切酶片段长度多态性分析等技术也都被用于多种疱疹病毒的检测，但因为存在自动化程度低、操作繁琐费时等原因，使其在临床的常规使用受到限制[12,13,14,15]。目前临床上已有单一的HHV1-2，EBV和CMV的定量检测试剂盒，这些试剂盒的敏感度和特异性都达到90%以上，在很多医疗中心广泛应用。VZV，HHV-6，HHV-7和HHV-8目前均无统一的国际标准品，故现尚无定量检测试剂盒。相关研究表明，可以利用不同的荧光色素对多种病毒同时进行检测即多重PCR方法[16,17,18,19]。但目前对可以同时检测八种疱疹病毒的多重PCR方法报道较少，因此有必要建立一种高效可行的早期诊断方法如多重PCR方法来检测八种人类疱疹病毒。本研究中，我们通过NCBI数据库找到八种人类疱疹病毒的保守序列，基于这些保守序列，运用Primerexpress软件进行疱疹病毒引物探针的设计，将设计好的引物探针进行可行性验证，经过对PCR反应体系和条件的优化，建立能同时扩增八种疱疹病毒的多重PCR方法。使用该方法对八种疱疹病毒同时进行扩增，HSV-1、HSV-2、EBV和CMV四种疱疹病毒，多重PCR方法检测结果与已有的单一疱疹病毒检测试剂盒进行比对，显示两种检测方法无明显差异。VZV、HHV-6、HHV-7和HHV-8四种疱疹病毒，多重PCR方法扩增的阳性样本产物进一步行一代测序检测，经过序列比对显示扩增序列为此四种疱疹病毒的序列，表明多重PCR方法特异性强。将合成的质粒DNA分别稀释成1x105、1x104和1x103拷贝数作为质控品进行敏感度检验，检测结果显示多重PCR方法可以检测出低于1x103的样本，HSV-1的Ct值约为37，其他的约为39，所以本研究设定拷贝数为1x103以上的样本即为阳性样本，敏感度高。本研究建立的多重PCR方法可在一次实验中对八种人类疱疹病毒同时进行检测，具有高效，简便，经济等优点。多重PCR方法的另一重要优点是能够简便的检出多种疱疹病毒感染，为后续多种疱疹病毒感染的研究提供重要的实验学方法。本研究建立的多重PCR方法对疱疹病毒的检测具有重要意义，但仅仅只能对八种人类疱疹病毒进行初步筛选，局限于定性检测的阶段，且VZV、HHV-6、HHV-7和HHV-8四种疱疹病毒国际上暂无统一的标准品，在参考值的制定上存在一定的分歧，各中心的参考值不一致，有待于多中心、大样本的实验进一步深入研究。综上所述，本研究建立的多重PCR方法，可同时扩增并鉴别八种人类疱疹病毒，且快速简捷，敏感特异，为后续多种疱疹病毒感染的研究提供重要的实验学方法。19 第一部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染参考文献1.LjungmanP,BregniM,BruneM,etal.Allogeneicandautologoustransplantationforhaematologicaldiseases,solidtumoursandimmunedisorders:currentpracticeinEurope2009[J].Bonemarrowtransplantation,2010,45(2):219-234.2.ZallioF,PrimonV,TamiazzoS,etal.Epstein-Barrvirusreactivationinallogeneicstemcelltransplantationishighlyrelatedtocytomegalovirusreactivation[J].ClinicalTransplantation,2013,27(4):E491-497.3.dePagterPJ,SchuurmanR,VisscherH,etal.Humanherpesvirus6plasmaDNApositivityafterhematopoieticstemcelltransplantationinchildren:animportantriskfactorforclinicaloutcome.[J].BiologyofBlood&MarrowTransplantationJournaloftheAmericanSocietyforBlood&MarrowTransplantation,2008,14(7):831-839.4.PapadopoulouA,GerdemannU,KatariUL,etal.Activityofbroad-spectrumTcellsastreatmentforAdV,EBV,CMV,BKV,andHHV6infectionsafterHSCT[J].Sciencetranslationalmedicine,2014,6(242):242ra83.5.TanakaN,KimuraH,HoshinoY,etal.Monitoringfourherpesvirusesinunrelatedcordbloodtransplantation[J].BoneMarrowTransplantation,2000,26(11):1193-1197.6.郑之北,俞锡林,尚世强.人疱疹病毒分子生物学诊断的研究进展[J].国际儿科学杂志,2007,34(1):31-34.7.WaldA,HuangML,CarrellD,etal.PolymeraseChainReactionforDetectionofHerpesSimplexVirus(HSV)DNAonMucosalSurfaces:ComparisonwithHSVIsolationinCellCulture[J].JournalofInfectiousDiseases,2003,188(9):1345-1351.8.MarchettiS,SantangeloR,ManzaraS,etal.Comparisonofreal-timePCRandpp65antigenassaysformonitoringthedevelopmentofCytomegalovirusdiseaseinrecipientsofsolidorganandbonemarrowtransplants.[J].NewMicrobiologicaOfficialJournaloftheItalianSocietyforMedicalVirology,2011,34(2):157-164.9.GregoireSM,VanPV,GoffetteS,etal.Polymerasechainreactionanalysisandoligoclonalantibodyinthecerebrospinalfluidfrom34patientswithvaricella-zostervirusinfectionofthenervoussystem.[J].JNeurolNeurosurgPsychiatry,2006,77(8):938-942.10.StriebelHM,BirchhirschfeldE,EgererR,etal.Virusdiagnosticsonmicroarrays.[J].CurrentPharmaceuticalBiotechnology,2003,4(6):401-415.20 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第一部分11.AberleSW,AberleJH,SteiningerC.QuantitativerealtimePCRdetectionofVaricella-zostervirusDNAincerebrospinalfluidinpatientswithneurologicaldisease[J].Medicalmicrobiologyandimmunology,2005,194(1-2):7-12.12.HudnallSD,ChenT.SpeciesidentificationofalleighthumanherpesviruseswithasinglenestedPCRassay[J].Journalofvirologicalmethods,2004,116(1):19-26.13.TafreshiNK,SadeghizadehM,Amini-Bavil-OlyaeeS,etal.DevelopmentofamultiplexnestedconsensusPCRfordetectionandidentificationofmajorhumanherpesvirusesinCNSinfections[J].JournalofClinicalVirologytheOfficialPublicationofthePanAmericanSocietyforClinicalVirology,2005,32(4):318-324.14.董关萍,尚世强,杜立中,等.婴儿血中四种疱疹类病毒DNA及特异性IgM抗体检测[J].中华儿科杂志,2004,42(5):367-370.15.FujimuroM,NakasoK,NakashimaK,etal.MultiplexPCR-basedDNAarrayforsimultaneousdetectionofthreehumanherpesviruses,EVB,CMVandKSHV.[J].Experimental&MolecularPathology,2006,80(2):124-131.16.AdelsonME,FeolaM,TramaJ,etal.Simultaneousdetectionofherpessimplexvirustypes1and2byreal-timePCRandPyrosequencing.[J].JournalofClinicalVirology,2005,33(1):25-34.17.PradeauK,CoutyL,SzelagJC,etal.Multiplexreal-timePCRassayforsimultaneousquantitationofhumancytomegalovirusandherpesvirus-6inpolymorphonuclearandmononuclearcellsoftransplantrecipients[J].JournalofVirologicalMethods,2006,132(1-2):77-84.18.TempletonKE,ScheltingaSA,BeersmaMF,etal.Rapidandsensitivemethodusingmultiplexreal-timePCRfordiagnosisofinfectionsbyinfluenzaaandinfluenzaBviruses,respiratorysyncytialvirus,andparainfluenzaviruses1,2,3,and4[J].Journalofclinicalmicrobiology,2004,42(4):1564-1569.19.TraversoM,MalnatiM,MinettiC,etal.Multiplexreal-timePCRfordetectionofdeletionsandduplicationsindystrophingene[J].Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications,2006,339(1):145-150.21 第二部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第二部分造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染的临床研究1.引言造血干细胞移植是治疗血液系统疾病的有效方法，但造血干细胞移植术后的病毒感染一直是影响移植成功和移植受者预后的重要因素，其中人类疱疹病毒（Humanherpesvirus，HHV）是主要的感染病原体[1,2,3,4]。目前国内外对于HSCT患者疱疹病毒感染暂没有统一的诊断标准，PCR方法检测病毒DNA负荷量因其灵敏度及特异度高，近年来广泛应用于病毒活动性感染的检测以及抗病毒治疗效果的评价。CMV感染和EBV感染及其相关并发症是影响造血干细胞移植患者预后的重要原因，因此对CMV感染和EBV感染的研究较多且较深入，但对于多种疱疹病毒感染的研究鲜有报道。本研究中，我们应用建立的多重PCR方法同时检测八种人类疱疹病毒，分析造血干细胞移植90天内八种疱疹病毒的感染状况，并探讨造血干细胞移植患者多种疱疹病毒感染与临床因素的相关性及其对移植后并发症和预后的影响。2.病例和方法2.1病例资料选自苏州大学附属第一医院血液科2017年2月至2017年8月期间行造血干细胞移植的患者90例。其中男性53例，女性37例，中位年龄29.5（9～51）岁。急性髓细胞白血病（AML）39例，急性淋巴细胞白血病(ALL)22例，淋巴瘤(Lymphoma)6例，骨髓增生异常综合征（MDS）13例，再生障碍性贫血（AA）8例，骨髓纤维化1例，阵发性睡眠性血红蛋白尿（PNH）1例。90例患者中HLA全相合移植24例，HLA不全相合移植66例。采用骨髓（BM）造血干细胞移植11例，外周血（PB）造血干细胞移植24例，BM联合PB造血干细胞移植55例。患者的临床资料见表1。90例患者诊断均符合张之南等主编的《血液病诊断疗效与标准》，均经骨髓形态学、免疫学、分子生物学、细胞遗传学等确诊。22 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第二部分表1.90例造血干细胞移植患者的临床资料CharacteristicsCasesSexMale53Female37Age(yearsold)（Median，Range）29.5(9-51)DiseaseAML39ALL22Lymphoma6MDS13AA8Other2StatusCR69PR/NR21ConditioningBu/Cy81Other9ATGUse78Notuse12SourceBM11PBS24BMandPBS55HLAmatchYes24No66ABOMatch51Mismatch39Donor/RecipientsexMatch47Mismatch43DonorsexMYes64No26MaletofemaleYes27No6323 第二部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染2.2主要仪器及试剂（1）主要试剂Lab-Aid824核酸提取Mini试剂：厦门致善生物科技公司TaqDNA聚合酶：美国Fermantus公司MLV逆转录酶：美国Fermantus公司2×Mix：QuantiFast公司缓冲液ATL：厦门致善生物科技公司洗脱液：厦门致善生物科技公司DTT溶液：厦门致善生物科技公司PCR引物探针：应用PrimerExpress设计引物探针，并由上海生工生物科技有限公司负责合成。（2）主要仪器超纯水系统：法国Milipore公司电子分析天平和PH计：美国Mettler公司-40℃低温冰箱：青岛海尔集团公司微量取样枪：德国Eppendorf公司超净工作台：苏州净化设备一厂低温高速离心机：美国Beckman公司PCR扩增仪（ABI7500）：美国ABI公司超声波清洗仪：海门其林贝尔公司微型离心机：海门其林贝尔公司Lab-Aid824核酸提取仪：厦门致善生物科技公司试管条架：厦门致善生物科技公司漩涡器：AOSHENG公司低速自动平衡离心机：北京医用离心机厂生物安全柜：青岛海尔公司紫外分光光度计：美国Thermo公司24 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第二部分2.3实验方法2.3.1样本收集从预处理前收集90例患者EDTA抗凝的外周血标本每周一次直至移植后30天，之后2周一次至移植后90天，标本量约5ml。2.3.2DNA提取方法同第一部分。2.3.3多重PCR反应体系及条件同第一部分。2.4移植预处理方案：（1）改良Bu/Cy方案：HLA相合同胞供者HSCT主要采用此方案，具体用法为：阿糖胞苷（Ara-c）2g/m2每12小时一次，移植前第9～8天（-9天～-8天）静脉输注；白消安（Bu）3.2mg/kg/天，-7天～-5天静脉输注；环磷酰胺（Cy）1.8g/m2/天，-4天～-3天静脉输注。（2）TBI/Cy方案：ALL或者合并中枢神经系统白血病（CNSL）的患者主要采用此方案，具体用法为：Ara-c2g/m2每12小时一次，-6天～-5天静脉输注；Cy1.8g/m2/天，-4天～-3天静脉输注；TBI750～850cGy，-l天。（3）其他非清髓性方案：（司莫司汀）Me-CCNU250mg/m2，每天一次，-10天；氟达拉滨(Flu)30mg/m2每天一次，-10天～-6天静脉输注；Ara-C1.5g/m2每天一次，-10天～-6天静脉输注；Bu0.8mg/kg，每天四次，-5天～-3天静脉输注。2.5移植后造血重建：中性粒细胞数连续3天＞0.5×109/L为粒系造血重建。在不输注血小板的情况下，血小板计数连续3天＞20×109/L为巨核系造血重建。2.6GVHD的预防和治疗：HLA相合同胞供者HSCT采用环孢素（CSA）+短程甲氨蝶呤（MTX）方案预防aGVHD，HLA相合无关供者或单倍型HSCT采用CSA+短程MTX+霉酚酸酯（MMF）+抗人胸腺细胞球蛋白（ATG）预防aGVHD。依据临床常用的西雅图诊断标准[5]进行aGVHD的诊断和分级。一线治疗采用甲强龙1-2mg/(kg·d)，治疗无效的患者可给予二线药物抗CD25单抗、TNF-α单抗等治疗。25 第二部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染2..7HSCT患者疱疹病毒的预防和治疗：预处理-9天开始使用更昔洛韦10mg/(kg·d)进行预防，在移植前2天停用，之后静脉输注阿昔洛韦预防，如未发生病毒血症或者病毒感染的临床表现，阿昔洛韦用至移植后1年。若检测发现HSV感染，予以无环鸟苷10mg/kg，每8小时一次，静脉输注，至3天内无新的疱疹出现，后改为无环鸟苷片0.2g～0.4g，一天四次，口服2周。若检测发现EBV感染，更昔洛韦5mg/kg，每12小时一次，静脉输注，至EBV-DNA连续2次阴性，必要时可加用利妥昔单抗375mg・m-2・w-1×2～4次治疗。当检测发现CMV感染，即予更昔洛韦（5mg/kg，每12小时一次）抢先治疗，当病毒转阴，可考虑维持量更昔洛韦（5mg/kg，每天一次）继续治疗，抗病毒治疗至少维持至两次CMV检测转阴。CMV肺炎患者加用静脉免疫球蛋白(IVIG)冲击治疗。2.8统计学分析数据统计采用SPSS16.0统计分析，Kaplan-Meier用于计算总体生存（OS）率，移植后复发率，无疾病进展生存（PFS）率，移植后非复发死亡（NRM）率，采用Log-rank检验比较差异的显著性。采用相关性分析进行有关统计。多因素分析应用logistic回归模型。以P=0.05为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。使用GraphpadPrim5.0软件做图。3.结果3.1患者的总体临床结果90例移植患者临床资料见表1。其中男53例，女37例，中位年龄为29.9（9～51）岁。至随访终点，中位随访时间为192（35～308）天，发生0-Ⅰ度aGVHD的患者有58例（64.4%），发生Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的患者有32例（35.6%）。粒系植入中位时间为12（8～23）天，巨核系植入中位时间为14（9～36）天。HSCT后患者的OS率为90.6%，移植后复发率为11.7%，PFS率为88.3%，NRM率为5.6%。具体见图1-4。26 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第二部分图1.移植后90例HSCT患者的总体生存率图2.移植后90例HSCT患者的复发率27 第二部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染图3.移植后90例HSCT患者的无疾病进展生存率图4.移植后90例HSCT患者的非复发死亡率3.2HSCT患者人类疱疹病毒的感染状况（1）造血干细胞移植前HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，CMV，HHV-6，HHV-7，HHV-8的样本检出率分别是20%（18/90），4.4%（4/90），3.3%（3/90），26.7%（24/90），28 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第二部分5.6%（5/90），4.4%（4/90），2.2%（2/90），3.3%（3/90），同时检出多种疱疹病毒的样本检出率为23.3%(21/90)。90例患者中，移植前疱疹病毒感染发生率为35.6%（32/90），其中1种疱疹病毒感染发生率为12.2%（11/90），多种疱疹病毒感染的发生率为23.3%(21/90)。（2）造血干细胞移植后90天内HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，CMV，HHV-6，HHV-7，HHV-8的样本检出率分别是12.4%（80/644），1.6%（10/644），1.7%（11/644），20.5%（132/644），17.4%（112/644），5.7%（37/644），2.2%（14/644），1.4%（9/644），同时检出2种病毒的样本检出率为8.3%（62/644），同时检出3种病毒的样本检出率为1.7%（11/644），相同样本未同时检测到4种疱疹病毒。90例患者中，移植后疱疹病毒感染发生率为77.8%（70/90），其中1种疱疹病毒感染发生率为20%（18/90），多种疱疹病毒感染的发生率为57.8%（52/90）。HSV-1，HSV-2，VZV，EBV，CMV，HHV-6，HHV-7，HHV-8的感染率分别是28.9%（26/90），5.6%（5/90），5.6%（5/90），50%（45/90），46.7%（42/90），14.4%（13/90），5.6%（5/90），6.7%（6/90）。其中30例患者移植前就存在该感染，移植后仍可检出，40例是移植后新检测的感染。移植后90天HSV-1首次感染的中位时间是7（7-56）天；EBV首次感染的中位时间是21（7-84）天；CMV首次感染的中位时间是28（7-84）天；HHV-6首次感染的中位时间是21（7-84）天。在多种疱疹病毒感染的患者中2种病毒感染的有30例（57.7%），以EBV和CMV混合感染最常见有13例（43.3%），其次是HSV-1和EBV混合感染有5例（16.7%）。3种疱疹病毒感染的有18例（34.6%），其中HSV-1，EBV和CMV混合感染最常见有7例（38.9%），4种疱疹病毒感染的有4例（7.7%），其中HSV-1，EBV，CMV和HHV-8混合感染有2例（50%）。3.3HSCT后人类疱疹病毒感染相关的临床表现及治疗转归34例患者出现病毒感染相关的临床症状，主要表现为出血性膀胱炎（HC）有27例，间质性肺炎的有3例，肠炎的有2例，病毒性脑炎的有3例，不明原因发热的有3例。27例HC患者中，有2例合并有间质性肺炎，1例合并有病毒性脑炎，1例合并有不明原因发热。27例HC患者中有20例患者检出疱疹病毒感染，其中4例检出单一病毒感染，16例检出多种病毒感染，以EBV和CMV混合感染最常见，大部分患者在抗病毒治疗后1-2周内病毒转阴；发生间质性肺炎的3例患者均检出多种疱疹29 第二部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染病毒感染，其中2例为EBV和CMV混合感染，1例为HSV-1、EBV、CMV和HHV-8混合感染，3例患者在抗病毒治疗2周后病毒转阴；发生肠炎的2例患者也均检出多种疱疹病毒感染，为HSV-1、HHV-6、CMV和HHV-7混合感染及HSV-1和HHV-6混合感染，2例患者在抗病毒治疗后2周内转阴；3例病毒性脑炎的患者中，2例检出疱疹病毒感染，1例为HSV-1和EBV混合感染，另一例为HSV-2、EBV和HHV-8混合感染，2例患者在抗病毒治疗3周后转阴；3例不明原因发热的患者中，2例检出疱疹病毒感染，一例为HSV-1感染，另一例为EBV感染，2例患者均在抗病毒治疗后1周内转阴。其他未出现临床症状仅表现为病毒血症的患者，我们定期对疱疹病毒进行检测，同时在临床工作中密切关注患者的情况。3.4影响多种疱疹病毒感染的相关因素分析我们分析了HSCT后八种疱疹病毒间发生感染的相关性，结果显示HSV-1和HSV-2两种病毒感染存在相关性（r=-0.279，P=0.046）；HHV-6和HHV-7两种病毒感染也存在相关性（r=0.381，P=0.007）。其他疱疹病毒未见相关性（见表2）。分析了患者的年龄，性别，疾病类型，发病时间等临床因素与移植前八种疱疹病毒感染的相关性，结果显示移植前患者的年龄与HSV-1感染的发生具有一定的相关性（r=0.44，P=0.035），在移植前其他单一疱疹病毒感染和多种疱疹病毒感染均未统计出与临床因素存在明显相关性（P>0.05）。分析了供受体年龄，性别，血型，HLA配型，受体疾病类型，预处理方式，II-IV度aGVHD等因素与移植后疱疹病毒感染的相关性，单一疱疹病毒感染未见与临床因素存在相关性，≥2种疱疹病毒感染与HLA不全相合（P=0.003），使用ATG（P=0.048）和II-IV度aGVHD（P=0.022）均呈正相关。多因素分析显示HLA不全相合（P=0.003，OR=7.572，95%CI：2.029-28.255）和II-IV度aGVHD（P=0.016，OR=6.415，95%CI：1.422-29.264）是≥2种疱疹病毒感染发生的独立危险因素。30 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第二部分表2.八种疱疹病毒间发生感染的相关性HSV-1HSV-2VZVEBVCMVHHV-6HHV-7VirusP值r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值r值P值r值HSV-1HSV-20.046-0.279VZV0.913-0.0150.4120.115EBV0.336-0.1350.42-0.1130.42-0.113CMV0.688-0.0560.109-0.2240.566-0.080.221-0.172HHV-60.071-0.2530.228-0.1690.948-0.0090.081-0.2450.175-0.19HHV-70.47-0.1010.501-0.0940.501-0.0940.17-0.3330.336-0.1350.0070.381HHV-80.9750.0040.6550.0620.6550.0620.816-0.0330.9860.0020.636-0.0660.416-0.1143.5HSCT后多种疱疹病毒感染对临床结果的影响我们分析了移植后常见单一疱疹病毒感染（HSV-1、EBV、CMV、HHV-6）和≥2种疱疹病毒感染对移植后植入，II-IV度aGVHD，复发，NRM，PFS和OS的影响。在我们的研究样本中，90例患者的粒系和巨核系均植入，未观察到任何疱疹病毒感染影响移植后植入。我们研究发现伴有HHV-6感染（P=0.006）和≥2种疱疹病毒感染（P=0.028）均可增加II-IV度aGVHD发生率（见图5-6），其他常见单一疱疹病毒感染未见对aGVHD有影响。我们也未发现其他常见单一疱疹病毒感染及多种疱疹病毒感染对复发，生存等的影响。图5.伴有HHV-6感染对II-IV度aGVHD发生的影响31 第二部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染图6.≥2种疱疹病毒感染对II-IV度aGVHD发生的影响4.讨论人类疱疹病毒感染是HSCT后常见的移植相关并发症和主要死亡原因之一[1,6,7]，及时、有效的检测可以在早期发现病毒感染，从而采取积极的治疗措施，阻止其进展为严重的疾病，提高患者的生存质量，改善患者的预后。相关文献报道[8,9,10,11,12]EBV感染率为8.8%～58.8%，CMV感染率为32%～45.4%。本研究发现EBV和CMV感染率分别为50%和46.7%，与其一致。HHV-6感染率与JUN等[13]报道的相仿，但明显低于OgataM等[14]报道。值得注意的是本研究中的研究对象大部分是成年人，而OgataM等报道较高的HHV-6感染率的研究对象都是儿童。在本研究中VZV的感染率较低，可能与目前我国水痘减毒活疫苗的广泛使用有关，水痘减毒活疫苗的接种可在机体中建立免疫屏障，降低感染的发生。OlkinuoraH报道[15]在儿童移植中多种疱疹病毒感染的发生率为35%，低于本研究中多种疱疹病毒感染的发生率，同样可能与研究群体不同有关，但本研究中多种疱疹病毒感染的发生率与HillJA[16]报道的基本一致。另外本研究数据显示HSV-1和HSV-2两种病毒感染具有相关性，HSV-1和HSV-2共属于单纯疱疹病毒，两种病毒在移植后病人中的报道相对较少，虽然本研究在移植前后均能够检测出两种病毒，但在移植早期未见明显的致死性并发症，可能与我们广泛应用阿昔洛韦长期预防有关。HHV-6和HHV-7感染也同样存在相关性，国[17]外文献报道HHV-7为缺陷病毒，和HHV-6感染存在一定的相关性。HC是移植后常见的泌尿系统疾病，发生率为7%～70%[18]。预处理相关药物的使用是急性型HC的主要原因。迟发型HC主要与病毒感染有关，多发生在移植后4周。HC的发生与尿多瘤病毒关系密切，目前认为尿多瘤病毒普遍存在于移植患者的尿液32 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第二部分中，在高拷贝数的情况下可能导致患者出现HC症状。多项研究[19,20,21]显示HC与CMV，HSV-1，HSV-2等疱疹病毒相关。本研究中，20例患者检出疱疹病毒感染，其中4例检出单一病毒感染，16例检出多种病毒感染，提示疱疹病毒感染可能与HC发生存在[22，23]一定的相关性。相关文献报道疱疹病毒感染可引起间质性肺炎，肠炎及病毒性脑炎等。本研究中出现间质性肺炎，肠炎，病毒性脑炎等的患者中均可检出疱疹病毒感染，但由于病例数较少，无法进行相关统计学分析。[24]国内学者通过对330例造血干细胞移植患者EBV和CMV共激活的研究发现EBV和CMV共激活组中HLA不全相合多见。本研究也发现多种疱疹病毒感染与HLA不全相合（P=0.003）呈正相关，与其报道相仿。除此之外，本研究也发现多种疱疹病毒感染与使用ATG(P=0.048)呈正相关，提示使用ATG可能增加多种疱疹病毒感染的发生。但是在多因素统计中，我们未发现使用ATG对病毒感染的影响，可能与本研究的样本数量偏小有关。aGVHD是造血干细胞移植后主要的并发症，严重影响HSCT患者的预[25,26][27]后。文献报道疱疹病毒感染与aGVHD具有相关性。国外学者发现HHV-6和HHV-7混合感染与aGVHD的发生具有相关性。本研究显示伴有HHV-6感染（P=0.006）和≥2种疱疹病毒感染（P=0.022）与Ⅱ-Ⅳ度aGVHD的发生具有正相关性，差异具有统计学[28,29]意义，与其报道相一致。国外文献报道aGVHD是多种病毒感染的危险因素，另外一些学者则认为病毒感染会促进aGVHD的发生。病毒感染与aGVHD之间的关系被认为可能是双向的，但具体机制并不明确，有待于进一步研究。本研究的生存分析未见多种疱疹病毒感染对OS，移植后复发，NRM等的影响，差异均无统计学意义（P>0.05）。在本研究中，至随访终点，中位随访时间为192（35～308）天，随访时间较短，不足一年，可能导致移植后期出现死亡，复发，移植非复发死亡等的患者并未纳入到研究中。同时这也是本研究的不足之处，在后续的研究中应延长随访时间，完善随访资料，进一步深入研究。综上所述，我们研究发现造血干细胞移植前后均存在一种和多种疱疹病毒感染；其中HSV-1和HSV-2，HHV-6和HHV-7病毒感染两两间存在一定的相关性；HLA不全相合和II-IV度aGVHD增加了≥2种疱疹病毒感染发生率，而伴有HHV-6感染和≥2种疱疹病毒感染可增加II-IV度aGVHD发生率。但我们仍需扩大样本量，延长随访时间，完善随访资料，从而对移植后的预后情况进一步深入研究。33 第二部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染参考文献1.LjungmanP,BregniM,BruneM,etal.Allogeneicandautologoustransplantationforhaematologicaldiseases,solidtumoursandimmunedisorders:currentpracticeinEurope2009[J].Bonemarrowtransplantation,2010,45(2):219-234.2.ZallioF,PrimonV,TamiazzoS,etal.Epstein-Barrvirusreactivationinallogeneicstemcelltransplantationishighlyrelatedtocytomegalovirusreactivation[J].ClinicalTransplantation,2013,27(4):E491-497.3.dePagterPJ,SchuurmanR,VisscherH,etal.Humanherpesvirus6plasmaDNApositivityafterhematopoieticstemcelltransplantationinchildren:animportantriskfactorforclinicaloutcome.[J].BiologyofBlood&MarrowTransplantationJournaloftheAmericanSocietyforBlood&MarrowTransplantation,2008,14(7):831-839.4.PapadopoulouA,GerdemannU,KatariUL,etal.Activityofbroad-spectrumTcellsastreatmentforAdV,EBV,CMV,BKV,andHHV6infectionsafterHSCT[J].Sciencetranslationalmedicine,2014,6(242):242ra83.5.StorbR,DeegHJ,FarewellV,etal.Marrowtransplantationforsevereaplasticanemia:methotrexatealonecomparedwithacombinationofmethotrexateandcyclosporineforpreventionofacutegraft-versus-hostdisease[J].Blood,1986,68(1):119-125.6.SullivanKM,WitherspoonRP,StorbR,etal.Prednisoneandazathioprinecomparedwithprednisoneandplacebofortreatmentofchronicgraft-v-hostdisease:prognosticinfluenceofprolongedthrombocytopeniaafterallogeneicmarrowtransplantation[J].Blood,1988,72(2):546-554.7.MalgorzataJaneczko,MonikaMielcarek,BlankaRybka,etal.ImmunerecoveryandtheriskofCMV/EBVreactivationinchildrenpostallogeneichaematopoieticstemcelltransplantation:[J].Central-EuropeanJournalofImmunology,2016,41(3):287-296.8.CohenJ,GandhiM,NaikP,etal.IncreasedincidenceofEBV-relateddiseasefollowingpaediatricstemcelltransplantationwithreduced-intensityconditioning[J].BritishJournalofHaematology,2005,129(2):229-239.9.InagakiJ,NoguchiM,KurauchiK,etal.EffectofCytomegalovirusReactivationonRelapseafterAllogeneicHematopoieticStemCellTransplantationinPediatricAcuteLeukemia[J].BiolBloodMarrowTransplant,2016,22(2):300-306.34 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染第二部分10.许兰平,刘代红,刘开彦,等.利妥昔单抗治疗异基因造血干细胞移植后EB病毒病的疗效和安全性[J].中华内科杂志,2012,51(12):966-970.11.Seung-ShinL,Jae-SookA,Sung-HoonJ,etal.TreatmentofBKvirus-associatedhemorrhagiccystitiswithlow-doseintravenouscidofovirinpatientsundergoingallogeneichematopoieticcelltransplantation[J].KoreanJInternMed,2015,30(2):212-218.12.WuJL,MaHY,LuCY,etal.Riskfactorsandoutcomesofcytomegalovirusviremiainpediatrichematopoieticstemcelltransplantationpatients.[J].JMicrobiolImmunolInfect,2017,50(3):307-313.13.FanJ,JingM,YangM,etal.Herpesvirusinfectionsinhematopoieticstemcelltransplantrecipientsseropositiveforhumancytomegalovirusbeforetransplantation[J].InternationalJournalofInfectiousDiseases,2016,46:89-93.14.OgataM,KikuchiH,SatouT,etal.Humanherpesvirus6DNAinplasmaafterallogeneicstemcelltransplantation:incidenceandclinicalsignificance[J].TheJournalofinfectiousdiseases,2006,193(1):68-79.15.OlkinuoraHA,TaskinenMH,SaarinenpihkalaUM,etal.Multipleviralinfectionspost-hematopoieticstemcelltransplantationarelinkedtotheappearanceofchronicGVHDamongpediatricrecipientsofallogeneicgrafts.[J].PediatricTransplantation,2010,14(2):242-248.16.HillJA,MayerBT,XieH,etal.Thecumulativeburdenofdouble-strandedDNAvirusdetectionafterallogeneicHCTisassociatedwithincreasedmortality[J].Blood,2017,129(16):2316-2325.17.Dockrell,DavidH,Paya,CarlosV.Humanherpesvirus‐6and‐7intransplantation[J].ReviewsinMedicalVirology,2001,11(1):23-36.18.UhmJ,HamadN,MichelisFV,etal.TheriskofpolyomavirusBK-associatedhemorrhagiccystitisafterallogeneichematopoieticSCTisassociatedwithmyeloablativeconditioning,CMVviremiaandsevereacuteGVHD.[J].BoneMarrowTransplantation,2014,49(12):1528-1534.19.Padilla-FernandezB,Bastida-BermejoJM,Virseda-RodriguezAJ,etal.Hemorrhagiccytitisafterbonemarrowtransplantation[J].ArchivosEspaolesDeUrología,2014,67(2):167-174.20.HanT,XuL,LiuD,etal.Cytomegalovirusisapotentialriskfactorforlate‐onset35 第二部分建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染hemorrhagiccystitisfollowingallogeneichematopoieticstemcelltransplantation[J].AmericanJournalofHematology,2014,89(1):55-61.21.桑丽娜,孙玲,李英梅,等.造血干细胞移植术后出血性膀胱炎的临床观察[J].中华血液学杂志,2014,35(8):747-749.22.JenkinsFJ,RoweDT,JrCRR.HerpesvirusInfectionsinOrganTransplantRecipients[J].ClinDiagnLabImmunol,2003,10(1):1-7.23.BatistaCKLP,MotaJMSC,SouzaMLP,etal.Amifostineandglutathionepreventifosfamide-andacrolein-inducedhemorrhagiccystitis[J].CancerChemotherapy&Pharmacology,2007,59(1):71-77.24.宋铁梅,陈广华,张翔,等.异基因造血干细胞移植后CMV与EBV共激活患者临床预后分析[J].中华医学杂志,2014(40):3135-3139.25.ZerrDM,BoeckhM,DelaneyC,etal.HHV-6reactivationandassociatedsequelaeafterhematopoieticcelltransplantation[J].BiologyofBlood&MarrowTransplantationJournaloftheAmericanSocietyforBlood&MarrowTransplantation,2012,18(11):1700-1708.26.TongLX,WorswickSD.Viralinfectionsinacutegraft-versus-hostdisease:Areviewofdiagnosticandtherapeuticapproaches[J].JournaloftheAmericanAcademyofDermatology,2015,72(4):696-702.27.FuleRoblesJD,CheukDK,HaSY,etal.Humanherpesvirustypes6and7infectioninpediatrichematopoieticstemcelltransplantrecipients[J].AnnalsofTransplantationQuarterlyofthePolishTransplantationSociety,2014,19(1):269-276.28.WatcharanananSP,KiertiburanakulS,PiyatuctsanawongW,etal.Cytomegalovirus,adenovirus,andpolyomavirusco-infectionamongpediatricrecipientsofallogeneicstemcelltransplantation:characteristicsandoutcome.[J].PediatricTransplantation,2010,14(5):675-681.29.VerdeguerA,deHerediaCD,GonzálezM,etal.Observationalprospectivestudyofviralinfectionsinchildrenundergoingallogeneichematopoieticcelltransplantation:a3-yearGETMONexperience[J].BoneMarrowTransplantation,2011,46(1):119-124.36 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染综述综述异基因造血干细胞移植后人类疱疹病毒感染的研究进展姬玉涵综述吴小津审校异基因造血干细胞移植是治疗血液系统疾病的重要且有效的方法，但移植后相关的并发症仍然是影响造血干细胞移植患者长期生存的主要障碍，其中人类疱疹病毒感染是造血干细胞患者的主要并发症和死亡原因[1]。尽管随着早期诊断技术和治疗方法的不断优化，但是其相关死亡率仍较高。本文从人类疱疹病毒感染、诊断和防治3个方面做一综述。人类疱疹病毒1型，2型，3型（HSV-1，HSV-2，VZV）1.1HSV-1，HSV-2，VZV的感染HSV-1，HSV-2和VZV属于人类疱疹病毒α亚科，HSV引起疾病的发生较普遍[2,3,4]，HSV-1主要引起除生殖器以外的皮肤、口腔黏膜和脑的感染，HSV-2则主要引起生殖器部位皮肤黏膜的感染。单纯疱疹病毒可经呼吸道、生殖器黏膜，口腔以及破损皮肤进入体内，潜伏于机体，主要在神经元内。当机体免疫力下降，潜伏的单纯疱疹病毒就会被激活而引起疾病。临床表现为口周疼痛，泌尿生殖器水疱形成或者黏膜炎，少见的临床表现包括中枢神经系统疾病、肝炎甚至全身播撒性疾病。VZV感染潜伏在背根神经节，常引起病毒性皮肤病，这种病毒性皮肤病以沿周围神经分布的群聚疱疹和神经痛为特征。造血干细胞移植患者较正常人易于感染VZV，病程迁延，病情重，死亡率较高。在造血干细胞移植患者，VZV感染可累及实质脏器如肝脏，肺，也可累及中枢神经系统引起病毒性脑炎[5,6]。移植患者在没有预防性治疗的情况下，VZV的感染率在20%～50%，通常发生在移植后期[7,8]。有研究表明VZV感染是慢性急性移植物抗宿主病（cGVHD）的高危因素[9]。1.2HSV-1，HSV-2，VZV的诊断HSV的病毒培养通常在24～72小时内生长。HSV病毒特异性的荧光抗体检测需刮取水疱或者黏膜基底的细胞涂片进行检测，若有HSV感染，可在1小时内检出，此检测方法较快速。脑脊液PCR方法可用于检测中枢神经系统疾病，血PCR方法主要用于血液播撒性感染的检测[6]。VZV的诊断方法与HSV的类似。37 综述建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染1.3HSV-1，HSV-2，VZV的预防和治疗口服阿昔洛韦可有效预防HSV和VZV感染，法昔洛韦和伐昔洛韦同样有效，但在停药后易复发。HSV和VZV感染引起的疾病，若较轻微，可口服或小剂量（5mg/kg/8h）静脉使用阿昔洛韦，若发生中枢神经系统疾病或者全身播撒性疾病，则需大剂量（10mg/kg/8h）静脉使用阿昔洛韦治疗，疗程需维持2～3周。若出现阿昔洛韦耐药，可换用膦甲酸钠（60mg/kg/8h）治疗[10]。2.EB病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）2.1EBV感染EBV属于人类疱疹病毒γ亚科，是一种嗜淋巴细胞的疱疹病毒，在健康成人中感染率较高。EBV再激活是异基因造血干细胞移植术后常见的并发症，病死率达13.8%[11]。EBV感染可引起脊髓炎、肺炎、肝炎、病毒性脑炎，也可引起严重的并发症如EBV相关的淋巴细胞增殖性疾病（EBV-PTLD），造血干细胞移植后EBV-PTLD发生率在1%～30%，通常发生在移植后6个月内，致死率在25%～48%[7,12,13]。EBV再激活的危险因素主要有移植类型、T细胞去除，免疫抑制剂的使用以及GVHD[14]。国外学者研究显示巨细胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）再激活是促进EBV再激活的独立危险因素[15]。2.2EBV感染的诊断病毒抗体的检测是临床诊断EBV感染的重要指标，在造血干细胞移植前后推荐使用PCR方法检测EBV的病毒负荷量，至少每周一次，持续3个月。EBV-PTLD的诊断还需病理活检以及免疫表型特征的支持[7]。2.3EBV感染的预防和治疗EBV的预防主要是利妥昔单抗、停用相关免疫抑制剂等方法。DierickxD等学者研究显示使用利妥昔单抗抢先治疗可减少90%的EBV-PTLD的发生[16]。利妥昔单抗是allo-HSCT后EBV感染的常用治疗药物。抗病毒药物可使用阿昔洛韦，更昔洛韦等，但对潜伏感染的EBV无效，不能延缓EBV-PTLD的进展，因此目前不推荐单独使用抗病毒药物。其他的治疗方法还包括减停免疫抑制剂，细胞生物治疗，化疗和靶向治疗等[11]。3.人类巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)3.1CMV感染38 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染综述CMV在人群中普遍感染，原发感染后可长期处于潜伏感染状态，这种感染通常无明显症状。在免疫功能低下的人群中特别是造血干细胞移植患者，CMV可被激活导致活动性感染。造血干细胞移植患者由于大剂量化疗药物及免疫抑制剂的使用，从而导致机体免疫功能低下，易出现CMV感染/再激活。CMV感染可以导致以发热、白细胞减少、萎靡、关节疼痛及皮疹等为主要特征的综合征[17,18]。30%的异基因造血干细胞移植患者可发展为CMV疾病，包括肺炎、肝炎、肠炎和脑炎等，且病死率较高[19,20]。在自体造血干细胞移植中CMV疾病的发生率约为5%[19]。在实体器官移植中，供者CMV血清学阳性和受者CMV血清学阴性（CMVD+/R-）是CMV疾病发生的最危险因素,其他危险因素还包括免疫抑制剂的强度，抗胸腺细胞球蛋白（ATG）的使用，急性排异，HLA不全相合等[19,21]。3.2CMV感染的诊断常用的CMV检测方法包括CMV特异性的IgM，IgG检查，但CMV特异性的IgM，IgG检查灵敏度低，对于CMV疾病的诊断作用较小。从外周（如鼻咽部分泌物、尿液、粪便等）分离病毒培养CMV病毒的阳性率低，且病毒培养所需时间较长、敏感度低、标本的稳定性差，故很难指导临床治疗。CMV-pp65应用免疫组化的方法对CMV表面的-pp65抗原进行检测，可以作为CMV活动性感染的早期指标[6]。PCR方法检测病毒DNA负荷量因其灵敏度及特异度高，近年来广泛应用于病毒活动性感染的检测以及抗病毒治疗效果的评价。但在诊断CMV疾病时，仅仅凭借PCR方法是远远不够的，还需结合受累脏器的临床表现、病理学以及特异性的免疫组化结果综合诊断[22]。3.3CMV感染的预防和治疗对于CMV的预防，一方面是规律给予抗病毒药物预防CMV感染，另一方面是对高危人群进行检测，一旦出现有CMV病毒感染的表现立即开始抢先抗病毒治疗。更昔洛韦可以作为有效的治疗方法来降低CMV疾病的发生率，但对生存率无明显改善[20]。膦甲酸钠与更昔洛韦疗效相当，也可用于CMV感染的预防和抢先治疗。免疫球蛋白一般不推荐作为抗病毒预防[23]。目前抗病毒治疗是CMV感染的主要治疗方法，CMV感染推荐静脉使用更昔洛韦，当存在耐药或抗病毒失败时，可换用膦甲酸钠或西多福韦。但膦甲酸钠存在有肾毒性、恶心、呕吐、癫痫、贫血等严重的不良反应。西多福韦是核苷酸胞嘧啶的类似物，对腺病毒、乙型肝炎病毒（HBV）等也有一定疗39 综述建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染效，但由于其严重的肾毒性，故使用受到限制，可作为二线药物使用。缬更昔洛韦和伐昔洛韦是治疗CMV疾病的新型药物，与阿昔洛韦及更昔洛韦相比，口服这2种药物具有更高的生物利用度[24,25,26]。4.人类疱疹病毒6，7型（HHV-6，7）4.1HHV-6，7的感染HHV-6和HHV-7属于人类疱疹病毒β亚科，原发感染通常无临床症状，或者仅仅表现为发热、幼儿急疹等。与其他人类疱疹病毒相似，可终生处于潜伏感染。HHV-6和HHV-7的血清阳性率高达90%。实体器官移植后HHV-6感染的发生率在31%～55%，对HHV-7感染研究较少，约在0～46%。HHV-6和HHV-7感染在移植后出现相对较早，通常在移植后2～4周内，比CMV感染发生早[27,28]。HHV-6感染可导致发热等表现，与CMV病毒综合征类似。相关研究表明HHV-6感染是引起肝炎、肺炎和脑炎的病因，HHV-6也与真菌感染的发生发展相关[29,30,31]。HHV-7感染引起的相关疾病报道鲜少。Lautenschlager等学者认为HHV-6或HHV-7与CMV感染相关[32]。HHV-6和HHV-7与GVHD的关系存在矛盾[33,34]。HHV-6和HHV-7感染的危险因素并不明确，ATG和较强免疫抑制剂的使用是否会引起病毒再激活目前尚不清楚[35]。4.2HHV-6，7的诊断HHV-6和HHV-7的诊断有血清学方法，病毒培养，免疫组化以及PCR方法。与其他人类疱疹病毒一样，血清学方法灵敏度低，难以应用。PCR方法可定量检测病毒DNA水平诊断HHV-6和HHV-7感染，是目前普遍采用的方法。没有充分的证据表明需在无症状的患者中常规行HHV-6和HHV-7的检测[35]。4.3HHV-6，7的预防和治疗对于HHV-6和HHV-7的预防和抢先治疗仍然是未知的，抗病毒治疗主要是更昔洛韦、膦甲酸钠以及西多福韦[36]。对于HHV-6脑炎的治疗，可选用更昔洛韦或者联合膦甲酸钠。5.人类疱疹病毒8型（HHV-8）5.1HHV-8的感染HHV-8也称为卡波西肉瘤相关疱疹病毒，是Chang等学者在1994年从合并卡波西肉瘤艾滋病患者的肉瘤组织中发现的。与其他人类疱疹病毒不同的是，HHV-8感染并不普遍。临床表现主要是发热，骨髓抑制等[37,38,39]。40 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染综述5.2HHV-8的诊断目前尚无成熟的实验室方法来检测HHV-8感染，有少量文献报道可以用定量PCR方法检测全血或者血浆中HHV-8的病毒负荷量，但阴性结果并不能排除HHV-8感染[22]。5.3HHV-8的防治HHV-8感染尚无明确药物，体外研究表明HHV-8对更昔洛韦、膦甲酸钠和西多福韦敏感，这些抗病毒药是否能用于预防或抢先治疗目前还不清楚。综上所述，人类疱疹病毒感染是造血干细胞移植后严重的并发症，病毒感染再激活普遍存在。通过控制危险因素，动态监测人类疱疹病毒，预防或抢先治疗的策略控制疾病，对降低人类疱疹病毒感染及相关疾病的发生和改善造血干细胞移植患者的预后具有积极意义。但目前国内外对于人类疱疹病毒的检测和诊断并无统一标准，特异性抗病毒药物的缺乏，在临床工作中仍面临诸多挑战，仍需多中心、大样本的实验进行深入研究。参考文献1.VerdeguerA,deHerediaCD,GonzalesM,etal.Observationalprospectivestudyofviralinfectionsinchildrenundergoingallo-geneichematopoieticcelltransplantation:a3-yearGETMONexperience[J].BoneMarrowTransplant,2011,46(1):119–124.2.SiddiqiOK,GhebremichaelM,DangX,etal.MolecularDiagnosisofCentralNervousSystemOpportunisticInfectionsinHIV-InfectedZambianAdults[J].ClinicalInfectiousDiseases,2014,58(12):1771-1777.3.DayanRR,PelegR.Herpeszoster–typicalandatypicalpresentations[J].PostgraduateMedicine,2017,129(6):567-571.4.LussignolM,EsclatineA.HerpesvirusandAutophagy:“AllRight,EverybodyBeCool,ThisIsaRobbery!”[J].Viruses,2017,9(12):372-393.5.WhitleyRJ.Herpessimplexvirusinfections[J].Lancet,2001,357(9267):1513-1518.6.张晓辉.造血干细胞移植后的病毒感染及治疗[J].临床内科杂志,2011,28(6):365-368.7.StyczynskiJ,ReusserP,EinseleH,etal.ManagementofHSV,VZVandEBVinfectionsinpatientswithhematologicalmalignanciesandafterSCT:guidelinesfrom41 综述建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染theSecondEuropeanConferenceonInfectionsinLeukemia[J].BoneMarrowTransplantation,2009,43(10):757-770.8.ArvinAM.Varicella-Zostervirus:pathogenesis,immunity,andclinicalmanagementinhematopoieticcelltransplantrecipients.[J].BiologyofBlood&MarrowTransplantationJournaloftheAmericanSocietyforBlood&MarrowTransplantation,2000,6(3):219-230.9.SteerCB,SzerJ,SasadeuszJ,etal.Varicella-zosterinfectionafterallogeneicbonemarrowtransplantation:incidence,riskfactorsandpreventionwithlow-dosecyclovirandganciclovir[J].BoneMarrowTransplantation,2000,25(6):657-664.10.ChenY,ScieuxC,GarraitV,etal.Resistantherpessimplexvirustype1infection:anemergingconcernafterallogeneicstemcelltransplantation[J].Clinicalinfectiousdiseases,2000,31(4):927-935.11.刘苏,陈纯.异基因造血干细胞移植后EB病毒再激活的研究进展[J].国际输血及血液学杂志,2016,39(5):419-423.12.BarberiW,PerroneS,IoriAP,etal.ProvenEpstein-BarrencephalitiswithnegativeEBV-DNAloadincerebrospinalfluidafterallogeneichematopoieticstemcelltransplantationinachildwithacutelymphoblasticleukemia[J].Pediatrictransplantation,2015,19(1):E19-24.13.CollinsMH,MontoneKT,LeaheyAM,etal.Post-transplantlymphoproliferativediseaseinchildren[J].Pediatrictransplantation,2001,5(4):250-257.14.宋铁梅,陈广华,张翔,等.异基因造血干细胞移植后CMV与EBV共激活患者临床预后分析[J].中华医学杂志,2014(40):3135-3139.15.ZallioF,PrimonV,TamiazzoS,etal.Epstein-Barrvirusreactivationinallogeneicstemcelltransplantationishighlyrelatedtocytomegalovirusreactivation[J].ClinicalTransplantation,2013,27(4):E491-497.16.DierickxD,TousseynT,GheysensO.HowItreatposttransplantlymphoproliferativedisorders[J].Blood,2015,126(20):2274-2283.17.ElCF,ShahDP,ChemalyRF.HowItreatresistantcytomegalovirusinfectioninhematopoieticcelltransplantationrecipients[J].Blood,2016,128(23)：2624-2636.18.AzevedoLS,PierrottiLC,AbdalaE,etal.Cytomegalovirusinfectionintransplantrecipients[J].Clinics,2015,70(7):515-523.19.BoeckhM,LeisenringW,RiddellSR,etal.Latecytomegalovirusdiseaseandmortality42 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染综述inrecipientsofallogeneichematopoieticstemcelltransplants:importanceofviralloadandT-cellimmunity[J].Blood,2003,101(2):407-414.20.BowdenRA,SlichterSJ,SayersMH,etal.Useofleukocyte-depletedplateletsandcytomegalovirus-seronegativeredbloodcellsforpreventionofprimarycytomegalovirusinfectionaftermarrowtransplant[J].Blood,1991,78(1):246-250.21.吴德沛.造血干细胞移植后病毒感染现状[C].//中华医学会第十一次全国血液学学术会议论文集苏州大学附属第一医院,2010:240-248.22.LjungmanP,CamaraRDL,CordonnierC,etal.ManagementofCMV,HHV-6,HHV-7andKaposi-sarcomaherpesvirus(HHV-8)infectionsinpatientswithhematologicalmalignanciesandafterSCT[J].BoneMarrowTransplantation,2008,42(4):227-240.23.KusneS,ShapiroR,FungJ.Preventionandtreatmentofcytomegalovirusinfectioninorgantransplantrecipients[J].TransplantInfectiousDisease,1999,1(3):187-203.24.LowanceD,NeumayerHH,LegendreCM,etal.ValacyclovirforthepreventionofcytomegalovirusdiseaseafterrenaltransplantationInternationalValacyclovirCytomegalovirusProphylaxisTransplantationStudyGroup[J].TheNewEnglandjournalofmedicine,1999,340(19):1462-1470.25.SiaIG,PatelR.NewStrategiesforPreventionandTherapyofCytomegalovirusInfectionandDiseaseinSolid-OrganTransplantRecipients[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2000,13(1):83-121.26.ZerrDM,GuptaD,HuangML,etal.EffectofAntiviralsonHumanHerpesvirus6ReplicationinHematopoieticStemCellTransplantRecipients[J].ClinicalInfectiousDiseases,2002,34(3):309-317.27.DockrellDH.Humanherpesvirus-6and-7intransplantation[J].Reviewsinmedicalvirology,2001,11(1):23-36.28.PagterPJAD,SchuurmanR,VisscherH,etal.HumanHerpesVirus6PlasmaDNAPositivityafterHematopoieticStemCellTransplantationinChildren:anImportantRiskFactorforClinicalOutcome[J].BiologyofBlood&MarrowTransplantation,2008,14(7):831-839.29.YamaneA,MoriT,SuzukiS,etal.RiskFactorsforDevelopingHumanHerpesvirus6(HHV-6)ReactivationafterAllogeneicHematopoieticStemCellTransplantationandItsAssociationwithCentralNervousSystemDisorders[J].BiolBloodMarrow43 综述建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染Transplant,2007,13(1):100-106.30.SinghN.Encephalitiscausedbyhumanherpesvirus-6intransplantrecipients:relevanceofanovelneurotropicvirus[J].Transplantation,2000,69(12):2474-2479.31.LautenschlagerI,LappalainenM,LinnavuoriK,etal.CMVinfectionisusuallyassociatedwithconcurrentHHV-6andHHV-7antigenemiainlivertransplantpatients[J].JournalofClinicalVirology,2002,25Suppl2(Suppl2):S57-61.32.KiddIM,ClarkDA,SabinCA,etal.Prospectivestudyofhumanbetaherpesvirusesafterrenaltransplantation:associationofhumanherpesvirus7andcytomegalovirusco-infectionwithcytomegalovirusdiseaseandincreasedrejection.[J].Transplantation,2000,69(11):2400-2404.33.GriffithsPD,Ait-KhaledM,BearcroftCP,etal.Humanherpesviruses6and7aspotentialpathogensafterlivertransplant:prospectivecomparisonwiththeeffectofcytomegalovirus[J].Journalofmedicalvirology,1999,59(4):496-501.34.ListedN.Otherherpesviruses:HHV-6,HHV-7,HHV-8,HSV-1and-2,VZV[J].AmericanJournalofTransplantation,2004,4Suppl10:66-71.35.AgutH,BonnafousP,GautheretdejeanA.LaboratoryandClinicalAspectsofHumanHerpesvirus6Infections[J].ClinicalMicrobiologyReviews,2015,28(2):313-315.36.YeX,FengY,PangY,etal.Kaposi’ssarcomadevelopedafterallogeneichematopoieticstemcelltransplantation[J].OncologyLetters,2011,2(3):515-518.37.LuppiM,BarozziP,SchulzTF,etal.Bonemarrowfailureassociatedwithhumanherpesvirus8infectionaftertransplantation[J].TheNewEnglandjournalofmedicine,2000,343(19):1378-1385.38.CuzzolaM,IrreraG,IacopinoO,etal.Bonemarrowfailureassociatedwithherpesvirus8infectioninapatientundergoingautologousperipheralbloodstemcelltransplantation[J].Clinicalinfectiousdiseases:anofficialpublicationoftheInfectiousDiseasesSocietyofAmerica,2003,37(7):e102-106.39.ChristensonES,TeplyB,AgrawalV,etal.HumanHerpesvirus8-RelatedPrimaryEffusionLymphomaAfterLiverTransplantation[J].AmericanJournalofTransplantationOfficialJournaloftheAmericanSocietyofTransplantation&theAmericanSocietyofTransplantSurgeons,2015,15(10):2762-2766.44 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染英文缩略词汇表英文缩略词汇表HHVHumanherpesvirus人类疱疹病毒HSVHerpessimplexvirus单纯疱疹病毒VZVVaricella-zostevirus水痘-带状疱疹病毒EBVEpstein-BarrvirusEB病毒CMVCytomegalovirus巨细胞病毒HLAHumanLeukocyteAntigen人类白细胞抗原AMLAcutemyeloidleukemia急性髓细胞白血病ALLAcutelymphoblasticleukemia急性淋巴细胞白血病MDSMyelodysplasticsyndromes骨髓增生异常综合征AAAplasticanemia再生障碍性贫血PTLDLymphoproliferativedisease淋巴细胞增值性疾病PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应ATGAntilymphocyteglobulin抗胸腺细胞球蛋白GVHDGraftversushostdisease移植物抗宿主病CRCompleteremission完全缓解Ara-CCytarabin阿糖胞苷BuBusulfan马法兰CTXCyclosposphamide环磷酰胺CsACyclosporinA环孢菌素AMMFMycophenolatemofelil麦酚酸脂TBITotal-bodyirradiation全身照射45 攻读学位期间公开发表的文章建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染攻读学位期间公开发表的文章1.造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染的临床研究.中华血液学杂志（已投）（第一作者）.2.过氧化物酶体增殖物激活受体γ的表达在allo-HSCT后aGVHD中的作用及意义[J].中华器官移植杂志,2017,38(2).3.PredictionofacuteGVHDandrelapsebymetabolicbiomarkersafterallogeneichematopoieticstemcelltransplantation[J].JCIinsight,2018,3(9).46 建立和应用多重PCR方法研究造血干细胞移植早期多种疱疹病毒感染致谢致谢指缝很宽，时间太瘦，悄悄从指缝间溜走。转眼间我已在苏州大学度过了宝贵的三年研究生时光。三年，这是我人生中非常重要的三年，我有幸能够接触到这些不仅传授我知识、学问，而且从更高层次指导我人生与价值追求的良师。他们使我坚定了人生的方向，获得了追求的动力，留下了研究生生活的美好回忆。回首三年的求学历程，对那些引导我、帮助我、激励我的人，我心中充满了感激。师恩如母，永刻于心。首先要衷心感谢的是我可敬可亲的导师吴小津老师！您三年来对我学习和研究的悉心指导和谆谆教诲令我终身受益。在您的指导下，我在各方面的能力都得到了相应的提高。在学习上，导师严谨治学的作风和诲人不倦的态度是我学习的楷模;在生活上，导师美丽的心灵和身影一直如母亲般关爱着我;在论文写作上，不论是选题、开题、文章框架的构筑，还是最后的定稿，都得到吴老师的细心指导与提携。您的睿智、对知识孜孜不倦的追求、对医学研究的热爱、严谨的治学态度让我学到了如何做事，您在生活中的宽容、豁达教会了我如何做人。感谢一直以来您对我的谆谆教导和严格要求。涓涓师恩，情深意切，铭记于心，只愿师生情谊一生延续。千言万语在此刻化为了一句“谢谢您！”感谢研究生三年来帮助过我的血液科老师们：吴德沛老师，孙爱宁老师，仇惠英老师，张日老师，唐晓文老师，韩悦老师，付琤琤老师，陈苏宁老师，马骁老师，陈峰老师，张旭辉老师，颜灵芝老师，徐杨老师，徐婷老师，金松老师，吴倩老师，陈佳老师，常伟荣老师，张翔老师，宋铁梅老师，岑建农老师，朱子玲老师，马守宝老师，以及朱护士长及全体护理老师，感谢你们在临床工作中给予的指导和关心。感谢我的师兄姚遥，戚嘉乾，徐金格，周萌，师姐李晓莉，徐良静，杨冰玉，师妹黄倩蕾，杨露露，赵冉冉。感谢我的同窗谢伊瑜，章茜茜，柯鹏，王超，楚甜甜，叶碧波，崔腾等。感谢我的舍友陈海晓，王聪，涂小娟，感谢你们在学习和生活上给予的关心和帮助，感谢你们陪我度过了美好的研究生生活。最后衷心的感谢呵护我成长的父母，感谢你们多年来对我学业的大力支持，你们的爱永远是我强有力的后盾和前进的动力。祝所有人身体健康，平安幸福，万事如意！47 苏州尤硕＋号－Ｊ＜专业ｌ２ＲＩＩ