金属暴露与高血压患病风险及预后研究

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分类号学号Ｄ２０１５７８０８１学校代码１０４８７密级博士学位论文金属暴露与高血压患病风险及预后伟祥吴学科专业：劳动卫生与环境卫生学指导教师：鲁青授＿ 独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行的研究工作及取得的研宄成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研宄成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明＾本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：ｍ丨曰期：年月曰＞３丨§夕学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保障、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以釆用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于１，、保密口在年解密后适用本授权书２、不保密“”（请在以上相应方框内打Ｗ）学位论文作者签名：指导敎师签名：Ｉ科曰期年夂月％曰曰期：＞＾牢￥月％曰 HuazhongUniversityofScienceandTechnologyDoctoralDissertationStudiesontheAssociationsofMetalExposurewiththeRiskandPrognosisofHypertensionPh.D.Candidate:WeixiangWuSupervisor:Prof.QingLuDepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealthSchoolofpublichealth,TongjiMedicalCollegeHuazhongUniversityofScienceandTechnologyWuhan,Hubei,430030,P.R.ChinaAThesisSubmittedforDoctoralDegreeofPhilosophy(PH.D.)AtTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnologySeptember,2013-May,2018 华中科技大学博士学位论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行的研宄工作及取得的研宄成果。尽我所知，除文中己经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的研宄成果。对本文的研宂做出贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：Ｉ日期：＞３年ｇ月义日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保障、使用学位论文的规定：，即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据，可以采用影印库进行检索、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本学位论文属于１、保密口，在年解密后适用本授权书２、不保密“”（请在以上相应方框内打Ｖ）学位论文作者签名：指导教师签纟：日期：＞说年夕月ｉ日日期年月日！２〇设ｒ 华中科技大学博士学位论文目录全文缩写词.......................................................................................................................1摘要...............................................................................................................................2Abstract..............................................................................................................................4前言...................................................................................................................................7第一部分环境金属暴露与高血压患病风险的关联研究...........................................111研究对象和方法.....................................................................................................112结果.........................................................................................................................163讨论.........................................................................................................................304结论.........................................................................................................................32第二部分基因多态性-重金属暴露交互作用与高血压患病风险的关联研究..........331研究对象和方法.....................................................................................................342.结果.........................................................................................................................383讨论.........................................................................................................................584结论.........................................................................................................................61第三部分重金属联合暴露对高血压患者肾功能的影响...........................................631研究对象和方法.....................................................................................................642结果.........................................................................................................................653讨论.........................................................................................................................804结论.........................................................................................................................83结论.................................................................................................................................84参考文献.........................................................................................................................86综述.................................................................................................................................99博士研究生工作小结...................................................................................................119致谢...............................................................................................................................121 华中科技大学博士学位论文全文缩写词英文缩写英文名称中文名称APAttributableproportions归因百分比BMIBodyMassIndex体质指数CATCatalase过氧化氢酶CIConfidenceinterval置信区间CKDChronickidneydisease慢性肾脏病DBPDiastolicbloodpressure舒张压eGFREstimatedglomerularfiltrationrate估计肾小球滤过率eNOSEndothelialnitricoxidesynthase内皮型一氧化氮合酶FDRFalsediscoveryrate错误发现率GFRGlomerularfiltrationrate肾小球滤过率GSTGlutathioneS-transferase谷胱甘肽S转移酶HWEHardy-Weinbergequilibrium哈迪-温伯格平衡定律intercellularcelladhesionICAM-1细胞间黏附分子-1molecule-1InductivelycoupledplasmamassICP-MS电感耦合等离子体质谱spectrometryLDLinkagedisequilibrium连锁不平衡MAFMinorallelefrequency最小等位基因频率MTMetallothionein金属硫蛋白NONitricOxide一氧化氮OROddsratio比值比PPPulsepressure脉压RCSRestrictedcubicspline限制性立方样条RERIRelativeexcessriskofinteraction超额相对危险度ROSReactiveoxygenspecies活性氧簇SBPSystolicbloodpressure收缩压SNPSinglenucleotidepolymorphisms单核苷酸多态性1 华中科技大学博士学位论文金属暴露与高血压患病风险及预后研究博士研究生：吴伟祥导师：鲁青教授摘要第一部分环境金属暴露与高血压患病风险的关联研究目的：本研究旨在使用尿样作为生物样品基质评估中国普通汉族人群中环境水平的金属暴露与高血压患病风险以及血压水平之间的关系。方法：采用横断面研究设计，以武汉市某综合医院体检中心的823名普通人群为研究对象，使用尿样作为生物样品基质，利用ICP-MS检测尿样中20种金属的环境暴露水平，采用多元回归模型评估潜在的关联，并结合多金属模型对多种金属的联合暴露效应进行分析。结果：分析结果显示，尿样中钒、铁、锌和硒的浓度与高血压的患病风险存在显著的剂量-反应正相关。在多金属模型中，与第一分位相比，第四分位的钒、铁、锌和硒水平分别能增加4.4倍、4.9倍、4.2倍和2.5倍的高血压患病风险（P<0.05）。此外，多元线性回归分析结果提示尿样中的高汞水平可升高舒张压。在多金属模型中，与第一分位相比，第四分位的汞水平可升高舒张压4.3mmHg。结论：环境水平的钒、铁、锌、硒和汞暴露可能与增高的高血压患病风险或血压水平有关。第二部分基因多态性-重金属暴露交互作用与高血压患病风险的关联研究目的：本研究旨在探讨基因多态性与高血压患病风险的潜在关联，以及基因-重金属交互作用在高血压患病风险中的影响。方法：采用病例-对照的设计进行分析，以497例高血压病例和497例健康对照作为研究对象，分析与重金属作用机制或代谢机制相关的9个基因上的36个SNP与高血压之间的关联，并在此基础上利用相加模型和相乘模型对镉和汞的暴露与基因多态性的交互作用进行探讨。结果：eNOS基因中的rs1008140、CAT基因的单倍型与高血压患病风险存在显著关联。在关于高血压患病风险的交互作用分析中，eNOS基因的rs2566508和rs2566511与镉暴露在相乘模型中存在交互作用，而eNOS基因的rs1008140和rs3918196与镉暴露在相加模型中存在交互作用；eNOS基因的rs2566508和rs2566511、CAT基因的rs10488736和rs17881846、MT2A基因的rs1610216则与汞2 华中科技大学博士学位论文暴露在相乘模型中存在交互作用。其中，rs10488736与汞暴露在相乘模型中的交互作用经过FDR校正后仍然具有显著性统计学意义（PFDR=0.048）。结论：eNOS、CAT和MT2A的基因多态性与镉和汞暴露在高血压患病风险中存在潜在的交互作用。第三部分重金属联合暴露对高血压患者肾功能的影响目的：本研究旨在研究高血压人群中环境水平的重金属暴露与肾功能之间的关联。方法：采用横断面研究设计，以武汉市某综合医院心内科的934个高血压患者为研究对象，测定其尿样中铬、镉、铊和铀的浓度，以估计肾小球滤过率（estimatedglomerularfiltrationrate，eGFR）作为评估肾功能的指标，采用多元线性回归模型探讨重金属暴露与肾功能之间的关联。结果：多元回归模型结果显示，在校正混杂因素和其他金属浓度之后，高血压患者中的尿铬水平每增加一倍就会降低eGFR2.90mL/min/1.73m2（P<0.001）；尿铀水平每增加一倍就是降低eGFR1.87mL/min/1.73m2（P=0.004）。铬和铀的联合暴露对eGFR水平的影响存在交互作用，能够降低高血压患者eGFR水平，尤其是女性高血压患者eGFR水平。与低暴露组相比，同时暴露于高水平的铬和铀的女性其eGFR下降了11.36mL/min/1.73m2（P<0.010）。尿中铊水平与男性eGFR呈正相关，尿中铊水平每增加一倍，eGFR就增加3.12mL/min/1.73m2（P=0.002）。结论：环境水平的铬和铀暴露可能会降低高血压患者的eGFR水平，且这种关联可能存在性别差异。关键词：金属；暴露；高血压；血压；基因多态性；交互作用；慢性肾脏病；肾功能；流行病学3 华中科技大学博士学位论文StudiesontheAssociationsofMetalExposurewiththeRiskandPrognosisofHypertensionCandicateforPh.D:WeixiangWuSupervisor:Prof.QingLuAbstractPartⅠEnvironmentalexposuretometalsandtheriskofhypertensionObjective:Thestudywasconductedtoassesstheassociationsofenvironmentalexposuretometalswiththeoddsofhypertensionaswellasbloodpressure(BP)levelsusingurinesamplesinaChinesegeneralpopulation.Methods:Thepresentexploratotorystudyof823eligibleparticipantswasconductedwithacross-sectionaldesign.Urinesamplewasusedasbiomarkerstoreflectthelevelsofenvironmentalexposureto20metals.Multivariableregressionmodelswereappliedtoassessthepotentialassociation.Multi-metalmodelswereutilizedtoinvestigatetheimpactsofco-exposuretovariousmetals.Results:Basedontheresultsfromvariousmodels,positivetrendsforincreasedoddsofhypertensionwithincreasingquartilesofvanadium,iron,zincandseleniumweresuggested.Comparedwiththoseinthelowestquartiles,participantsinthehighestquartilesofvanadium,iron,zincandseleniumhada4.4-fold,4.9-fold,4.2-foldand2.5-foldincreasedoddsofhavinghypertension,respectively.Highurinarymercurylevelwasfoundtoincreasethelevelsofdiastolicbloodpressure(DBP).IndividualsinthehighestgroupofHgwerefoundtohavea4.3mmHghigherlevelofDBP.Conclusions:Ourfindingssuggestthatenvironmentalexposuretovanadium,iron,zinc,seleniumandmercurymayincreasetheriskofhypertensionorelevatethelevelsofBP.PartⅡStudiesontheassociationsofmetalexposure,geneticpolymorphismsandtheirinteractionswiththeriskofhypertensionObjective:Thestudywasconductedtoinvestigatetheassociationsbetweengeneticpolymorphismsandtheriskofhypertension,andthemodificationeffectsbetweengeneticpolymorphismsandmetalexposureontheriskofhypertension.Methods:Thepresentstudyof497casesand497controlswasconductedwithacase-controldesign.Theassociationsbetweengeneticpolymorphismof36SNPsin9genesandtheriskofhypertensionwerestudiedusinglogisticmodels.Theinteractions4 华中科技大学博士学位论文betweengeneticpolymorphismsandtheexposuretocadmiumandmercurywereinverstigatedonboththeadditivescaleandthemultiplicativescale.Results:Amongthe36SNPsin9genes,significantassociationsofrs1008140ineNOSandthehaplotypeinCATwiththeriskofhypertensionwerefound.Multiplicativeinteractionsbetweenrs2566508andrs2566511ineNOSandcadmiumexposureforhypertensionwereobserved,whileadditiveassociationsbetweenrs1008140andrs3918196ineNOSandcadmiumexposureforhypertensionweresuggested.Multiplicativeinteractionsbetweenmercuryexposureandthe5SNPs,rs2566508andrs2566511ineNOS,rs10488736andrs17881846inCAT,andrs1610216inMT2A,weresignificantfortheriskofhypertension.Theinteractionbetweenmercuryexposureandrs10488736inCATremainedsignificantafteradjustmentformultipletesting(PFDR=0.048).Conclusions:AssociationsbetweencadmiumandmercuryexposureandtheriskofhypertensionmaybemodifiedbygeneticvariantsineNOS,CATandMT2A.PartⅢAssociationsofco-exposuretoheavymetalswithrenalfunctioninahypertensivepopulationObjectives:Thestudywasconductedtoexploretheassociationsofmetalexposurewithrenalfunctioninparticipantswithessentialhypertension.Methods:Thepresentstudyof934participantswithessentialhypertensionwasconductedwithacross-sectionaldesign.Wemeasuredthelevelsofchromium,cadmium,thalliumanduraniuminurineandcalculatedtheestimatedglomerularfiltrationrate(eGFR)forrenalfunction.Multivariablelinearregressionmodelsadjustedforpotentialconfounderswereapplied.Results:Afteradjustingforpotentialconfoundersandothermetals,doublingofurinarychromiumoruraniumlevelsdecreasedeGFRby2.90mL/minper1.73m2(P<0.001)and1.87mL/minper1.73m2(P=0.004),respectively.Co-exposuretochromiumanduraniumwasfoundtodecreaseeGFRgreatly,particularlyinwomen.Comparedwiththoseinthelowexposuregroup,womenwithhighexposuretochromiumanduraniumhada11.36mL/minper1.73m2(P<0.010)adjusteddeclineineGFR.HigherurinarythalliumlevelswerepositivelyrelatedtoelevatedeGFRinmen.TheadjustedincreaseineGFRwithdoublingofthalliumlevelswas3.12mL/minper1.73m2(P=0.002).5 华中科技大学博士学位论文Conclusions:EnvironmentalexposuretochromiumanduraniummaycontributetoadeclineineGFRinindividualswithhypertension.TheassociationsofexposuretoheavymetalswitheGFRmaybesex-different.Keywords:Metal;Exposure;Hypertension;Bloodpressure;Geneticpolymorphism;Interaction;Chronickidneydisease;Renalfunction;Epidemiology6 华中科技大学博士学位论文前言高血压已成为全球重要的公共卫生问题之一。据报道，2015年全球高血压患者的人数已达15.6亿[1;2]。近年来我国的高血压患病率一直居高不下，且呈逐年增长趋势。2002年我国成人高血压患病率为17.6％，总患病人数达1.5亿；2012年上升至25.2%，总患病人数达2.7亿[3;4]。高血压是各种心脑血管疾病和肾脏疾病的危险因素，也是我国疾病负担和死亡率的主要原因之一[2]。高血压及其相关疾病所造成的经济负担巨大，已成为我国重要的公共卫生难题[5]。因此，研究高血压的病因及危险因素，探索有效的预防与控制措施，是医学和公共卫生研究者一直以来的焦点问题。近年来，许多研究表明环境中存在的某些环境污染物，如多环芳香烃[6]、双酚A[7]、可吸入颗粒物[8]、多氯联苯[9]等具有心血管毒性，与血压的水平密切相关。因此，关于环境污染物暴露是否造成了全球高血压患病率上升已经引起了世界各国的广泛关注。20世纪以来，随着科学技术的迅猛发展，人类工业和农业得到极大的提高。然而，与此同时，环境污染问题日益显现。由于工业“三废”和机动车尾气的排放、污水灌溉和农药、除草剂、化肥等的使用以及矿业的发展，大量不同种类的环境污染物对土壤、水源、大气和食物造成了严重的污染。大多数有机化合物可以通过自然界本身的净化作用降低或解除其毒性。但是，金属会在水体和土壤中蓄积并破坏其净化作用，因此难以进行有效降解。金属污染主要来源于工业污染中的废渣、废水与废气，其次是交通污染和生活垃圾污染。我国作为一个发展中的大国，随着人口的增长、城市化进程的加快以及工农业的快速发展，人们对资源的需求量不断增加，大量金属经由不同途径（金属冶炼、采矿、废气、燃烧等）进入环境，由此引发的金属环境污染问题尤为严峻。宋伟等[10]建立了我国138个典型区域的耕地土壤重金属污染数据库，估算我国耕地的土壤重金属污染概率约为16.67%，据此推断我国耕地重金属污染面积占耕地总面积的1/6，其中辽宁和山西的耕地重金属污染尤其严重；谭吉华等人[11]通过文献调研发现中国40个主要城市的大气颗粒物中重金属均有超标现象，中国总体重金属污染高于美欧等发达国家，与印度相当；王海东等人[12]报道我国水体重金属污染率高达80%，各大江河湖库均受到不同程度的重金属污染。此外，据统计，我国于1990-2010年间向大气中排放镉的总量达2164吨，1980-2006年间由燃油向大气排放的铅总量达20万吨。随着工业的快速发展，在未来一定时期内重金属的排放仍将保持一定的增长势头，我国的金属污染问题也将日益加剧。由此可见，我国环境介质中的金属污染问题已经极为严重，由此引起普通人群广泛的金属暴露值得关注。普通人群暴露于金属的途径主要包括经口摄入、经呼吸摄入以及经皮肤接触。与其他国家相比，我国人群体内的金属含量普遍较高。丁春光等人[13;14]在我国87 华中科技大学博士学位论文个省份进行的调查显示，我国一般人群血铅的中位数为35.3μg/L，尿镉的中位数为0.30μg/L，尿砷的中位数为16.66μg/L，分别比美国一般人群[15]高37.9、2.0和2.7倍（美国一般人群的血铅中位数为0.93μg/L；尿镉中位数为0.15μg/L；尿总砷中位数为6.09μg/L）。由此可见，环境中的金属污染造成了普通人群的广泛暴露，且我国某些地区人群的金属内暴露水平明显高于其他国家，由此带来的普通人群环境水平的金属暴露风险需引起人们的高度重视。目前关于普通人群长期低剂量的环境水平的金属暴露与健康的关联性研究还较为缺乏，大多数金属的毒性效应只在职业性暴露研究和动物实验中有所报道。区别于职业性金属暴露的短期、急性和高剂量，普通人群的日常金属暴露具有持久性、蓄积性、低剂量和不易察觉的特点。由于一般人群的金属暴露水平较低，对疾病发病风险的影响不如职业暴露明显，因此在评估人群金属内暴露水平与疾病之间的关联时需要较大的样本量和足够灵敏的检测方法。另外，一般人群中的金属暴露与疾病之间的关联容易被其他混杂因素所掩盖，因此需要严谨的研究设计。例如，吸烟是普通人群镉暴露的主要途径，平均一根烟含1-2μg的镉，吸烟状态与镉的毒性效应关系密切；Wang等[16]发现，铅的暴露与人体体质指数（bodymassindex，BMI）和肥胖有关，且这种关联存在性别差异。金属进入体内后，通过氧化应激、炎症和致内皮功能不全等机制对机体造成损伤，或者通过与生物大分子结合使其失活从而发挥毒性。此外，一些金属甚至具有致癌作用（如镉、砷和铬等）[17-19]。长期环境水平的金属暴露与多种疾病都有潜在的关联，例如糖尿病[20]、帕金森综合征[21]、不良出生结局[22]、男性精液质量下降[23]等。近年来，关于金属暴露的研究成为了心血管疾病病因研究的一大热点。有害金属（如镉和汞等）的心血管毒性已经有充分的毒理学证据，但是迄今为止关于其环境水平的暴露与高血压的研究有限，且结论存在争议。韩国学者Eum等人[24]在一项全国性的流行病学研究中发现高血压人群中的血镉水平明显高于非高血压者（平均值：1.77µg/dLvs.1.64µg/dL），与最低分位相比，最高分位的血镉水平能增加高血压的患病风险1.51倍（95%CI：1.13，2.05）。然而，有些研究却没有发现镉暴露水平与血压水平之间存在关联[25;26]，甚至有些研究还发现镉暴露能够显著性地降低血压水平[27;28]。环境水平的汞暴露与高血压之间的关联在不同研究结果中同样存在差异。加拿大学者Valera等人[29]发现血汞浓度与收缩压水平呈正相关，血汞浓度每增加10倍，收缩压就会增加2.14（95%CI：0.94，3.33）mmHg。然而，Goodrich等[30]在一项关于牙科医生的研究中却发现尿汞水平与收缩压水平存在负相关。必需金属（如硒和锰等）具有重要的生理功能，是维持正常血压水平的关键因素。但是，有研究指出体内过高浓度的必需金属会对机体产生氧化损伤，进而导致高血压。Su等人[31]在一项基于北京社区人群的队列研究中发现与最低分位的对照组相比，血中硒浓度处于第四分位的人群罹患高血压的风险8 华中科技大学博士学位论文比为2.35（95%CI：1.69，3.26），提示体内的高硒浓度可能是高血压的危险因素。Lee等人[28]对韩国普通人群的研究表明锰暴露能够增加高血压的患病风险，血锰浓度每增加一倍，女性、男性和总人群的高血压患病风险就会分别增加1.83、1.57和1.56倍。动物研究显示其他必需金属（如铜、铁和锌）具有潜在的心血管毒性，但这些结果需要人群研究进一步的确认[32;33]。金属的毒性作用与其暴露剂量、暴露时间、暴露方式及体内的营养状态有关，因此不同地区的研究人群的暴露水平不一样，观察到的关联可能会有区别。我国金属污染严重，普通人群体内的各种金属水平都较高，可以推测金属污染所造成的心血管疾病危害将更加严重。因此，在我国人群中进行环境水平的金属暴露与高血压患病风险的关联性研究至关重要。另外，其他金属的混杂影响可能是金属研究结论存在差异的原因。到目前为止大多数关于金属的流行病学研究只注重单个金属的毒性效应，但这并不能准确反映人们环境水平金属暴露的实际状况。由于人群中多种金属的暴露具有类似的暴露来源和途径，人体内的金属含量往往相互关联[34]。鉴于不同的金属暴露之间可能存在交互作用，单个金属的毒性将被加强或者削弱，因此研究多种金属的共同暴露对高血压发病风险的影响具有很重要的意义。随着对疾病在分子生物学层面上认识的不断深入，科学家们逐渐意识到基因-环境的交互作用在疾病发生、发展中的重要性。人群通过相同暴露途径暴露于相同剂量的环境毒物，其发病风险却存在很大的个体差异性。由此可知，发病风险不仅与环境有害因素的暴露程度有关，同时还与个体的遗传易感性或耐受性有紧密的关联。研究指出，个体对金属毒性效应的易感性或耐受性存在差异。Taha等[35]发现ALAD基因上G177C的多态性能够修饰血液中铅的动力学过程，提高机体的铅负荷水平，从而增强铅的神经毒性；Yang等[36]发现VEGF-A基因上多个位点的基因多态性都与砷的致癌毒性有关，其单倍型与砷暴露在肾小细胞瘤的患病风险中存在显著的交互作用；Khansakorn等[37]发现GSTP1基因的基因多态性与体内的镉负荷有关，携带GSTP1Val/Val基因型的个体比其他基因型的人群具有更高的血镉水平。环境水平的金属暴露因暴露剂量低，其毒性作用远不及职业性暴露，因此其与疾病的关联更容易受到其他混杂因素的影响。其中，基因多态性的混杂作用可能被大多数研究所低估。我们推测环境水平的金属暴露可能只对特定基因型的个体具有可被观察到的健康危害，而此基因型在金属暴露的作用机制中起到至关重要的影响。这可以解释为什么具有充分毒理学证据的金属（如镉和汞），其环境水平的暴露与疾病之间的关联结果在不同的人群研究中会出现剧烈的改变甚至出现关联方向的改变。但这些推测需要在基因-金属交互作用研究中得到进一步证实。迄今为止，有关金属的心血管毒性相关基因-环境交互作用的研究非常有限，尤其是基于中国人群的研究。由于种族在遗传因素中起着决定作用，因此国外的研究需要在我国人群中进行重复验证。9 华中科技大学博士学位论文近来的研究表明，金属暴露不但与高血压的患病风险有关，还能影响高血压患者的预后。高血压是慢性肾脏病（CKD）的重要危险因素，而肾脏的健康状况对高血压患者的治疗和预后影响重大。其中，高血压合并CKD引发的各种心血管疾病是CKD致死的主要方式[38;39]。因此，在高血压患者中寻找肾损伤的致病风险因素，预防其并发CKD，是提高患者生活质量和预后的重要公共卫生措施。越来越多的证据表明重金属的环境水平暴露是CKD的危险因素之一。镉的肾毒性效应已经被大量研究所证实[40]。镉能够蓄积在肾脏中，通过氧化应激引发肾小管损伤和肾损伤，因此临床上镉中毒后可以观察到尿中低分子量蛋白和肾小管酶的水平增高[41]。即使是低剂量的镉暴露也可能导致蛋白尿、糖尿和CKD的发生。Hwangbo等[42]发现，镉的内暴露水平与肾小球滤过率（glomerularfiltrationrate，GFR）呈负相关关系。动物实验和职业暴露研究发现铬、铊和铀也具有潜在的肾毒性，但是流行病学证据有限。据报道，人体内的铬主要蓄积在肾皮质中，铬暴露可能通过氧化应激、凋亡和炎症等机制导致肾功能损害[43-45]。另外，急性铊中毒可诱发肾脏损伤。在使用铊处理的动物模型中，研究者发现血清肌酐的浓度增加，GFR的水平降低[46;47]。饮用水是铀的重要暴露来源，研究发现铀暴露可引起肾功能衰竭和DNA损伤[48]。与此同时，一些研究者发现，与血压正常的健康人群相比，高血压患者暴露于重金属之后更容易肾脏损伤[49;50]。另外，也有相关报道指出高血压患者暴露于一定剂量的重金属之后可能出现蛋白尿和β2-微球蛋白尿，但在血压正常的个体中却观察不到这种影响[51]。基于此，我们推测高血压患者对于金属肾毒性的易感性更高，但仍需在流行病学研究中加以证实。有鉴于此，本文在第一部分的探索性研究中以成年人为研究对象，分析环境水平的金属暴露状况及其与高血压患病风险的关联；在第二部分中进一步分析基因多态性与金属暴露的交互作用对高血压患病风险的影响；在第三部分中探讨了高血压病人中重金属的联合暴露对肾功能的潜在危害作用。本研究通过全面分析环境水平的金属暴露、基因多态性和基因-金属交互作用与高血压患病风险的关联，结合金属暴露在高血压患者肾损伤中的关键作用，为全方位的认知高血压的病因学、规划个体化预防和控制提供了有价值的线索和依据。10 华中科技大学博士学位论文第一部分环境金属暴露与高血压患病风险的关联研究随着过去几十年来工业化与城市化的高速进程，日益严重的环境污染已经成为了中国的公共卫生难题。其中，金属污染因其持久性、广泛性和富集性等特点，已经成为了我国环境污染的重要组成部分[52-54]。对于非职业性暴露的普通人群而言，环境金属暴露的主要途径包括饮用水和食物的摄入、空气的吸入以及土壤和灰尘的皮肤接触[54-56]。虽然环境水平的暴露一般是低剂量的，但是暴露持久时间长，甚至有可能是终身的。此外，有些金属具有蓄积性（如镉、铅、铀等），进入人体后需要经过多年才能排出。因此，环境水平的金属暴露对于普通人群具有潜在的危害[23;57;58]。高血压是一种病因尚不明确的复杂疾病。全球范围内大约有十亿的高血压患者，高血压作为全球疾病负担与死亡率的主要因素之一，已经成为全球性的重大公共卫生问题[2]。近期的流行病学研究发现，金属暴露可能是高血压患病风险的危险因素之一[59]。根据其在生物学过程中所表现的生理功能，金属可以分为非必需金属与必需金属。目前关于非必需金属（如镉和汞）心血管毒性的证据大多来自毒理学研究及职业暴露研究，而普通人群中的研究有限，且结论存在争议[59]。必需金属（如硒和钒）是维持血压正常水平的重要元素。这些元素的缺乏可能会导致机体氧化应激防御下降，进而加剧有毒物质的人群健康危害效应[60-62]。但是，部分研究结果发现体内过高浓度的必需金属的蓄积可能会导致与心血管疾病相关的不良健康结局[32;63-65]。此外，由于日常生活中金属的暴露来源相近，人群中不同金属的内暴露水平往往相互关联；且研究证实不同金属之间可能会存在交互作用，单个金属暴露的毒性作用将被加强或者削弱[56;66]。因此，在进行环境水平的金属暴露所致的人群不良健康效应的流行病学研究时，需考虑多个金属联合暴露的作用。本探索性研究利用电感耦合等离子体质谱（Inductivelycoupledplasmamassspectrometry，ICP-MS）技术检测尿样中20种金属的内暴露水平，结合多元回归模型探讨尿样中金属的浓度与高血压患病风险及血压水平的潜在关联。同时，本研究还采用多金属模型分析多种金属联合暴露对高血压患病风险及血压水平的影响。1研究对象和方法1.1研究对象1.1.1研究对象及排除标准本研究利用横断面设计方法，以武汉市某大型三甲综合医院的体检人群为研究对象，于2015年5月至2017年2月期间招募符合纳入标准的30岁以上的普通成年人。11 华中科技大学博士学位论文研究对象的纳入遵循以下排除标准：（1）被诊断为糖尿病、原发性肾病（如肾功能衰竭，肾功能不全）、脑血管疾病（如中风，脑梗塞）、慢性阻塞性肺病、甲状腺疾病（如甲亢，甲状腺功能减退症）和癌症者；（2）年龄≤30岁者；（3）从事金属相关工作的潜在职业性暴露者；（4）缺乏样本或者样本不足以进行检测者；（5）所需流行病学信息不全者。最终纳入本次分析的总共有823名参与者，所有参与者均来自于中国汉族人群。1.1.2流行病资料收集流行病学资料的收集采用统一编制的调查表进行，所有调查人员均进行了严格培训。问卷调查内容主要包括人口和社会经济因素、既往病史、用药情况、吸烟状况（不吸烟、目前吸烟、和以前吸烟）、饮酒情况（不饮酒、目前饮酒和以前饮酒）、生活习惯和生活条件。其中，目前吸烟者是指目前每天至少吸一支香烟并吸烟半年以上的人；以前吸烟者是指以前有吸烟史但现已戒烟半年以上的人；不吸烟者是指从未吸烟的人。对吸烟者询问其每天吸烟量及吸烟年限，并计算吸烟包年=吸烟年限×日吸烟量（支/天）÷20。目前饮酒者是指目前至少一个星期饮酒一次并持续半年以上的人；以前饮酒者是指曾经饮酒但已经戒酒半年以上的人；不饮酒者是指从不饮酒的人。体检中心专业医师利用促凝试管采集研究对象外周静脉血5mL，相关的生化指标（甘油三酯、总胆固醇、血糖、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇）由医院检验科专业医师完成。尿样收集由研究对象根据医师指导完成，本研究中采集的尿样样本为晨尿。收集尿样的容器为聚丙烯材质，经预实验确认无金属污染。所有收集的样品均在4小时内送到实验室进行检测。所有生物样品均按照标准操作流程进行分装、转运和储存。本研究已经获得华中科技大学同济医学院道德伦理委员会批准，研究对象在参与本次研究之前均填写了知情同意书。所有的流行病学资料与信息均通过Epidata3.1进行建库保存。Epidata的建库采用双录入，对两次录入不匹配的数据进行第三人核查，确保数据真实无误。1.1.3血压检测和高血压诊断血压的测量均由经过培训的操作员进行。血压检测前半小时禁止吸烟，禁饮浓茶或咖啡，小便排空，并于血压测量前至少休息15分钟，避免紧张、焦虑、情绪激动或疼痛。测量血压时，被测者采取坐位姿势，全身肌肉放松，于右上臂裸露的肘部放置适当尺寸的袖带。操作员将听诊器胸件置于袖带下肘窝处肱动脉上进行测量操作，收缩压和舒张压分别取柯氏音第1（KorotkoffⅠ）和第5音（KorotkoffⅤ）时的血压读数。每个被测者的血压重复检测3次，被测者的收缩压（systolicbloodpressure，SBP）和舒张压（diastolicbloodpressure，DBP）为3次重复测量的平均值，脉压（pulsepressure，PP）为收缩压与舒张压的差值。本研究中高血压定义为收缩压≥140mmHg或舒张压≥90mmHg、医师诊断的高血压患者12 华中科技大学博士学位论文或者当前使用降压药物者[67]。1.2尿样分析1.2.1主要仪器ICP-MS（NexIONTM300X，美国PerkinElmer股份有限公司）；自动生化分析仪（BS-200，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；低速离心机（KDC-1044，安徽中科中佳科技仪器有限公司）。1.2.2主要试剂超纯硝酸（ppt级别，赛默飞世尔科技有限公司）；多元素混合标准溶液（美国Agilent科技有限公司）；内标混合溶液（美国Agilent科技有限公司）；调谐溶液（美国PerkinElmer股份有限公司）；质控试剂SRM2670a（冻干尿中有毒元素，美国标准与技术研究所）；质控试剂SRM1640a（自然水中痕量元素，美国标准与技术研究所，NIST）；肌酐测定试剂盒（肌氨酸氧化酶法，深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）。1.2.3尿样处理本研究利用ICP-MS技术检测尿样中20种金属的浓度——铝、钒、铬、锰、铁、镍、钴、铜、锌、砷、硒、铷、锶、镉、铯、钡、铊、铅、铀和汞。在检测之前，先将冷冻的尿样放置在室温中（22±2.0°C）解冻，然后离心，取500μL上清液转移至10mL聚丙烯离心管中，并加入20μL超纯硝酸，置于5°C冰箱中硝化过夜。在上机检测之前从冰箱中取出硝化样本，加入4.5mL1%（v/v）硝酸稀释尿样，并超声30min。所有样本需在24h内检测完毕。尿样肌酐浓度（μg/L）采用肌氨酸氧化酶的方法进行测定。将冰冻分装的尿样于室温中融化后混匀，取100μL尿样和900μL超纯水置于1.5mL离心管中，用恒温振荡器3000rpm涡旋1min后进行检测。1.2.4尿样检测方法1.2.4.1方法检出限（LOD，limitofdetection）与检出率本研究将超纯水作为试剂空白对照，其处理和测定方法同样本。根据文献报道的方法，在确定的工作条件下，取11次平行测定空白溶液的响应值（CPS，countspersecond）及3次平行测定一定浓度的元素标准溶液的响应值，根据以下公式计算方法检出限：LOD（μg/L）=[3δ/(S-B)]×Cδ：空白溶液测定11次的响应值的标准差S：一定浓度的各元素的响应值B：各元素标准溶液的浓度C：空白溶液的响应值13 华中科技大学博士学位论文尿样中20种金属元素的LOD如表1.1所示，未检出的样本浓度用LOD/2代替。表1.1尿中20种金属的检出限金属LODLOD/2铝0.09790.0490钒0.00310.0015铬0.01410.0070锰0.02170.0109铁0.16610.0831钴0.00280.0014镍0.02270.0113铜0.02060.0103锌0.04500.0225砷0.02820.0141硒0.26740.1337铷0.00530.0027锶0.01780.0089镉0.00330.0016铯0.00030.0001钡0.01290.0065铊0.00040.0002铅0.00210.0010铀0.00030.0002汞0.00460.0023LOD：检出限，μg/L1.2.4.2方法准确度（1）SRM2670a质控尿样：SRM2670a为包含有毒元素的冻干尿，涵盖了本研究中除铁、铷和锶之外的17种目标元素。NIST公司提供了三种评估方法准确性的标准浓度值，为认证值、参考值和信息值。SRM2670a中对本研究中的12种目标元素提供了认证值或参考值，我们根据指定的方法[68]比较测量值与认证值或参考值之间是否存在差异。该比较方法考虑了标准值、测量结果和其各自的不确定性，并对这些不确定性进行了组合和比较。如果平均测量值与标准差的绝对差Δm小于或等于结果与标准值之差的扩展不确定性UΔ，即Δm≤UΔ，则测量结果与标准值之间无明显差异，该方法可以准确测量该元素。SRM2670a中对本研究中的5种目标元素提供了信息值。对于信息值，SRM2670a中没有提供其不确定度的相关情况。根据NIST公司建议的方法，我们进行了6次平行测量并计算出测量值的平均值，然后根据扩展不确定度计算其95％置信区间。将测量值的95％置信区间与信14 华中科技大学博士学位论文息值进行比较，如果信息值包含在区间内或有重叠则认为该金属的检测方法达到要求。质控结果显示，本研究中17种目标元素的测量值与SRM2670a的标准浓度值不存在差异，本方法可以准确测量目标元素。（2）加标回收率：由于SRM2670a中没有给出铁、铷和锶的标准浓度值，因此使用加标回收率的测定去评估本方法的准确性。随机选取100个样本，每个样本取100μL组成样本池。根据样本池中各金属的背景值分别加入相应的低、高两个浓度的标准品进行加标回收率测定。铁、铷和锶的加标回收率介于102.2%-112.7%，证实了本方法对这3种元素检测的准确性。各金属的加标回收率结果如表1.2所示。表1.2尿中20种金属的加标回收率测定结果低浓度加标回收率高浓度加标回收率元素背景值（μg/L）加标量（μg/L）回收率加标量（μg/L）回收率铝4.3095.0110.6%50.0108.9%钒0.1390.1102.6%0.5109.9%铬0.0520.187.8%0.5100.0%锰0.7711.0102.2%5.098.2%铁11.15910.0107.2%100.0102.2%钴0.0110.192.8%0.5101.3%镍0.1160.1106.1%0.5115.3%铜0.3840.190.3%0.5112.7%锌9.79510.0111.6%100.0104.1%砷1.5085.0110.6%50.0112.6%硒0.9801.095.3%5.0104.1%铷32.73410.0110.0%100.0112.7%锶6.4345.0105.3%50.0110.2%镉0.0240.1103.2%0.5120.0%铯0.2680.1100.5%0.5112.2%钡1.1681.099.4%5.096.6%铊0.0210.199.3%0.598.5%铅0.1120.1107.7%0.5104.2%铀0.0040.199.5%0.5100.6%汞0.0600.183.6%0.576.4%1.2.4.3质量控制SRM1640a为自然水中痕量元素，其提供了本研究中17种目标元素的标准浓度值，用以进行日间、日内的质量控制。在检测过程中，每20个样品测量一次SRM1640a样本以确定仪器性能。如果>90%的目标金属元素（任意15种）测量值与标准浓度值不存在差异，则认为仪器状态良好，标准曲线可用；否则将清洗仪15 华中科技大学博士学位论文器并重新测定标准曲线。同时，使用空白样品（1％硝酸）控制潜在的污染。1.3统计分析采用描述性统计分析对所有参与者的人口特征进行描述，采用参数或非参数方法比较高血压和非高血压组之间的连续或分类变量的统计学差异性，利用Spearman等级相关法分析尿中不同金属浓度之间的相关性。本研究使用尿肌酐校正的金属浓度评估研究对象环境水平的金属暴露状况。将肌酐校正的金属浓度（μg/g）进行四分位数分组，以最低的四分位数为参照组，使用多元Logistic回归模型评估尿中金属水平与高血压患病风险的关系，并以比值比（oddsratio，OR）及其95%置信区间（confidenceinternal，CI）为效应估计值。此外，利用多元线性回归模型探讨尿中金属浓度与血压水平的关系，以效应估计值为回归系数（β）及95%CI为效应估计值。考虑到使用抗压药对血压水平的影响，根据文献报道的处理方法对使用降压药的参与者的收缩压和舒张压水平均增加10mmHg的常数补偿值[69;70]。回归模型中协变量的筛选基于Greenland等人[71]的方法：如果某个混杂变量的单独加入能使效应估计值的变化大于10％，则纳入回归模型。最终纳入模型的协变量包括连续性型变量中的年龄、BMI、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇水平和分类变量中的性别、吸烟和饮酒状况、吸烟包年、收入和教育水平。采用错误发现率校正（falsediscoveryrate，FDR）校正本研究中的20项假设检验，以便控制假阳性率[72]。为了克服将金属浓度作为等级变量分析的内在局限性，使用限制性立方样条模型（restrictedcubicspline，RCS）对单金属模型中经过FDR校正后仍然具有显著趋势的金属进行剂量反应分析。RCS模型中横坐标为自然对数转换的肌酐校正尿金属浓度，纵坐标为高血压患病风险值或者是血压变化值，以对数转换的肌酐校正尿金属浓度的第5、50和95百分位数作为节点（P<0.05表示非线性关联）。另外，使用敏感性分析检验以上结果的稳健性。在剔除高度稀释（肌酐<0.3g/L）或浓缩（肌酐>3.0g/L）的尿样之后，重复上述多元回归分析。在对使用降压药的高血压患者不进行血压值常数补偿时，重复上述多元回归分析。在进行亚组分析时，根据研究对象吸烟状况（吸烟者与非吸烟者）进行了分层分析，其中吸烟者包括目前吸烟者和以前吸烟者。此外，本研究利用多金属模型评估多种金属的联合暴露对高血压患病风险和血压水平的影响。多金属模型同时将20种金属和潜在混杂因素纳入回归模型，然后使用后退法剔除贡献较小的自变量（P>0.10）。除FDR校正和RCS模型外（STATA12.0），其他所有统计分析均在SPSS22.0中进行。统计检验均为双侧检验，P<0.05被认为有统计学意义，P<0.10则被认为有建议性的统计学意义。16 华中科技大学博士学位论文2结果2.1研究人群特征本研究参与对象的人群基本特征见表1.3。非高血压和高血压患者比例分别为66.6％和33.4％，平均年龄为56.84±8.96岁。与非高血压组相比，高血压组的年龄更大（P=0.001）、男性比例更高（P<0.001）。另外，高血压组参与者有较高水平的BMI、收缩压、舒张压、脉压差和甘油三酯，以及较低水平的肌酐和高密度脂蛋白胆固醇（P<0.05）。其他的人群特征如收入水平、教育程度、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇水平在两组间没有明显的差异性（P>0.05）。表1.3研究人群的基本特征(N=823).总人群非高血压高血压变量PN=823N=548N=275年龄，岁56.84±8.9655.03±7.6360.75±10.12<0.001性别，N(%)<0.001男性470(57.1)270(49.3)200(72.7)女性353(42.9)278(50.7)75(27.3)吸烟状态，N(%)<0.001从不吸烟604(73.4)423(77.2)181(65.8)现在吸烟55(6.7)24(4.4)31(11.3)以前吸烟164(19.9)101(18.4)63(22.9)饮酒状态，N(%)0.007从不饮酒534(64.9)376(68.6)158(57.5)现在饮酒24(2.9)14(2.6)10(3.6)以前饮酒265(32.2)158(28.8)107(38.9)收入情况，N(%)0.252<2000元/月35(4.3)24(4.4)11(4.0)2000-4999元/月314(38.2)205(37.4)109(39.6)5000-9999元/月383(46.5)250(45.6)133(48.4)>9999元/月91(11.0)69(12.6)22(8.0)教育情况，N(%)0.502≤小学21(2.5)12(2.2)9(3.3)初中70(8.5)46(8.4)24(8.7)高中、中专197(23.7)125(22.8)72(26.2)≥大学、大专535(64.3)365(66.6)170(61.8)降压药使用,N175(21.3)0(0.0)175(63.6)NA(%)吸烟包年5.75±12.665.29±12.436.66±13.080.141BMI,kg/m223.48±2.9023.01±2.7324.41±3.02<0.001收缩压,mmHg129±19.1120±12.8147±16.1<0.001舒张压,mmHg79±11.175±8.588±10.8<0.001脉压差,mmHg50±14.245±9.860±16.2<0.001尿肌酐,g/L1.40(0.73-2.05)1.46(0.77-2.16)1.24(0.70-1.87)0.002总胆固醇,mmol/L4.91(4.37-5.53)4.96(4.41-5.56)4.84(4.29-5.41)0.10517 华中科技大学博士学位论文表1.3续研究人群的基本特征(N=823).总人群非高血压高血压变量PN=823N=548N=275甘油三酯,mmol/L1.39(0.98-1.96)1.33(0.96-1.85)1.54(1.08-2.11)0.003HDL-C,mmol/L1.44(1.24-1.67)1.49(1.27-1.70)1.35(1.19-1.60)<0.001LDL-C,mmol/L2.74(2.29-3.26)2.77(2.35-3.27)2.67(2.19-3.23)0.929BMI：体质指数；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇。2.2尿液金属浓度的分布状况研究人群尿样中20种金属浓度的分布结果（μg/g）如表1.4所示。除了铬（92.7%）和汞（94.1%）外，其他金属的检出率均大于95.0%。与非高血压参与者相比，高血压患者尿样中有着更高浓度的钒、铁、镍、铜、锌、砷、硒、铷、锶、铯、铊、铀和汞（P<0.05）。Spearman等级相关分析显示，20种金属浓度之间均存在显著的正相关关系，rs范围为0.27-0.95（P<0.001）（见表1.5）。18 华中科技大学博士学位论文表1.4肌酐校正的尿中金属浓度分布N%>金属总人群(N=823)非高血压(N=548)高血压(N=275)TPLOD铝66.03(30.22-158.71)59.1(27.79-154.47)76.45(34.31-171.24)-1.410.160100.0%钒1.62(0.79-3.26)1.44(0.72-2.87)1.99(0.95-3.68)-3.270.001100.0%铬1.08(0.51-2.39)1.01(0.49-2.15)1.29(0.58-2.60)-1.400.16192.7%锰2.31(1.27-5.22)2.07(1.19-4.82)3.18(1.48-5.77)-1.610.10799.9%铁56.01(27.66-116.40)49.41(25.18-103.32)69.87(36.58-137.04)-2.750.006100.0%钴0.21(0.11-0.45)0.20(0.10-0.41)0.26(0.11-0.50)-1.140.257100.0%镍1.97(0.93-4.55)1.81(0.86-4.17)2.58(1.11-5.55)-2.700.00798.1%铜7.09(3.42-15.46)6.52(3.20-13.00)9.65(4.08-21.35)-4.34<0.00199.7%锌a0.30(0.13-0.79)0.24(0.12-0.66)0.46(0.21-1.04)-4.56<0.001100.0%砷26.6(12.64-59.05)23.26(11.41-53.86)35.13(17.68-67.55)-3.57<0.001100.0%硒19.03(9.63-43.39)16.89(8.70-36.99)25.12(11.68-49.45)-3.250.00197.5%铷a1.59(0.75-3.31)1.46(0.69-3.07)1.93(0.87-3.60)-2.100.036100.0%锶98.76(47.83-215.80)90.48(42.47-206.57)113.12(61.09-232.85)-1.890.060100.0%镉0.63(0.28-1.39)0.57(0.27-1.33)0.76(0.32-1.62)-1.100.27399.6%铯6.25(3.12-13.53)5.68(2.85-12.15)7.41(3.90-16.13)-2.720.007100.0%钡4.78(2.26-10.01)4.55(2.20-10.07)5.07(2.54-9.78)0.540.587100.0%铊0.35(0.17-0.68)0.32(0.15-0.65)0.39(0.22-0.73)-2.160.03199.9%铅2.00(1.00-4.39)1.91(1.00-4.12)2.22(0.98-5.06)-0.860.390100.0%铀0.027(0.012-0.070)0.026(0.012-0.096)0.027(0.012-0.052)3.310.00199.6%汞0.31(0.11-0.92)0.27(0.09-0.96)0.39(0.18-0.90)-3.060.00294.1%金属浓度表示为中位数（25th-75th），T为t检验统计量，N%>LOD为检出率。a锌和铷的浓度单位为mg/g，其他金属的单位为μg/g。19 华中科技大学博士学位论文表1.5尿中20种金属之间的相关关系铝钒铬锰铁钴镍铜锌砷硒铷锶镉铯钡铊铅铀汞铝1.000.560.560.690.710.550.560.570.500.510.550.550.540.520.570.600.500.660.380.27钒1.000.720.630.680.700.690.750.710.780.820.810.830.720.820.580.830.690.610.42铬1.000.690.690.660.600.590.560.620.650.610.640.590.630.570.620.660.620.29锰1.000.840.600.610.640.530.560.590.580.590.570.600.710.560.760.590.43铁1.000.640.680.710.620.640.670.660.690.650.690.760.640.760.500.50钴1.000.810.760.720.750.780.780.710.770.780.540.740.650.560.37镍1.000.800.750.760.780.790.700.780.790.560.730.690.550.45铜1.000.800.810.850.850.710.810.860.590.800.730.610.58锌1.000.800.840.810.740.790.810.510.740.650.540.50砷1.000.880.860.790.810.860.510.810.680.580.50硒1.000.930.820.820.930.540.880.710.610.55铷1.000.770.820.950.540.910.730.590.55锶1.000.740.810.620.790.680.560.44镉1.000.820.560.780.700.590.53铯1.000.570.910.740.600.56钡1.000.560.710.470.53铊1.000.710.580.54铅1.000.600.55铀1.000.43汞1.00注：所有P<0.001。20 华中科技大学博士学位论文2.3尿液金属浓度与高血压患病风险的关联使用校正混杂因素之后的多元Logistic模型去研究尿中金属浓度与高血压患病风险的关联，结果如图1.1所示。图1.1金属暴露与高血压患病风险以及血压水平的关联结果（*PFDR<0.05）我们发现尿中铝、钒、铬、锰、铁、铜、锌、砷、硒、锶和铯的浓度与高血压的患病风险之间有显著的剂量-反应关系（Pfortrend<0.05）。在FDR调整后，尿中钒、铬、锰、铁、铜、锌、硒和铯的浓度与高血压患病风险的剂量-反应关系仍然保持显著（PFDR<0.05）。RCS模型结果显示，随着尿中钒、铁、铜、锌、硒和铯浓度的增加，高血压患病风险也随之增加，并呈单调上升的趋势（见图1.2）。其中，钒与铁的浓度与高血压患病风险的剂量-反应关系为非线性关系（Pfornon-linearity<0.05），铜、锌、硒与铯的浓度与高血压患病风险的剂量-反应关系为21 华中科技大学博士学位论文线性关系（Pfornon-linearity>0.05）。另外，在FDR调整后的单金属模型中，铝、砷、锶、铊和汞暴露与高血压患病风险之间存在建议性的正相关趋势（PFDR<0.10）（见图1.1）。图1.2尿液金属浓度与高血压患病风险以及血压水平变化的RCS模型在同时纳入20种金属的多金属模型中，我们发现钒、铁、锌和硒与高血压患病风险呈现的正相关趋势与单金属模型的结果保持一致（见表1.6）。与第一分位22 华中科技大学博士学位论文相比，第四分位的钒、铁、锌和硒浓度分别增加4.38倍（95%CI：1.89，10.12）、4.87倍（95%CI：2.13，11.12）、4.18倍（95%CI：1.73，10.08）和2.52倍（95%CI：0.78，8.08）的高血压患病风险。值得注意的是，与参考组相比，第二、第三和第四分位的硒浓度与高血压风险之间均不存在显著的关联性。汞浓度与高血压患病风险在多金属模型中呈现显著性的正相关趋势。与参考值相比，第四分位的汞能够增加1.89倍（95%CI：0.99，3.60）的高血压患病风险（见表1.6）。另外，在多金属模型中，铷和铀的浓度与高血压患病风险之间存在显著性的负相关关系，铷和铀浓度的增加能够降低高血压的患病风险（Pfortrend<0.05）。但在之前的单金属模型中并没有发现此两种金属与高血压患病风险的关联。上述结果在敏感性分析中依然保持稳健，没有发生明显变化（结果未列出）。23 华中科技大学博士学位论文表1.6尿中金属与高血压患病风险的多金属模型结果OddsRatios(95%CIs)变量PfortrendQuartile1(<25th)Quartile2(25th-50th)Quartile3(50th-75th)Quartile4(>75th)钒1.00(Reference)1.67(0.92,3.01)4.33(2.20,8.53)4.38(1.89,10.12)<0.001铁1.00(Reference)1.37(0.74,2.52)3.11(1.56,6.22)4.87(2.13,11.12)<0.001锌1.00(Reference)1.65(0.87,3.13)3.32(1.54,7.16)4.18(1.73,10.08)0.002硒1.00(Reference)0.98(0.47,2.04)1.01(0.39,2.64)2.52(0.78,8.08)0.064铷1.00(Reference)0.40(0.20,0.81)0.41(0.17,1.01)0.17(0.05,0.53)0.007铀1.00(Reference)0.76(0.42,1.35)0.58(0.30,1.14)0.20(0.10,0.42)<0.001汞1.00(Reference)1.87(1.07,3.29)3.29(1.82,5.96)1.89(0.99,3.60)0.022注释：该模型校正了年龄、BMI、饮酒状态与HDL-C水平。24 华中科技大学博士学位论文2.4金属浓度与血压水平如图1.1所示，尿铁浓度与升高的收缩压和舒张压均存在显著的剂量-反应关系（Pfortrend<0.05）。但经过FDR调整后，这两个关联均没有显著意义，只有尿铁浓度与收缩压之间存在建议性的统计学关联（PFDR=0.086）。在关于血压值的多金属模型中，尿铁浓度的四分位数与收缩压之间存在正相关的趋势（Pfortrend<0.05）（见表1.7）。与对照组相比，第四分位数的尿铁浓度能使参与者的收缩压升高5.94（95%CI：1.21，10.68）mmHg。另外，汞浓度的四分位数与收缩压和舒张压之间存在明显的正相关关系（Pfortrend<0.05）（见图1.1）。经过FDR调整后，汞浓度的四分位数与舒张压之间的正相关趋势依然保持显著(PFDR=0.039)。RCS模型结果显示，汞浓度与舒张压之间的关联呈现线性关系（见图1.2）。在多金属模型中，尿汞浓度与舒张压之间的正关联仍然保持显著（Pfortrend<0.05）（见表1.8）。与第一分位数的汞浓度相比，第四分位数的汞浓度能使舒张压升高4.31（95%CI：1.58，7.04）mmHg。另外，在多金属模型中，铷和铀的四分位数与收缩压和舒张压存在剂量-反应负相关，铬的四分位数与舒张压之间存在剂量-反应正相关。值得注意的是，在之前的单金属模型中，这些关联均没有统计学意义。上述结果在敏感性分析中依然保持稳健，没有发生明显变化（结果未列出）。25 华中科技大学博士学位论文表1.7尿中金属与收缩压水平的多金属模型结果Coefficients(95%CIs)变量PfortrendQuartile1(<25th)Quartile2(25th-50th)Quartile3(50th-75th)Quartile4(>75th)铁1.00(Reference)2.33(-1.44,6.10)6.29(2.15,10.42)5.94(1.21,10.68)<0.001铷1.00(Reference)-6.90(-10.79,-3.01)-8.09(-12.53,-3.65)-10.34(-16.06,-4.62)0.001铀1.00(Reference)-2.04(-5.81,1.73)0.89(-3.36,5.15)-5.55(-9.80,-1.29)0.026汞1.00(Reference)2.83(-0.88,6.54)6.80(2.92,10.67)4.37(0.17,8.58)0.004注：该模型校正了性别、年龄、BMI、吸烟包年、收入和甘油三酯水平。表1.8尿中金属与舒张压水平的多金属模型结果Coefficients(95%CIs)变量PfortrendQuartile1(<25th)Quartile2(25th-50th)Quartile3(50th-75th)Quartile4(>75th)铬1.00(Reference)2.02(-0.44,4.49)3.23(0.52,5.95)3.21(0.15,6.27)0.011铷1.00(Reference)-4.37(-7.00,-1.73)-4.73(-7.78,-1.67)-5.69(-9.56,-1.82)0.007铀1.00(Reference)-0.74(-3.24,1.76)-0.5(-3.35,2.36)-3.31(-6.29,-0.32)0.035汞1.00(Reference)2.32(-0.13,4.78)5.95(3.39,8.51)4.31(1.58,7.04)<0.001注：该模型校正了性别、年龄、BMI、吸烟包年、饮酒状态和甘油三酯水平。26 华中科技大学博士学位论文2.5关于吸烟状态的亚组分析如表1.9所示，与不吸烟者相比，吸烟者尿样中具有更高浓度的钒、铁、钴、镍、铜、锌、砷、硒、铷、锶、镉、铯、铊、铅和汞，且差异具有统计学意义（P<0.05）。而铝、铬、锰、钡和铀的浓度分布在两组之间的差异不具有显著性意义（P>0.05）.表1.9非吸烟者与吸烟者中尿中肌酐校正金属浓度分布(N=823)非吸烟者吸烟者金属TPN=604N=219铝62.55(30.25-158.63)71.61(29.03-166.08)-0.430.667钒1.45(0.74-2.87)1.97(1.03-3.88)-3.82<0.001铬1.02(0.48-2.23)1.29(0.65-2.74)-1.490.136锰2.21(1.21-4.90)2.96(1.42-5.77)-1.760.079铁51.50(25.53-106.79)66.50(35.82-135.83)-2.630.009钴0.20(0.10-0.43)0.28(0.14-0.61)-3.120.002镍1.75(0.78-4.00)2.85(1.21-6.61)-4.44<0.001铜6.22(2.96-13.69)10.17(5.86-22.31)-5.46<0.001锌a0.24(0.11-0.63)0.57(0.24-1.46)-7.89<0.001砷23.42(11.21-51.58)38.74(18.53-79.25)-4.57<0.001硒17.17(8.52-37.35)27.57(12.75-52.29)-4.12<0.001铷a1.45(0.68-2.89)1.92(1.04-4.21)-3.79<0.001锶93.11(42.67-201.64)115.64(62.73-279.19)-3.060.002镉0.51(0.23-1.07)1.20(0.53-2.42)-7.86<0.001铯5.82(2.82-12.10)7.38(4.28-17.03)-3.440.001钡4.59(2.20-9.68)4.96(2.54-11.98)-1.150.251铊0.33(0.15-0.63)0.43(0.21-0.85)-3.420.001铅1.87(0.93-3.85)2.58(1.13-5.47)-2.510.012铀0.024(0.011-0.069)0.033(0.016-0.072)-1.660.097汞0.27(0.10-0.89)0.41(0.17-1.06)-2.650.008金属浓度表示为中位数（25th-75th），T为t检验统计量，N%>LOD为检出率。a锌和铷的浓度单位为mg/g，其他金属的单位为μg/g。27 华中科技大学博士学位论文在吸烟者中，除镍、铅、铀和汞外，其余的16种金属元素在尿中浓度都与高血压患病风险之间存在显著性或建议性的正关联（图1.3）。在使用FDR调整后，只有钒、铬、锰、铁、钴、铜、锌、砷、硒、铷、锶和铯与高血压患病风险在统计学水平上存在显著性关联（PFDR<0.05）。而在非吸烟者中，经过FDR调整后，没有发现有显著意义的关联（图1.4）。另外，在吸烟者中，锰、钡和铊浓度与收缩压存在显著性的正关联；而在非吸烟者中，铁浓度与收缩压和舒张压水平均存在显著性的正关联（Pfortrend<0.05）。但经过FDR调整后，上述关于血压水平的亚组分析结果均没有统计学意义。*P图1.3吸烟人群中金属暴露与高血压患病风险以及血压水平的关联结果（FDR<0.05）28 华中科技大学博士学位论文图1.4非吸烟人群中金属暴露与高血压患病风险以及血压水平的关联结果（*PFDR<0.05）29 华中科技大学博士学位论文3讨论本研究探讨了尿样中20种金属的内暴露水平与高血压患病风险以及血压水平的关联。结果显示，尿中钒、铁、锌和硒的浓度与研究对象的高血压患病风险存在剂量-反应正相关。随着钒、铁、锌和硒四分位数的增加，参与者的高血压患病风险也随之增加。另外，尿中汞的四分位数与舒张压之间也存在剂量-反应正相关。我们利用RCS模型对这些关联进行了剂量-反应关系曲线形状的研究，并进一步确认剂量-反应关系的存在。上述单金属模型中的关联与多金属模型中一致。越来越多的证据表明汞具有心血管毒性。汞可以通过增加氧化应激的产生和减少氧化应激的防御，导致线粒体和内皮功能障碍，从而引发高血压[62]。另外，汞可以通过肾功能不全和炎症而使血压升高[73]。尽管关于汞心血管毒性的流行病学研究结果存在差异，但大多数研究的结果与我们的研究保持一致，即高汞暴露能增加高血压的患病风险或者血压水平。Valera等人[29]对732位参与者进行了社区研究，发现血汞水平与收缩压水平有显著的相关性（β=2.14，P<0.001）。而且，当调整血中n-3脂肪酸、硒和其他混杂因素后，该关联保持不变。另外一项基于韩国6213名受试者的流行病学研究也得出类似的结论[74]。然而，Park等人[75]在一项美国人群研究中观察到尿汞与高血压呈现负相关关系（OR=0.87,95%CI：0.78，0.99），而血汞与高血压患病风险则无显著相关性（OR=0.94,95%CI：0.87，1.01）。这些研究结果之间的差异可能是由于研究对象暴露来源、暴露范围、样本类型、样本量和暴露估计方法同而导致的。尿汞可以反映体内汞负荷，是诊断汞中毒的指标，但不能反映体内甲基汞的暴露程度。因此，本研究结果只能提示无机汞和高血压与血压之间存在关联。考虑到甲基汞的强毒性，我们需要使用其他生物标志物（如发汞和趾甲汞）进一步研究汞暴露的不同形式与高血压患病风险的关联。铅、镉和砷是具有明确心血管效应的有毒金属[24;25;58;76;77]。然而，本研究结果并没有发现尿中铅与镉的暴露水平与高血压患病风险或血压水平存在关联，仅在砷暴露与高血压患病风险中发现微弱的关联，而此关联在随后的多金属模型中消失。砷可以通过氧化应激、炎症、内皮功能障碍和一氧化氮抑制而影响血压水平[18;78]。砷暴露与心血管疾病的关联受到了越来越多研究者的关注[79]。然而，水是无机砷的主要暴露来源，大多数研究仅将饮用水中的砷含量作为研究对象的暴露水平。在Abhyankar等人[80]的一项meta分析中，总共有11项关于砷暴露与血压水平的研究被纳入分析。其中有9个都是使用饮用水中的砷浓度间接反映人群的暴露水平，只有2个研究利用了人体生物样本估计砷的内暴露水平。采用外暴露标志物可能造成暴露评估的错误分类，降低暴露与效应之间的关联。相比于外暴露标志物，生物暴露标志物可以提供一个更为准确和综合的评估。本研究使用尿砷来反映砷在体内的水平。Wang等人[81]的研究结果与我们一致，在调整年龄、性别和吸烟等混杂因素后，他们发现头发中的砷含量与高血压患病风险的增加显著相关。镉的心血管毒性证据30 华中科技大学博士学位论文已经很充分，但是关于环境水平的镉暴露与高血压患病风险的关联研究不多，且结论存在争议。镉暴露除了通过氧化应激影响血压水平外，还可以竞争性抑制钙与钙调蛋白的结合，从而拮抗钙通道并增加血管收缩[18]。此外，镉暴露会损伤肾小管，通过钠潴留和肾容积的超负荷来增加血压水平[40;82]。吸烟是镉暴露的主要途径，也是高血压的危险因素。本研究根据吸烟状况分层，结果显示在吸烟者中，随着尿镉水平的增高，高血压患病风险也随之增加，此趋势具有建议性的统计学关联。根据研究结果，我们推测在尿镉和高血压患病风险的关联性研究中，利用吸烟状态进行分层分析比使用多元回归模型调整吸烟状态混杂效应的方法更真实可靠。在流行病学研究中，血样和尿样是评估镉内暴露水平的常用生物基质，分别用来反映近期暴露和长期的总暴露情况。本研究使用尿镉作为生物标志物可以准确地评估体内镉的蓄积水平。本研究发现必需金属硒、钒、铁和锌的暴露可能增加高血压的患病风险。与具有明确毒性的有害金属不同，必需金属在机体中具有重要的生理功能，并在各种生物过程中发挥关键作用[17;32;83]。然而，越来越多的证据表明，必需金属只有在一定范围内才会发挥其有益作用，过低或过高浓度的必需金属都会对机体产生健康威胁。一些必需金属（如钒、铁和锰）具有氧化还原活性，经过氧化还原反应后能够在生物系统中产生活性基群，例如超氧化物阴离子自由基和一氧化氮。这些金属的蓄积可能会引起炎症和内皮功能障碍，从而导致血压水平的升高以及高血压的发生[84]。据报道，高水平的硒和铁蓄积能使体内氧化应激生物标志物的浓度增加，表明其在氧化应激诱导中的重要作用[85;86]。在本研究中，尿中硒、钒、铁和锌浓度的中位值分别为19.0μg/g、1.62μg/g、56.0μg/g和0.30mg/g。在此水平下，高血压患病风险随着金属浓度的四分位数的增加而增加。但是，我们发现与硒的第一分位数相比，硒的第二、三和四分位数与高血压的患病风险没有统计学意义的关联。因此我们推断，目前国内普通人群中硒的暴露水平可能还不足以引起高血压的发病，但是其潜在的心血管效应仍需注意。其他流行病学的研究结果也支持了我们关于硒、铁和锌的暴露能够增加高血压患病风险的结论[60;87;88]。但是，目前尚无关于体内钒水平与高血压患病风险的相关研究。一般来说，尿金属并不是衡量必需金属体内暴露水平最可靠的生物标志物。例如，血清铁蛋白是一种细胞内的铁储存蛋白，是铁负荷的良好生物标志物；血浆硒能反应体内硒库的成分，是体内硒水平最常用的生物标志物[89;90]。据报道，尿中硒和锌的浓度与膳食补充和血液中的浓度具有相关性，因此尿样的浓度也能在一定程度上反映体内的硒和锌的内暴露水平[91;92]。此外，由于体内稳态环境和相应调节机制的存在，尿液中的必需金属含量不会发生太大的变化，因此尿液中过量的必需金属可能是由于体内金属稳态平衡的紊乱[89;90]。金属稳态一旦失衡，必需金属在体内的损失将会增加，影响其正常的生理功能。这一假设得到了Afridi等[33]研究的支持。他们的研究以健康人群为对照，发现高血压患者血液31 华中科技大学博士学位论文和毛发中的铜、铁和锌的水平显著降低，而尿液中铜、铁和锌的水平更高。与其他微量元素不同，锌在体内没有大量储存以便在耗竭的情况下补充调节，因而一旦损失过度可能会导致锌缺乏症的发生[92]。某些必需元素的缺乏被认为与高血压等心血管疾病的发生有关[93;94]。此外，这些必需金属的缺乏可能加剧诸如铅、镉、汞和砷等毒物的健康危害作用[61;62]。根据多金属模型的结果，本研究还发现尿中铬、铷和铀的浓度与高血压患病风险或血压水平有关。但应该指出的是，在单金属模型中我们并没有观察到这些关联。多金属模型可以帮助评估各种金属的共同影响，根据后退法找出联合作用下最强的金属，并为未保留在最终模型中的金属寻找最佳的替代标志物。但如果纳入的变量本身并不是所研究结局的独立风险因素，其通过多金属模型得出的效应估计值可能受到模型中其他变量的影响。因此，对于铬、铷和铀暴露与高血压患病风险的关联结论应该谨慎[34;95]。铬被认为是心血管疾病的保护元素。本研究结果显示的铬的危害作用可能是多种金属之间相互作用、测量误差或者是残余混杂而导致的不可靠结果，需要谨慎解读[34]。据报道，铷与钾具有相似的生化特性，因此可以推测铷对高血压的保护作用可能是通过钾的相关机制来实现[96]。然而，我们无法找到关于体内铷水平和血压值的相关研究。至于铀，我们的研究结果与Shiue等人[97]的研究结果类似，他们发现尿中铀的水平与高血压患病风险呈正相关，调整后的OR值为1.19（95%CI：1.02，1.38）。但是，其潜在的毒性机制尚不清楚。在本研究中，我们排除了与血压相关的各类疾病（如糖尿病，肾脏疾病，甲状腺疾病），将研究重点定为普通人群的环境金属的长期暴露。我们检测了尿液中20种金属的浓度，并应用多金属模型来拟合日常环境暴露的复杂性，探究了多种金属的联合效应。但是，本研究仍然存在一些不足。首先，我们的研究对象来自体检中心，可能导致选择偏倚。但由于这是一项探索性研究，我们应用这样的研究设计可以提高参与率，进一步的研究应该在社区人群中进行验证。其次，用单次尿液样本来测量金属的内部暴露水平，可能会导致暴露估计的偏差，因为尿样金属具有一定的变异性[98]。第三，使用同一份尿样同时测量20种金属元素有可能会导致测量误差，进而增加假阳性率，即使我们使用了FDR多重调整的方法。最后，本研究是一项探索性的横断面研究，其结果不能确定金属暴露与高血压或血压之间的因果关系，仍需进一步的前瞻性研究加以证实。4结论综上所述，本研究提示钒、铁、锌和硒的环境水平的暴露可能增加高血压的患病风险，而汞的环境暴露可能与舒张压的升高有关。尽管横断面研究难以明确金属暴露与高血压患病风险之间的因果关系，但这些研究结果表明与健康人群相比，高血压患者体内的金属稳态可能发生失衡。鉴于金属暴露在一般人群中的普遍性，本研究强调了一个值得重视的公共卫生问题，并为高血压的病因研究提供了重要的出发点。32 华中科技大学博士学位论文第二部分基因多态性-重金属暴露交互作用与高血压患病风险的关联研究重金属暴露与高血压患病风险之间的关联在动物实验和人群研究中已经证实。近年来有研究发现，基因的单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）可能对重金属的心血管效应产生修饰作用。然而，迄今为止，相关的研究（尤其是基于中国人群的研究）有限。研究表明，重金属主要通过氧化应激、炎症和血管内皮功能相关机制影响血压水平。其中，氧化应激是重金属暴露造成机体损伤的主要机制。一方面，氧化还原活性金属（如铅等）通过氧化还原循环反应，可以在生物系统中产生活性自由基[84]。另一方面，氧化还原惰性金属（如砷和镉等）虽然不能直接产生自由基，但可以通过间接机制诱导活性氧簇（reactiveoxygenspecies，ROS）的产生，并通过抑制抗氧化剂或替换蛋白质中的Fenton金属减少氧化防御[18;99]。过量的ROS能造成细胞损伤、线粒体功能障碍和脂质过氧化，最终导致高血压的发生。而且，重金属暴露还能够引起炎症反应或者损伤血管内皮。近来有研究发现，与炎症应激和内皮功能损伤相关的可溶性细胞间粘附分子1和可溶性血管细胞黏附分子-1在体内的循环浓度与砷暴露相关，且其合成基因（ICAM-1与VCAM-1）的基因多态性能够修饰砷暴露的心血管效应[57]。然而，尚无研究表明这两个基因的基因多态性在其他重金属的心血管效应中存在交互作用。此外，还有研究发现重金属代谢相关酶在重金属致高血压的过程中起到重要作用。例如，金属硫蛋白（metallothionein，MT）是富含半胱氨酸的金属结合蛋白，其巯基能与有毒金属产生强烈螯合作用。MT合成基因的基因多态性能影响MT的表达和解毒的效率，与多种重金属暴露的体内负荷都存在关联[100]。因此，我们推测氧化应激、炎症和血管内皮功能相关的基因的基因多态性可能会修饰重金属的致高血压作用。本部分研究选取了两个具有重要健康意义的重金属——镉和汞，以及与这两个重金属作用机制或代谢相关的9个基因的基因多态性进行分析探讨。在第一部分横断面研究中，尿汞浓度与舒张压水平之间存在显著的正相关关系，且在多金属模型中保持显著。而镉暴露与高血压患病风险只在吸烟人群中具有阳性关联，且该关联仅处于建议性水平（PFDR=0.092）。不过，由于研究设计本身存在不足，横断面研究中的研究对象具有较大的选择偏倚，加上一些混杂因素就算使用多因素回归校正也不能完全控制，所以横断面研究的循证医学证据级别不高，只能作为探索性研究提供研究线索。其结果需要在更高证据级别的病例对照或者队列研究中进行证实。此外，本部分的研究目的在于发现重要的基因-金属交互作用，因此并不要求纳入分析的金属和SNP与高血压患病风险之间存在显著关联，而是对两种重金属与36个SNP之间的交互作用均进行了分析。与一般的基于显著性33 华中科技大学博士学位论文主效应的方法相比，这种分析方法更容易在小样本人群研究中发现重要的环境-基因交互作用[101]。因此，考虑到镉和汞的重要心血管效应，本部分研究将镉和汞作为典型重金属纳入基因-重金属交互作用分析。本研究采用病例-对照的研究方法对基因多态性与高血压患病风险进行关联性研究，随后利用相加和相乘交互作用模型探讨目标基因的基因多态性与镉和汞的潜在交互作用对高血压患病风险的影响。1研究对象和方法1.1研究对象1.1.1研究对象及排除标准本研究于2015年5月至2017年7月期间在武汉市某综合医院的心血管内科进行高血压患者的招募工作。与此同时，在该医院的体检中心征集血压正常的健康个体，并根据年龄（±5岁）和性别对病例和对照进行频数匹配。病例与对照除血压状态外，其他纳入与排除标准一致。纳入与排除标准同第一部分第一节。1.1.2样本量计算利用Quanto1.2.4软件，选取1:1的病例对照设计进行基因-金属交互作用分析所需样本量的计算。计算参数如下：中国人群高血压患病率为25.2%；根据Hapmap数据库上中国汉族人群中的MAF结果，本部分候选SNP的MAF在0.055-0.488之间；按照对照组三分类的方法将第三分位的对照组设定为重金属的暴露组，即对照组中重金属的暴露率为33.3%；根据第一部分中汞在第四分位中的OR值，设定ORE=1.53；根据之前关于eNOS基因多态性在中国汉族人群的报道[102]，设定ORG=1.32；因为中国人群中还没有关于镉或汞心血管毒性的基因-环境交互作用研究，本研究根据国外的相关文献[103]，设定ORGE=3.7；设定α=0.05，power=0.80。计算得出交互作用研究的所需样本量为485对；本次研究最终纳入497例原发性高血压患者和497例健康对照，满足研究目的所需。1.1.3流病学资料收集同第一部分第一节。1.1.4血压检测和高血压诊断同第一部分第一节。1.3尿样的采集与分析同第一部分第一节。1.4血样的采集与分析1.4.1血样的采集高血压患者在经过一晚的禁食后，于第二天早晨在病房由护士按标准操作使用真空采血管采集外周静脉血5mL；健康对照在经过一晚的禁食后，于第二天早晨在体检中心由护34 华中科技大学博士学位论文士按标准操作采用促凝试管采集外周静脉血5mL。全血采集后置于4°C冰箱中保存，并于一周内进行DNA的提取。1.4.2DNA的提取1.4.2.1主要仪器恒温水浴锅（HH420，绍兴茂祥）；常温离心机（Neogfuge13，上海力康）；微量核酸测定仪（ND-1000，美国Thermo公司）；高压灭菌锅（SX-500，日本TOMY公司）；涡旋混匀器（MX-E，美国SCILOGEX公司）。1.4.2.2主要试剂无水乙醇（分析纯，上海国药）；异丙醇（分析纯，上海国药）；DNA提取试剂盒（天根生化公司，DP319）。1.4.2.3DNA提取步骤本实验中使用的所有耗材均经过高压灭菌（121°C，30min）。取600μL全血，采用溶液盐析法进行全基因组DNA的提取，主要步骤为裂解、消化、沉淀、漂洗和溶解。DNA提取后置于4°C冰箱中保存，一周内使用微量核酸测定仪对其浓度与纯度进行检测。本实验中对DNA样本的要求为：OD值在1.8-2.0之间，浓度在50-100ng/µL之间，总量不少于300ng。对纯度不够或浓度过小的样本进行重新提取，对浓度过高的样本进行稀释。质量合格的DNA样本置于-80°C冰箱中长期保存。1.4.2.4易感基因多态性位点的选择本研究中的候选基因包括三类：（1）氧化应激相关：eNOS和CAT；（2）炎症或血管内皮损伤相关：ICAM-1和VCAM-1；（3）重金属代谢过程相关：MT2A、MT1A、CYP1A1、CYP11B2和GSTP1。基因候选SNP的选择基于功能性SNP、热点SNP和标签SNP。热点SNP的选取根据相关文献报道，并结合近5年的高血压相关的GWAS研究，选取功能性的或者还未被验证的阳性位点作为候选位点。标签SNP的筛选通过从HAPMAP数据库中下载以候选基因为中心的上下游2kb区域的中国汉族人群基因型信息（HapMapGenomeBrowserrelease#27，ChineseHanpopulation），并将其导入HaploView4.2中进行。筛选的条件为r2>0.8和最小等位基因频率（minorallelefrequency，MAF）≥0.05，并优先选择功能性SNP。最终，本研究共选择了36个SNP，其中eNOS基因15个、CAT基因10个、ICAM-1基因1个、VCAM-1基因1个、MT2A基因3个、MT1A基因2个、CYP1A1基因2个、CYP11B2基因1个和GSTP1基因1个。1.5基因分型1.5.1基因分型方法本研究基因多态性的检测委托上海天昊生物科技有限公司应用SNPscanTM分型技术进行分析。SNPscanTM高通量SNP分型技术的基本原理是采用连接酶连接反应的高特异性实35 华中科技大学博士学位论文现对SNP位点等位基因的识别，然后通过在连接探针末段引入不同长度的非特异序列以及通过连接酶加接反应获得位点对应的不同长度连接产物，利用标记荧光的通用引物对连接产物进行PCR扩增，通过荧光毛细管电泳对扩增产物进行电泳分离。本实验中使用ABI3730XL测序仪进行SNP分型，收集的原始数据用GeneMapper4.1来分析，方法分析原理如图2.1所示：图2.1SNPscanTMSNP分型原理图1.5.2DNA样本质量检测对所有的样本使用琼脂糖凝胶电泳法进行浓度与纯度的检测，合格的标准为DNA条带清晰、单一、无拖尾、弥散现象。对不合格的样本进行重新送样检测，以保证基因分型结果的准确性。1.5.3分型结果质量控制本实验中对分型结果进行双盲样本质控和阴性对照质控，双盲样本质控中结果一致为36 华中科技大学博士学位论文合格，阴性对照质控中阴性对照无条带为合格。1.6统计方法采用描述性统计分析对参与者的人口特征进行描述，采用参数或非参数方法比较高血压和非高血压组之间的连续或分类变量的统计学差异性。使用卡方检验对健康对照人群的基因型进行Hardy-Weinberg平衡检验，P≥0.05认为群体基因遗传平衡。采用多因素Logistic回归模型分别在共显性遗、显性、隐性和加性模型中对SNP与高血压患病风险进行关联性研究，校正的混杂因素包括年龄、性别、BMI、吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平。此外，对每个基因内的位点进行连锁不平衡（linkagedisequilibrium，LD）分析，寻找具有较强关联性的单倍型块（haplotypeblock），并对这些单倍型块进行单倍型分析。本部分的分析在Gplink2.05和Haploview4.2软件中进行。重金属暴露与高血压患病风险的关联分析过程与第一部分一致。在重金属-基因的交互作用分析中，我们使用重金属M和基因G两个因素及乘积项构建Logistic回归模型，如下：f(Y)=β0+βMM+βGG+βMGM×G+βiXi;式中β0为常数项，βM为与重金属暴露相关的效应值，M为以尿中肌酐校正的重金属浓度（连续变量），βG为与基因相关的效应值，G为基因型（二分类变量），βMG为与重金属-基因交互作用相关的效应值，M×G为重金属-基因的交叉乘积项，βi为模型i中的混杂因素效应值，Xi为模型i中的混杂因素。为了提高检验效力，本分析中均使用显性基因模型。在交互作用分析中，对于一个位点，其主要等位基因为A，次要等位基因为a，其“风险”基因型的定义如下：当βMG>0，提示重金属与SNP的交互作用为协同作用时，其风险基因型定义为Aa+aa；当βMG<0，提示重金属与SNP的交互作用为拮抗作用时，则其风险基因型定义为AA[104]。利用多元Logistic回归计算以下OR值：（1）在非风险基因型的人群中重金属浓度加倍所引起的高血压患病风险为OR10，即exp（βM）；（2）风险基因的独立作用所引起的高血压患病风险OR01，即exp（βG）；（3）在风险基因型中的人群中，重金属浓度加倍所引起的高血压患病风险OR11，即exp（βM+βG+βMG）。上述多元Logistic回归模型中均校正了与高血压患病和重金属暴露相关的混杂因素，包括年龄、性别、BMI、吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平。本研究对每个SNP与重金属暴露浓度的交叉乘积项的回归系数βMG进行检验，用以评估重金属-基因的相乘交互作用。此外，使用错误发现率校正（FDR）的方法对本研究中的36项假设进行假阳性率的控制[72]。根据Assmann[105]的建议，本研究使用Bootstrap法计算用于评价相加交互作用的指标——交互作用超额相对危险度（relativeexcessriskofInteraction，RERI），并对存在相加交互作用的关联计算其交互作用归因百分比（attributableproportions，AP），公式如下：RERI=OR11–(OR10+OR01-1)；37 华中科技大学博士学位论文AP=RERI/OR11。若RERI和AP的95%置信区间不包括0，则认为两因素有相加交互作用；RERI和AP的绝对值越大，两因子间的交互作用就越强。本研究的统计分析主要在SPSS22.0中进行，统计检验均为双侧检验，P<0.05被认为有统计学意义，P<0.10被认为有建议性的统计学意义。2.结果2.1研究人群的基本特征研究人群的基本信息如表2.1所示。本研究中共纳入994名参与者，其中包含497个高血压病例与497个健康对照。高血压组和非高血压组中的男性比例均为56.1%。高血压组的平均年龄为56.33±7.62岁，非高血压组的平均年龄为57.06±8.42岁，两组之间的年龄分布无统计学意义（P=0.153）。高血压组的吸烟率和饮酒率高于非高血压组，差异存在统计学意义（P<0.001）；非高血压组的收入情况和教育情况高于高血压组，差异存在统计学意义（P<0.001）。两组之间的BI、收缩压、缩张压和脉压差存在显著差异（P<0.001）。表2.1研究人群基本信息(N=994)非高血压组高血压组变量PN=497N=497年龄，岁56.33±7.6257.06±8.420.153性别，N(%)NA男性279(56.2)279(56.1)女性218(43.8)218(43.9)吸烟状态，N(%)<0.001从不吸烟374(75.3)328(66.0)现在吸烟98(19.7)106(21.3)以前吸烟25(5.0)63(12.7)饮酒状态，N(%)<0.001从不饮酒325(65.4)284(57.2)现在饮酒159(32.0)172(34.6)以前饮酒13(2.6)41(8.2)收入情况，N(%)<0.001<2000元/月19(3.8)128(25.7)2000-4999元/月196(39.4)213(42.9)5000-9999元/月231(46.5)129(26.0)>9999元/月51(10.3)27(5.4)38 华中科技大学博士学位论文表2.1续研究人群基本信息(N=994)非高血压组高血压组变量PN=497N=497教育情况，N(%)<0.001≤小学13(2.6)71(14.3)初中48(9.7)95(19.1)高中、中专112(22.5)150(30.2)≥大学、大专324(65.2)181(36.4)吸烟包年数5.47±12.187.40±13.280.017BMI，kg/m223.15±2.7724.61±3.04<0.001收缩压，mmHg121±12.0141±16.9<0.001舒张压，mmHg75±8.587±11.2<0.001脉压差，mmHg45±9.854.7±13.8<0.0012.2基因多态性与高血压患病风险的关联性研究2.2.1候选SNP信息36个候选SNP的位置、区域等信息如表2.2所示。本研究中，对照组中候选SNP的最小等位基因频率（minorallelefrequency，MAF）在0.058-0.499之间。对照组中的Hardy-Weinberg平衡检验结果显示Hardy-Weinberg平衡定律拟合优度良好，处于遗传平衡状态，提示样本人群具有良好的代表性。表2.2候选SNP基本信息表SNP位置区域（功能）AllelMAF1MAF2PHWEeNOS7q36.1rs1007311150696008intron7A/G0.4880.4990.209rs1008140150705610intron17C/T0.1250.1150.825rs117714431506876875'neargeneT/C0.4090.4120.356rs1541861150697333intron9C/A0.2930.2920.587rs1549758150695726exon7(p.Asp258Asp)T/C0.1750.1771.000rs1799983150696111exon8(p.Asp298Glu)T/G0.1010.0970.204rs2256314150708850intron23G/A0.2490.2400.325rs2566508150700515intron14G/T0.2880.2890.383rs2566511150703041intron14T/C0.3780.3900.511rs2853796150703915intron15G/T0.3940.4050.642rs3918174150697294intron9G/A0.0910.0990.804rs3918196150705842intron17A/G0.1820.1930.774rs3918227150700946intron14A/C0.0640.0570.67139 华中科技大学博士学位论文表2.2续候选SNP基本信息表SNP位置区域（功能）AllelMAF1MAF2PHWEeNOS7q36.1rs7830150709571intron24T/G0.3720.3690.772rs891511150704843intron17G/A0.4370.4300.583CAT11p13rs1048873634489252intron10T/C0.2490.2390.902rs1049982344605415'UTRC/T0.2940.2850.661rs1103270134462778intron1C/T0.2960.2980.915rs1788184634475918intron6A/G0.0550.0580.398rs228436634484743intron9T/C0.0630.0660.154rs228436734484542intron9C/T0.4850.4990.788rs475537434486604intron10C/A0.1860.1951.000rs55192934487192intron10T/G0.2370.2270.609rs769214344597175'neargeneA/G0.2920.2840.581rs76921834470679intron1A/G0.4840.4981.000VCAM-11p21.2rs3176867101194205intron4T/C0.1620.1700.874ICAM-119p13.2rs28143210390658intron2G/C0.3120.3150.300CYP11B28q24.3rs17999981439996005'neargeneG/A0.2790.2790.823GSTP111q13.2rs169567352689exon5(p.Ile105Val)G/A0.1850.1790.541CYP1A115q24.1rs464642175016192intron1A/G0.4010.4130.853rs4646903750116413'neargeneG/A0.4030.4140.644MT1A16q13rs1107616156673148intron1A/G0.3280.3370.270rs8060569566711405'neargeneC/T0.0870.0880.782MT2A16q13rs10636566433433'UTRC/G0.2870.2930.828rs1610216566422845'neargeneA/G0.3640.3720.250rs28366003566424915'UTRG/A0.1160.1160.128注：Allel为等位基因，格式为“次要等位基因/主要等位基因”；MAF1为该SNP在Hapmap数据库上中国汉族人群中的MAF；MAF2为该SNP在本研究中对照人群的MAF；PHWE为对照人群的Hardy-Weinberg平衡检验，PHWE>0.05提示样本人群处于遗传平衡状态。2.2.2eNOS基因多态性与高血压患病风险的关联40 华中科技大学博士学位论文本研究一共选取eNOS基因中的15个SNP进行研究，各SNP的基因型分布情况及关联分析结果如表2.3所示。eNOS基因中15个SNP的3种基因型在高血压组和非高血压组中的分布差异不具有统计学意义（P>0.05）。rs1008140位点与高血压患病风险在共显性模型和显性模型中均存在显著性的关联。在共显性模型中，与GG基因型的人群相比，具有杂合子基因型GA的人群高血压的患病风险提高了42%（OR=1.42，95%CI：1.01，1.99）（P=0.044）；在显性模型中，与GG基因型的人群相比，具有突变等位基因的人群的患病风险提高了40%（OR=1.40，95%CI：1.01，1.95）（P=0.047）。此外，rs1008140位点与高血压患病风险在加性模型中存在建议性水平的关联，提示每增加1个rs1008140位点的风险等位基因A，高血压的患病风险将增加33%（OR=1.33，95%CI：0.98，1.79）（P=0.066）。rs3918196位点与高血压患病风险在共显性模型、显性模型和加性模型中均存在建议性的关联，提示rs3918196位点的等位基因A对高血压具有保护作用。在共显性模型中，与GG基因型的人群相比，具有杂合子基因型GA的人群高血压患病风险降低了24%（OR=0.76,，95%CI：0.56，1.04）（P=0.090）。表2.3eNOS基因多态性与高血压患病风险的关联分析SNP基因型病例对照PaOR(95%CI)bPbrs1007311GG1401320.5771.00GA2402340.98(0.70,1.37)0.888AA1171310.80(0.54,1.18)0.262显性模型0.91(0.67,1.25)0.569隐性模型0.81(0.59,1.13)0.212加性模型0.90(0.74,1.09)0.271rs1008140TT3693900.2761.00TC1211001.42(1.01,1.99)0.044CC771.17(0.38,3.64)0.784显性模型1.40(1.01,1.95)0.047隐性模型1.08(0.35,3.34)0.892加性模型1.33(0.98,1.79)0.066rs11771443CC1811670.3761.00CT2292510.79(0.57,1.08)0.132TT87790.99(0.65,1.50)0.967显性模型0.84(0.62,1.12)0.234隐性模型1.14(0.78,1.66)0.502加性模型0.95(0.78,1.17)0.647rs1541861AA2422520.4761.00AC2172001.06(0.79,1.42)0.693CC38450.85(0.51,1.44)0.55741 华中科技大学博士学位论文表2.3续-1eNOS基因多态性与高血压患病风险的关联分析SNP基因型病例对照PaOR(95%CI)bPbrs1541861显性模型1.02(0.77,1.36)0.870隐性模型0.83(0.50,1.38)0.477加性模型0.98(0.79,1.22)0.854rs1549758CC3373360.9631.00CT1421460.90(0.66,1.23)0.500TT14150.93(0.41,2.08)0.858显性模型0.90(0.67,1.22)0.505隐性模型0.96(0.43,2.14)0.919加性模型0.92(0.71,1.19)0.536rs1799983GG3984060.7611.00GT91821.00(0.69,1.45)0.987TT771.16(0.37,3.64)0.800显性模型1.01(0.71,1.45)0.953隐性模型1.16(0.37,3.63)0.799加性模型1.02(0.74,1.40)0.908rs2256314AA2732910.4541.00AG1921731.11(0.82,1.50)0.493GG32330.97(0.55,1.70)0.907显性模型1.09(0.82,1.44)0.575隐性模型0.93(0.53,1.62)0.790加性模型1.04(0.83,1.31)0.730rs2566508TT2472470.9921.00TG2142130.94(0.70,1.26)0.668GG36371.12(0.65,1.95)0.677显性模型0.96(0.73,1.28)0.799隐性模型1.16(0.68,1.97)0.591加性模型1.00(0.80,1.25)0.984rs2566511CC1961810.4981.00CT2392440.91(0.67,1.23)0.549TT62720.83(0.53,1.30)0.420显性模型0.89(0.67,1.19)0.448隐性模型0.88(0.58,1.32)0.533加性模型0.91(0.74,1.12)0.387rs2853796TT1861780.4821.00TG2372340.88(0.64,1.19)0.400GG70840.80(0.52,1.22)0.300显性模型0.86(0.64,1.15)0.297隐性模型0.86(0.58,1.27)0.446加性模型0.89(0.73,1.09)0.26042 华中科技大学博士学位论文表2.3续-2eNOS基因多态性与高血压患病风险的关联分析SNP基因型病例对照PaOR(95%CI)bPbrs3918174AA4184040.5001.00AG75880.84(0.58,1.24)0.385GG450.78(0.20,3.09)0.724显性模型0.84(0.58,1.22)0.361隐性模型0.80(0.20,3.17)0.756加性模型0.85(0.61,1.20)0.361rs3918196GG3423220.4041.00GA1401580.76(0.56,1.04)0.090AA15170.77(0.35,1.72)0.529显性模型0.76(0.57,1.03)0.079隐性模型0.84(0.38,1.86)0.663加性模型0.80(0.62,1.04)0.098rs3918227CC4254420.3191.00CA67531.20(0.78,1.85)0.409AA120.78(0.07,8.92)0.838显性模型1.19(0.78,1.83)0.420隐性模型0.76(0.07,8.74)0.825加性模型1.16(0.77,1.74)0.479rs7830GG1941990.9461GT2302270.76(0.07,8.74)0.825TT71691.13(0.73,1.73)0.594显性模型1.06(0.80,1.42)0.675隐性模型1.10(0.74,1.64)0.645加性模型1.06(0.86,1.30)0.595rs891511AA1521650.6751AG2482371.13(0.82,1.55)0.466GG96951.11(0.74,1.66)0.626显性模型1.12(0.83,1.52)0.456隐性模型1.03(0.72,1.47)0.873加性模型1.06(0.87,1.29)0.563a结果由卡方检验得出。b该模型校正年龄、性别、BMI、吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平。eNOS基因的连锁不平衡检验结果见图2.2，15个SNP之间的D’在0.062-1.000之间，r2在0.002-0.646之间。eNOS基因存在1个覆盖5kb区域的单倍型块，该单倍型块从位于intron9的rs3918174开始，到位于inron14的rs2566511结束，共包含5个候选SNP。随后，对这个单倍型块进行单倍型分析，结果如表2.4所示。在HaploView软件中，这5个SNP总共能拟合出5种单倍体型。在病例中的频率为6.9%-33.2%，在对照组中的频率为5.7%-31.9%。Logistic回归分析结果未发现这5种单倍型与高血压患病风险存在关联。43 华中科技大学博士学位论文图2.2eNOS基因的连锁不平衡分析表2.4eNOS基因单倍型分析单倍型病例（N%）对照（N%）OR(95%CI)PAATCC330(33.2)317(31.9)模型11.06(0.88,1.28)0.534模型21.08(0.87,1.33)0.490ACTCC223(22.4)229(23.0)模型10.97(0.78,1.19)0.748模型20.94(0.74,1.19)0.623GATCT76(7.6)97(9.8)模型10.77(0.56,1.05)0.096模型20.76(0.54,1.09)0.136ACTAC69(6.9)57(5.7)模型11.23(0.85,1.76)0.270模型21.15(0.77,1.72)0.504AAGCT281(28.3)282(28.4)模型11.00(0.82,1.21)0.960模型20.99(0.80,1.24)0.956注释：模型1中没有校正混杂因素；模型2中校正了年龄、性别、BMI、吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平。44 华中科技大学博士学位论文2.2.2CAT基因多态性与高血压患病风险的关联本研究一共选取CAT基因的10个SNP进行研究，各SNP的基因型分布情况及关联分析结果如表2.5所示。CAT基因中10个SNP的3种基因型在高血压组和非高血压组中的分布差异不存在统计学意义（P>0.05）。rs551929位点与高血压患病风险在加性模型中存在建议性的关联。在加性模型中，每增加1个rs551929位点的风险等位基因T，高血压的患病风险将增加25%（OR=1.25，95%CI：0.99，1.59）（P=0.065）。表2.5CAT基因多态性与高血压患病风险的关联性分析SNP基因型病例对照PaOR(95%CI)bPbrs10488736CC2732880.6261.00CT1921801.04(0.78,1.40)0.781TT32291.04(0.56,1.90)0.911显性模型1.04(0.78,1.38)0.783隐性模型1.02(0.56,1.85)0.954加性模型1.03(0.82,1.30)0.800rs1049982TT2402520.6651.00TC2132071.06(0.79,1.42)0.703CC44381.17(0.69,1.98)0.570显性模型1.08(0.81,1.42)0.617隐性模型1.14(0.68,1.90)0.626加性模型1.07(0.86,1.34)0.543rs11032701TT2382440.5741.00TC2202101.01(0.75,1.36)0.945CC35430.88(0.52,1.51)0.651显性模型0.99(0.75,1.31)0.951隐性模型0.88(0.52,1.48)0.626加性模型0.97(0.78,1.21)0.790rs17881846GG4484390.1071.00GA4658NAAA30NA显性模型0.92(0.59,1.44)0.717隐性模型NA加性模型0.97(0.63,1.49)0.885rs2284366CC4394310.4211.00CT5766NATT10NA显性模型0.91(0.60,1.38)0.653隐性模型NA45 华中科技大学博士学位论文表2.5续CAT基因多态性与高血压患病风险的关联性分析SNP基因型病例对照PaOR(95%CI)bPbrs2284366加性模型0.93(0.61,1.41)0.725rs2284367TT1331230.3991.00TC2562520.82(0.58,1.15)0.254CC1041220.73(0.49,1.09)0.122显性模型0.79(0.57,1.09)0.153隐性模型0.83(0.59,1.16)0.271加性模型0.85(0.70,1.04)0.118rs4755374AA3393220.5151.00AC1401560.81(0.60,1.11)0.190CC18190.84(0.39,1.81)0.655显性模型0.82(0.61,1.10)0.182隐性模型0.89(0.42,1.92)0.774加性模型0.85(0.66,1.10)0.214rs551929GG2822940.4771.00GT1841801.21(0.90,1.63)0.211TT31231.69(0.89,3.20)0.108显性模型1.26(0.95,1.68)0.111隐性模型1.57(0.84,2.94)0.161加性模型1.25(0.99,1.59)0.065rs769214GG2422520.6651.00GA2102081.03(0.77,1.38)0.840AA44371.18(0.69,2.02)0.538显性模型1.05(0.79,1.40)0.720隐性模型1.17(0.70,1.95)0.559加性模型1.06(0.85,1.33)0.591rs769218GG1341250.3881.00GA2572480.86(0.61,1.20)0.366AA1051230.75(0.50,1.12)0.157显性模型1.05(0.79,1.40)0.720隐性模型0.83(0.59,1.16)0.272加性模型0.86(0.71,1.06)0.156a结果由卡方检验得出。b该模型校正了年龄、性别、BMI、吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平。CAT基因中的连锁不平衡检验结果见图2.3，10个SNP之间的D’在0.825-1.000之间，r2在0.004-0.993之间。此10个SNP之间存在连锁不平衡，在CAT基因中形成了1个覆盖了29kb区域的单倍型块。该单倍型块从位于5’neargene区域的rs769214开始，到位于46 华中科技大学博士学位论文intron10的rs10488736结束。单倍型分析的结果如表2.6所示，这10个SNP总共能拟合出8种单倍体型，在病例中的频率为0.4%-29.1%，在对照中的频率为0.4%-29.3%。多元Logistic回归分析结果显示CTACTGTAGC单倍型与高血压患病风险有关，此关联在校正了潜在混杂因素后依然存在。与其他单倍型相比，具有CTACTGTAGC单倍型的个体高血压患病风险提高了7.99倍（OR=7.99，95%CI：2.50，25.52）（P<0.001）。图2.3CAT基因的连锁不平衡分析表2.6CAT基因的单倍型分析单倍型病例（N%）对照（N%)OR(95%CI)PTTGCGACCGC175(17.6)191(19.2)模型10.90(0.72,1.13)0.355模型20.86(0.66,1.11)0.249TTGCTGTAGC165(16.6)149(15.0)模型11.13(0.89,1.44)0.325模型21.23(0.93,1.61)0.143TTGTTGTAGC59(5.9)65(6.5)模型10.90(0.63,1.30)0.578模型20.95(0.63,1.42)0.800CTACGGTAAT51(5.1)57(5.7)模型10.89(0.60,1.31)0.553模型20.98(0.64,1.51)0.924TCGCGACAGC289(29.1)291(29.3)模型10.99(0.82,1.20)0.921模型20.98(0.79,1.22)0.888CTACGGTAGT204(20.5)178(17.9)模型11.18(0.95,1.48)0.139模型21.07(0.83,1.37)0.61947 华中科技大学博士学位论文表2.6续CAT基因的单倍型分析单倍型病例（N%）对照（N%)OR(95%CI)PCTACTGTAGC19(1.9)4(0.4)模型14.82(1.63,14.23)0.004模型27.99(2.50,25.52)<0.001CTACGGTAGC25(2.5)39(3.9)模型10.63(0.38,1.05)0.078模型20.69(0.39,1.22)0.197注释：模型1中没有校正混杂因素；模型2中校正了年龄、性别、BMI、吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平。2.2.3其他基因多态性与高血压患病风险的关联本研究一共选取ICAM-1基因中的1个SNP、VCAM-1基因中的1个SNP、MT2A基因中的3个SNP、MT1A基因中的2个SNP、CYP1A1基因中的2个SNP、CYP11B2基因中的1个SNP和GSTP1基因中的1个SNP进行研究，各SNP的基因型分布情况及关联分析结果如表2.7所示。本次分析中11个SNP中的3种基因型在高血压组和非高血压组中的分布差异不存在统计学意义（P>0.05）。在11个SNP的各个基因模型中均没有发现显著性或建议性统计学关联。表2.7其他基因多态性与高血压患病风险的关联性分析SNP基因型病例对照PaOR(95%CI)bPbVCAM-11p21.2rs3176867CC3513430.4261.00CT1331390.89(0.65,1.22)0.460TT9150.52(0.20,1.37)0.186显性模型0.85(0.63,1.16)0.307隐性模型0.54(0.21,1.41)0.208加性模型0.84(0.64,1.10)0.202CYP11B28q24.3rs1799998AA2602570.8411.00AG1962031.03(0.77,1.39)0.837GG41371.02(0.60,1.75)0.934显性模型1.03(0.78,1.37)0.841隐性模型1.01(0.60,1.70)0.971加性模型1.02(0.82,1.27)0.860GSTP111q13.2rs1695AA3253370.7031.00AG1541421.17(0.85,1.59)0.334GG18181.07(0.51,2.28)0.852显性模型1.15(0.86,1.55)0.344隐性模型1.02(0.49,2.16)0.95048 华中科技大学博士学位论文表2.7续-1其他基因多态性与高血压患病风险的关联性分析SNP基因型病例对照PaOR(95%CI)bPbrs1695加性模型1.11(0.86,1.43)0.408CYP1A115q24.1rs4646421GG1801700.4941.00GA2472440.90(0.66,1.23)0.523AA70830.83(0.54,1.28)0.405显性模型0.89(0.66,1.19)0.424隐性模型0.88(0.59,1.31)0.534加性模型0.91(0.74,1.12)0.374rs4646903AA1781680.5831.00AG2472470.87(0.64,1.19)0.373GG71820.83(0.54,1.28)0.407显性模型0.86(0.64,1.16)0.316隐性模型0.90(0.61,1.34)0.615加性模型0.90(0.73,1.11)0.333MT1A16q13rs11076161GG2352240.6581.00GA2082110.94(0.70,1.27)0.682AA54620.85(0.54,1.35)0.493显性模型0.92(0.69,1.22)0.560隐性模型0.88(0.57,1.36)0.558加性模型0.93(0.75,1.14)0.480rs8060569TT4194140.5291.00TC71790.75(0.51,1.11)0.153CC741.61(0.43,6.08)0.483显性模型0.79(0.54,1.16)0.232隐性模型1.69(0.45,6.35)0.441加性模型0.86(0.61,1.21)0.387MT2A16q13rs10636GG2622470.5071.00GC1912090.87(0.65,1.17)0.356CC44410.96(0.58,1.60)0.886显性模型0.89(0.67,1.17)0.400隐性模型1.02(0.62,1.68)0.927加性模型0.94(0.75,1.16)0.542rs1610216GG2082020.6581.00GA2242200.98(0.72,1.33)0.894AA65750.96(0.63,1.47)0.851显性模型0.97(0.73,1.30)0.856隐性模型0.97(0.65,1.45)0.88249 华中科技大学博士学位论文表2.7续-2其他基因多态性与高血压患病风险的关联性分析SNP基因型病例对照PaOR(95%CI)bPbMT2A16q13rs1610216加性模型0.98(0.80,1.20)0.842rs28366003AA3823850.9251.00AG1071090.89(0.63,1.25)0.503GG431.46(0.30,7.16)0.641显性模型0.91(0.65,1.27)0.567隐性模型1.49(0.30,7.32)0.621加性模型0.93(0.68,1.28)0.658ICAM-119p13.2rs281432CC2382280.6061.00CG2102250.93(0.69,1.25)0.634GG49440.94(0.57,1.55)0.809显性模型0.93(0.70,1.24)0.620隐性模型0.97(0.60,1.57)0.914加性模型0.95(0.77,1.19)0.673a结果由卡方检验得出。b该模型校正了年龄、性别、BMI、吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平。2.3重金属暴露与基因多态性的交互作用分析2.3.1重金属分布情况与关联性分析非高血压组和高血压组的尿镉与尿汞的浓度分布如表2.8所示。两组之间的尿肌酐不存在差异（P=0.433）。未使用肌酐校正的尿镉浓度在高血压组中高于非高血压组（P<0.001）；肌酐校正后的尿镉浓度在两组之间不存在显著性差异（P=0.215）。两组之间尿中汞的分布在肌酐校正前后都不存在显著性差异（P>0.05）。本部分研究中重金属暴露与高血压患病风险的关联性分析结果如表2.9所示。镉暴露与高血压患病风险在模型1中存在建议性的关联（P=0.050），在模型2和模型3中存在显著性的关联（P<0.05）。当校正其他混杂因素后，尿中镉浓度加倍能使高血压患病风险增加12%（OR=1.12，95%CI：1.02，1.24）（P=0.021）。而汞暴露与高血压患病风险在3个模型中均不存在显著性关联。50 华中科技大学博士学位论文表2.8尿中重金属浓度分布非高血压组高血压组重金属PGMMedian(25th-75th)GMMedian(25th-75th)尿肌酐（g/L）1.081.31(0.66-1.96)1.181.42(0.76-2.07)0.433肌酐未校正（μg/L)镉0.760.80(0.44-1.35)0.940.93(0.51-1.64)<0.001汞0.430.46(0.17-1.43)0.480.57(0.25-1.05)0.633肌酐校正(μg/g)镉0.700.70(0.43-1.10)0.800.69(0.36-1.66)0.215汞0.390.34(0.15-1.06)0.410.42(0.18-1.00)0.812GM，几何平均值；Median，中位数。表2.9重金属暴露与高血压患病风险的关联性分析模型1模型2模型3金属OR(95%CI)POR(95%CI)POR(95%CI)P镉1.09(1.00,1.18)0.0501.13(1.03,1.23)0.0101.12(1.02,1.24)0.021汞1.02(0.95,1.08)0.6511.02(0.96,1.09)0.5261.03(0.95,1.10)0.507注释：模型1中没有校正混杂，模型2中校正了年龄、性别与BMI，模型3中在模型2的基础上校正了吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平。2.3.2镉暴露与基因多态性的交互作用表2.10为不同基因型的人群中镉暴露与高血压患病风险的关联性分析结果，以及镉暴露与基因多态性的交互作用分析结果。在eNOS基因的rs1008140中，镉暴露与高血压患病风险在TC和CC基因型的人群中不存在关联，但在TT基因型的人群中存在显著关联。TT基因型人群的镉暴露浓度每增加一倍，其高血压患病风险增加12%（OR=1.12，95%CI:1.01，1.25）（P=0.039）。以TC和CC基因型为对照，TT基因型的单独效应与高血压患病风险之间不存在显著关联。RERI为0.35（95%CI：0.03，0.68），提示该位点与镉暴露之间存在相加交互作用，其联合作用大于两因素的单独作用。在镉暴露浓度加倍所导致的高血压患病风险中，有31.4%（95%CI：5.4%，61.8%）可以归因于镉暴露与rs1008140位点之间的交互作用。但是，该位点与镉暴露之间不存在相乘交互作用（PFDR=0.968）。在eNOS基因的rs2566508中，镉暴露与高血压患病风险在TT基因型的人群中不存在关联，但在TG和GG基因型的人群中则存在显著关联。TG和GG基因型人群的镉暴露浓度每增加一倍，其高血压患病风险增加23%（OR=1.23，95%CI：1.07，1.42）（P=0.004）。51 华中科技大学博士学位论文以TT基因型为对照，TG和GG基因型的单独效应与高血压患病风险之间不存在显著关联。该位点的多态性与镉暴露之间存在相乘交互作用（P交互=0.026），但经过FDR校正后，此交互作用不具有统计学意义（PFDR=0.485）。该位点与镉暴露之间不存在相加作用。在eNOS基因的rs2566511中，镉暴露与高血压患病风险在CC基因型的人群中不存在关联，但在CT和TT基因型的人群中存在显著关联。CT和TT基因型人群的镉暴露浓度每增加一倍，其高血压患病风险增加24%（OR=1.24，95%CI：1.09，1.40）（P=0.001）。以CC基因型为对照，CT和TT基因型与高血压患病风险之间不存在显著关联。该位点的多态性与镉暴露之间存在相乘交互作用（P交互=0.008），但经过FDR校正后，此交互作用不具有统计学意义（PFDR=0.295）。该位点与镉暴露之间不存在相加作用。在eNOS基因的rs3918196中，镉暴露与高血压患病风险在GG基因型的人群中不存在关联，但在GA和AA基因型的人群中存在显著关联。GA和AA基因型人群的镉暴露浓度每增加一倍，其高血压患病风险增加22%（OR=1.22，95%CI：1.02，1.25）（P=0.039）。以GG基因型为对照，GA和AA基因型与高血压患病风险之间不存在显著关联。RERI为0.34（95%CI：0.01，0.65），提示该位点与镉暴露之间存在相加交互作用，其联合作用大于两因素的单独作用。在镉暴露浓度加倍所引起的高血压患病风险增加的效应中，有28.0%（95%CI：2.6%，53.7%）是由镉暴露与rs3918196位点之间的交互作用所致。但是，该位点与镉暴露之间不存在相乘交互作用（PFDR=0.763）。52 华中科技大学博士学位论文表2.10镉暴露与基因多态性的交互作用SNP基因模型OR10(95%CI)OR01(95%CI)OR11(95%CI)RERIP交互PFDReNOS7q36.1rs1007311GA+AAvs.GG0.98(0.81,1.18)0.99(0.71,1.38)1.18(1.05,1.32)0.20(-0.18,0.52)0.0590.556rs1008140TTvs.TC+CC1.05(0.85,1.29)0.72(0.51,1.02)1.12(1.01,1.25)0.35(0.03,0.68)0.8520.968rs11771443CT+TTvs.CC1.14(0.96,1.36)0.84(0.62,1.15)1.11(0.99,1.25)0.12(-0.21,0.44)0.8660.968rs1541861AAvs.AC+CC1.09(0.95,1.24)0.99(0.74,1.33)1.15(1.00,1.33)0.07(-0.29,0.37)0.5680.919rs1549758CCvs.CT+TT1.00(0.84,1.19)1.18(0.86,1.61)1.18(1.05,1.32)0.00(-0.42,0.36)0.1980.763rs1799983GGvs.GT+TT1.01(0.81,1.26)1.03(0.71,1.50)1.15(1.03,1.28)0.10(-0.36,0.48)0.3710.820rs2256314AAvs.AG+GG1.05(0.91,1.21)0.98(0.73,1.32)1.18(1.03,1.35)0.14(-0.22,0.47)0.2100.763rs2566508TG+GGvs.TT1.01(0.88,1.16)1.05(0.78,1.41)1.23(1.07,1.42)0.17(-0.25,0.52)0.0260.485rs2566511CT+TTvs.CC0.96(0.82,1.12)1.00(0.74,1.35)1.24(1.09,1.40)0.28(-0.08,0.61)0.0080.295rs2853796TTvs.TG+GG1.09(0.97,1.23)1.20(0.89,1.63)1.21(1.02,1.44)-0.07(-0.54,0.29)0.3180.766rs3918174AG+GGvs.AA1.11(1.00,1.24)0.84(0.57,1.23)1.19(0.93,1.53)0.24(-0.21,0.81)0.9750.998rs3918196GA+AAvs.GG1.07(0.95,1.20)0.81(0.59,1.11)1.22(1.02,1.46)0.34(0.01,0.65)0.2440.763rs3918227CCvs.CA+AA0.85(0.65,1.12)0.95(0.60,1.50)1.18(1.06,1.31)0.37(-0.21,0.78)0.0680.556rs7830GT+TTvs.GG1.12(0.96,1.30)1.07(0.79,1.44)1.13(1.00,1.27)-0.00(-0.42,0.26)0.8310.968rs891511AAvs.AG+GG1.09(0.97,1.21)0.90(0.66,1.23)1.20(1.00,1.46)0.21(-0.14,0.65)0.4100.820CAT11p13rs10488736CCvs.CT+TT1.03(0.90,1.19)1.00(0.74,1.34)1.19(1.04,1.36)0.16(-0.17,0.49)0.3230.766rs1049982TTvs.TC+CC1.07(0.94,1.22)0.94(0.70,1.27)1.16(1.00,1.33)0.13(-0.22,0.45)0.7480.968rs11032701TTvs.TC+CC1.08(0.94,1.25)1.04(0.78,1.40)1.15(1.01,1.32)0.03(-0.33,0.35)0.4830.874rs17881846GGvs.GA+AA0.98(0.74,1.30)1.16(0.73,1.86)1.14(1.03,1.26)-0.00(-0.73,0.54)0.2630.763rs2284367TC+CCvs.TT1.13(0.95,1.35)0.80(0.57,1.11)1.13(1.00,1.26)0.20(-0.16,0.51)0.9880.998rs2284367TC+CCvs.TT1.13(0.95,1.35)0.80(0.57,1.11)1.13(1.00,1.26)0.20(-0.16,0.51)0.9880.998rs4755374AC+CCvs.AA1.10(0.98,1.24)0.84(0.62,1.15)1.15(0.98,1.36)0.20(-0.08,0.52)0.6740.968rs551929GT+TTvs.GG1.03(0.91,1.16)1.34(0.99,1.80)1.26(1.08,1.48)-0.10(-0.57,0.32)0.1010.556rs769214GGvs.GA+AA1.08(0.95,1.23)0.96(0.72,1.29)1.15(1.00,1.33)0.11(-0.25,0.42)0.8140.96853 华中科技大学博士学位论文表2.10续镉暴露与基因多态性的交互作用SNP基因模型OR10(95%CI)OR01(95%CI)OR11(95%CI)RERIP交互PFDRCAT11p13rs769218GA+AAvs.GG1.10(0.92,1.30)0.84(0.60,1.16)1.13(1.01,1.27)0.19(-0.21,0.48)0.8000.968VCAM11p21.2rs3176867CCvs.CT+TT1.04(0.89,1.23)1.22(0.88,1.68)1.17(1.04,1.31)-0.09(-0.5,0.32)0.2810.763ICAM119p13.2rs281432CG+GGvs.CC1.05(0.91,1.21)0.94(0.70,1.26)1.16(1.02,1.31)0.16(-0.15,0.50)0.5490.919MT1A16q13rs11076161GGvs.GA+AA1.09(0.96,1.25)1.10(0.82,1.48)1.15(1.00,1.32)-0.05(-0.39,0.31)0.7070.968rs8060569TC+CCvs.TT1.10(1.00,1.23)0.81(0.55,1.20)1.16(0.90,1.51)0.24(-0.29,0.81)0.5800.919MT2A16q13rs10636GGvs.GC+CC1.07(0.93,1.23)1.15(0.86,1.54)1.16(1.01,1.33)-0.06(-0.44,0.29)0.4050.820rs1610216GGvs.GA+AA1.04(0.92,1.18)1.11(0.82,1.49)1.25(1.07,1.46)0.10(-0.32,0.43)0.1020.556rs28366003AAvs.AG+GG1.02(0.84,1.25)1.17(0.82,1.67)1.16(1.03,1.29)-0.03(-0.44,0.39)0.2100.763CYP11B28q24.3rs1799998AG+GGvs.AA1.09(0.95,1.24)1.04(0.77,1.40)1.16(1.00,1.34)0.03(-0.32,0.37)0.6620.968GSTP111q13.2rs1695AG+GGvs.AA1.07(0.95,1.21)1.23(0.90,1.68)1.20(1.02,1.41)-0.09(-0.54,0.32)0.2500.763CYP1A115q24.1rs4646421GA+AAvs.GG1.09(0.93,1.28)0.89(0.66,1.21)1.12(1.00,1.26)0.13(-0.22,0.42)0.9980.998rs4646903AG+GGvs.AA1.09(0.93,1.28)0.87(0.64,1.18)1.12(1.00,1.26)0.16(-0.19,0.47)0.9940.998注释：在交互作用分析中，当交叉乘积项的回归系数为负时，将该位点中不含突变等位基因的基因型定义为“风险”基因型；OR10为具有非风险基因型的人群中镉暴露浓度加倍所引起的高血压患病风险，OR01为风险基因型的独立作用所引起的高血压患病风险，OR11为具有风险基因型的人群中镉暴露浓度加倍所引起的高血压患病风险；RERI为超额相对危险度；P交互为交叉乘积项的回归系数检验P值，PFDR为FDR校正P值。本分析校正了年龄、性别、BMI、吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平的混杂影响。54 华中科技大学博士学位论文2.3.3汞暴露与基因多态性的交互作用表2.11为不同基因型的人群中汞暴露与高血压患病风险的关联性分析结果，以及汞暴露与基因多态性的交互作用分析。在eNOS基因的rs2566508中，汞暴露与高血压患病风险在TT基因型人群中不存在关联，但在TG和GG基因型人群中存在显著关联。TG和GG基因型人群的汞暴露浓度每增加一倍，其高血压患病风险增加12%（OR=1.12，95%CI：1.01，1.24）（P=0.333）。以TT基因型为对照，TG和GG基因型的单独效应与高血压患病风险之间不存在显著关联。该位点的多态性与汞暴露之间存在相乘交互作用，经过FDR校正后，此交互作用仍然具有建议性的统计意义（PFDR=0.082）。但是，该位点与汞暴露之间不存在相加作用。在eNOS基因的rs2566511中，汞暴露与高血压患病风险在CC基因型人群中不存在关联，但在CT和TT基因型的人群中则存在显著关联。CT和TT基因型人群的汞暴露浓度每增加一倍，其高血压患病风险增加10%（OR=1.10，95%CI：1.01，1.21）（P=0.036）。以CC基因型为对照，CT和TT基因型的单独效应与高血压患病风险之间不存在显著关联。该位点的多态性与汞暴露之间存在相乘交互作用，经过FDR校正后，此交互作用仍然具有建议性的统计意义（PFDR=0.056）。但是，该位点与汞暴露之间不存在相加作用。在CAT基因的rs10488736中，CT和TT基因型人群的汞暴露浓度每增加一倍，其高血压患病风险降低12%（OR=0.88，95%CI：0.79，0.99）（P=0.029）；而CC基因型人群的汞暴露浓度每增加一倍，其高血压患病风险增加14%（OR=1.14，95%CI：1.03，1.25）（P=0.008）。以CT和TT基因型为对照，CC基因型的单独效应与高血压患病风险之间不存在显著关联。该位点的多态性与汞暴露之间存在相乘交互作用，经过FDR校正后，此交互作用仍然具有显著性统计学意义（PFDR=0.048）。但是，该位点与汞暴露之间不存在相加作用。在CAT的rs17881846中，GA和AA基因型人群的汞暴露浓度每增加一倍，其高血压患病风险降低26%（OR=0.74，95%CI：0.60，0.93）（P=0.009）；而GG基因型的人群的汞暴露与高血压之间不存在关联。以GA和AA基因型为对照，GG基因型的单独效应与高血压患病风险之间不存在显著关联。该位点的多态性与汞暴露之间存在相乘交互作用，经过FDR校正后，此交互作用仍然具有建议性的统计学意义（PFDR=0.056）。但是，该位点与汞暴露之间不存在相加作用。在CAT基因中的rs2284367、rs4755374和rs769218，以及MT2A基因的rs1610216中都发现与汞暴露之间具有相乘交互作用，但是此交互作用在经过FDR校正后没有显著性或建议性的统计学意义。本部分中的位点与汞暴露之间没有发现相加交互作用。55 华中科技大学博士学位论文表2.11汞暴露与基因多态性的交互作用SNP基因模型OR10(95%CI)OR01(95%CI)OR11(95%CI)RERIP交互PFDReNOS7q36.1rs1007311GA+AAvs.GG0.95(0.83,1.08)1.08(0.74,1.58)1.06(0.97,1.15)0.02(-0.44,0.32)0.1020.429rs1008140TTvs.TC+CC0.89(0.76,1.04)0.84(0.57,1.25)1.05(0.97,1.14)0.32(-0.02,0.58)0.1160.429rs11771443CT+TTvs.CC1.01(0.89,1.13)0.87(0.61,1.23)1.03(0.94,1.13)0.15(-0.18,0.38)0.7340.846rs1541861AC+CCvs.AA0.99(0.90,1.10)1.10(0.78,1.54)1.05(0.95,1.17)-0.03(-0.43,0.22)0.4960.772rs1549758CCvs.CT+TT0.98(0.86,1.12)1.19(0.82,1.72)1.05(0.96,1.14)-0.12(-0.55,0.20)0.4900.772rs1799983GGvs.GT+TT0.94(0.78,1.14)1.10(0.69,1.76)1.03(0.95,1.11)-0.01(-0.62,0.32)0.4480.772rs2256314AAvs.AG+GG0.96(0.87,1.07)1.07(0.76,1.50)1.07(0.97,1.18)0.04(-0.39,0.30)0.1240.429rs2566508TG+GGvs.TT0.93(0.84,1.03)1.24(0.88,1.75)1.12(1.01,1.24)-0.05(-0.55,0.24)0.0090.082rs2566511CT+TTvs.CC0.90(0.79,1.02)1.20(0.84,1.72)1.10(1.01,1.21)0.00(-0.47,0.30)0.0040.056rs2853796TTvs.TG+GG1.01(0.92,1.11)1.23(0.86,1.74)1.05(0.93,1.18)-0.18(-0.67,0.10)0.6120.810rs3918174AAvs.AG+GG0.98(0.82,1.16)1.20(0.78,1.85)1.03(0.95,1.11)-0.15(-0.71,0.22)0.9780.978rs3918196GA+AAvs.GG0.99(0.91,1.08)0.84(0.59,1.21)1.08(0.95,1.22)0.24(-0.06,0.47)0.3320.665rs3918227CCvs.CA+AA0.86(0.68,1.09)1.05(0.59,1.86)1.05(0.97,1.13)0.13(-0.52,0.51)0.2400.571rs7830GT+TTvs.GG0.98(0.87,1.10)1.20(0.85,1.71)1.05(0.96,1.15)-0.12(-0.61,0.18)0.2180.552rs891511AAvs.AG+GG1.00(0.92,1.09)0.98(0.68,1.39)1.08(0.95,1.23)0.10(-0.27,0.37)0.3210.665CAT11p13rs10488736CCvs.CT+TT0.88(0.79,0.99)1.31(0.93,1.85)1.14(1.03,1.25)-0.05(-0.54,0.27)0.0010.048rs1049982TTvs.TC+CC0.97(0.87,1.07)1.06(0.76,1.48)1.08(0.97,1.19)0.05(-0.34,0.31)0.1680.493rs11032701TC+CCvs.TT0.97(0.88,1.08)1.13(0.80,1.58)1.08(0.98,1.20)-0.01(-0.42,0.27)0.1820.493rs17881846GGvs.GA+AA0.74(0.60,0.93)1.65(0.95,2.86)1.06(0.99,1.15)-0.33(-1.73,0.29)0.0040.056rs2284366CCvs.CT+TT1.00(0.81,1.23)1.15(0.69,1.93)1.03(0.95,1.11)-0.12(-0.91,0.32)0.7750.866rs2284367TC+CCvs.TT0.90(0.79,1.03)1.01(0.69,1.48)1.09(1.00,1.18)0.18(-0.24,0.46)0.0200.156rs4755374AC+CCvs.AA0.98(0.90,1.07)1.00(0.70,1.43)1.15(1.01,1.31)0.17(-0.20,0.45)0.0470.222rs551929GT+TTvs.GG1.00(0.91,1.10)1.35(0.96,1.91)1.06(0.95,1.18)-0.29(-0.81,0.05)0.5080.772rs769214GGvs.GA+AA0.97(0.87,1.07)1.08(0.77,1.51)1.08(0.97,1.19)0.03(-0.36,0.30)0.1790.49356 华中科技大学博士学位论文表2.11续汞暴露与基因多态性的交互作用SNP基因模型OR10(95%CI)OR01(95%CI)OR11(95%CI)RERIP交互PFDRCAT11p13rs769218GA+AAvs.GG0.91(0.80,1.04)1.02(0.70,1.50)1.08(0.99,1.17)0.14(-0.28,0.44)0.0350.222VCAM11p21.2rs3176867CT+TTvs.CC1.03(0.95,1.12)0.86(0.60,1.25)1.04(0.91,1.19)0.15(-0.19,0.38)0.9010.926ICAM119p13.2rs281432CG+GGvs.CC1.01(0.90,1.12)0.95(0.68,1.34)1.03(0.94,1.13)0.07(-0.26,0.29)0.8220.892MT1A16q13rs11076161GGvs.GA+AA1.02(0.92,1.13)1.10(0.79,1.55)1.03(0.93,1.14)-0.09(-0.50,0.16)0.8770.926rs8060569TC+CCvs.TT1.02(0.94,1.10)0.83(0.53,1.29)1.13(0.93,1.37)-0.32(-1.07,0.04)0.6910.844MT2A16q13rs10636GC+CCvs.GG0.99(0.90,1.10)0.94(0.67,1.32)1.05(0.95,1.17)0.11(-0.21,0.34)0.5320.777rs1610216GGvs.GA+AA0.97(0.88,1.06)1.25(0.88,1.76)1.12(1.00,1.25)-0.09(-0.57,0.22)0.0450.222rs28366003AAvs.AG+GG0.98(0.84,1.15)1.21(0.80,1.84)1.04(0.96,1.13)-0.15(-0.75,0.18)0.4210.772CYP11B28q24.3rs1799998AAvs.AG+GG0.99(0.89,1.09)1.07(0.76,1.50)1.05(0.95,1.17)-0.00(-0.37,0.37)0.3160.665GSTP111q13.2rs1695AG+GGvs.AA1.01(0.92,1.10)1.20(0.84,1.71)1.05(0.93,1.18)-0.16(-0.64,0.15)0.6680.844CYP1A115q24.1rs4646421GGvs.GA+AA1.00(0.91,1.09)1.21(0.85,1.73)1.06(0.93,1.19)-0.15(-0.56,0.16)0.4420.772rs4646903AAvs.AG+GG1.01(0.92,1.10)1.22(0.86,1.74)1.04(0.92,1.18)-0.18(-0.62,0.14)0.6180.810注释：在交互作用分析中，当交叉乘积项的回归系数为负时，将该位点中不含突变等位基因的基因型定义为“风险”基因型；OR10为具有非风险基因型的人群中镉暴露浓度加倍所引起的高血压患病风险，OR01为风险基因型的独立作用所引起的高血压患病风险，OR11为具有风险基因型中的人群中镉暴露浓度加倍所引起的高血压患病风险；RERI为超额相对危险度；P交互为交叉乘积项的回归系数检验P值，PFDR为FDR校正P值；本分析校正了年龄、性别、BMI、吸烟状态、吸烟包年、饮酒状态、收入水平和教育水平的混杂影响。57 华中科技大学博士学位论文3讨论本研究发现在eNOS基因中位于17内含子的rs1008140位点的多态性与高血压患病风险之间存在显著关联。eNOS基因在人类染色体上定位于7q35-q36区，跨度约21kb，约含有26个外显子和25个内含子，其控制合成的内皮型一氧化氮合酶（eNOS）是一氧化氮（NO）的合成限速酶，通过在血管内产生NO从而起到血管调节的功能[106]。NO是内皮衍生的舒张因子，在维持血压稳定、抑制内皮损伤和拮抗血栓形成等方面起到很大的作用。eNOS基因的突变可影响该基因的表达效率、影响血管内皮NO的合成，从而增加血管阻力、导致血压的升高[107]。在eNOS基因的rs1008140位点中，与GG基因型的人群相比，具有突变等位基因T的人群患高血压的风险提高了1.4倍（OR=1.40，95%CI：1.01，1.95）（P=0.047）。本研究是首次报道了该位点与高血压患病风险之间的显著关联。但是，由于多态性研究不可控制的因素太多，容易出现假阳性关联，因此该结论还需在下一个阶段的其他区域人群样本中进行重复验证。位于eNOS基因第8外显子的rs1799983是原发性高血压相关研究的热点SNP，但研究结果存在争议。最近Li等人[108]对23个研究中的11248例中国高血压患者数据进行了荟萃分析，发现rs1799983的T突变等位基因能够增加中国人群的高血压患病风险，尤其是中国汉族人群。但是，本研究并没有在中国汉族人群中发现此位点与高血压患病风险之间的关联。这可能是因为本研究只在武汉市区域内进行样本的收集，不足以代表整个汉族人群。氧化应激是镉和汞等重金属的重要毒性作用机制。研究指出，eNOS与氧化应激关系密切。一方面，eNOS只有在二聚体时才具有活性；当机体受到氧化应激损伤时，产生的大量ROS能使eNOS解聚、脱偶联。此时eNOS生成的不是具有血管舒张功能的NO而是超氧阴离子，进而降低NO的生物活性。另一方面，ROS能激活不同的激酶对eNOS进行磷酸化修饰，改变其蛋白质结构从而调节eNOS的活性。动物实验发现eNOS与NO在镉和汞的毒性效应中起到重要的作用。Majumder等[109]的研究表明即使是低浓度的镉暴露也可以阻断eNOS的磷酸化反应进而抑制NO的产生；而Almenara等[110]的研究则发现与职业人群暴露水平相近的镉暴露浓度能够促进大鼠体内NADPH氧化酶2的表达，造成氧化应激和降低NO的生物活性。甲基汞的暴露能减少内皮细胞的形成和迁移，从而降低血管内皮的修复能力、降低NO的水平并导致内皮功能障碍[111]。此外，有研究发现使用汞暴露后的大鼠其主动脉磷酸化eNOS/eNOS蛋白比值上升，同时NADPH氧化酶亚基的水平也上升，提示机体受到氧化应激损伤[112]。由此可见，eNOS与镉和汞的氧化应激毒性作用关系密切。本研究中发现eNOS基因的多态性与镉暴露和汞暴露之间均存在交互作用。在相乘模型中，rs2566508和rs2566511与镉暴露和汞暴露之间都存在交互作用；而在相加模型中，rs1008140和rs3918196只与镉暴露之间存在交互作用。在上述的4个位点中，rs256650858 华中科技大学博士学位论文和rs2566511之间（D’=0.984），rs1008140和rs3918196之间（D’=0.927）均处于紧密的连锁关系，这可能是导致它们与镉暴露和汞暴露之间的交互作用相似的原因。先前有研究表明，eNOS基因的基因多态性能够修饰汞的心血管毒性。Marco等人[113]发现汞暴露人群血浆中的NO浓度与其汞的内暴露水平呈负相关，说明汞能够对内皮细胞中NO的产生起抑制作用。随后Marco等人[114]对汞暴露与NO水平的关联原因进行了基因多态性方面的探讨，发现eNOS基因第4内含子的一个重复序列多态性位点能够影响NO的生物活性与浓度，进而增加暴露人群对汞的心血管毒性的易感程度，表明eNOS基因的多态性在汞对心血管作用中的修饰效应。本研究亦得到相似的结论。另一方面，据我们所知，本研究第一次发现eNOS基因的多态性与镉暴露之间存在交互作用，且结果提示镉与汞暴露的作用机制存在相同之处。但是，由于本研究发现的4个位点均位于内含子区域，目前还没有关于这些位点与任何生物化学过程或者疾病表型相关联的报道，因此暂时无法确定这些位点与镉暴露和汞暴露之间交互作用的生物基础。连锁不平衡分析的结果显示，eNOS基因上的rs2566508和rs2566511与位于第7外显子的rs1549758（D’=0.975与D’=0.973）之间均处于紧密的连锁不平衡状态，因此可以推断rs2566508和rs2566511与镉暴露和汞暴露之间交互作用的生物基础可能与rs1549758的功能有关。rs1549758是一个同义密码子SNP，虽然它不改变所编码的氨基酸，但其能够影响基因的翻译速度和表达水平。有证据表明，rs1549758的多态性能够影响NO的生成效率[115]。在最近的一个瑞典研究中，研究者发现rs1549758的突变等位基因型GT和TT能增加冠心病的患病风险[116]。Hsueh等人[103]发现rs1549758与另外一种重金属——砷的血压升高作用有着显著的协同作用。与对照组相比，GT和TT基因型的人群在高砷暴露的状态下高血压的患病风险提高了3.7倍（95%CI：1.2，11.7）。但该研究的样本数较小，检验效力不够，而且也没有控制与环境相关的混杂因素的影响，因此对其结果的解读需要谨慎。本研究在控制了潜在的混杂因素后未发现rs1549758与重金属暴露之间存在交互作用。此外，本研究发现eNOS基因的rs1008140位点的多态性与高血压患病风险存在阳性关联，具有突变等位基因的基因型TC和CC是高血压患病的风险基因型；但在基因-重金属交互作用分析中，rs1008140位点的野生基因型TT却是风险基因型，对镉的心血管毒性在相加模型中具有正向的交互作用。镉暴露与高血压患病风险只在TT基因型的人群中具有显著关联，在TC和CC基因型人群中不存在关联。根据研究结果可以推断，rs1008140位点的TT基因型本身与高血压患病风险之间并没有直接的关联，但其可能在镉暴露致高血压的病理生理过程中起到重要的作用；而TC和CC基因型可能通过另外的机制引起高血压。不同基因型造成的eNOS的功能改变需要在动物实验或功能验证实验中进行进一步的研究。59 华中科技大学博士学位论文CAT基因与高血压的关联性分析结果提示CAT的单倍型CTACTGTAGC能够增加高血压的患病风险。CAT基因编码的蛋白是过氧化氢（H2O2）酶。该酶通过催化超氧阴离子自由基的自身氧化还原反应，有效清除自由基，进而维持体内自由基和氧化还原状态的动态平衡。有研究发现高血压患者血浆中的CAT活性明显低于正常组人群，且随高血压分级的提高而进一步下降。Zhou等[117]在高加索人群研究中发现CAT基因启动子区域中的位点rs769214的多态性与高血压患病风险存在关联。但由于人群的差异，在本研究和其他几个中国人群研究中，均没有观察到此位点与高血压患病风险的显著关联。有研究者认为该位点与CAT活性的关联可能仅限于高加索人群[118]。本研究发现CAT基因的整个区域处于高度连锁不平衡状态，其中单倍型CTACTGTAGC能够增加人群罹患高血压的风险。在校正了其他混杂因素后，具有单倍型CTACTGTAGC的研究对象的高血压患病风险是其他单倍型的7.99倍（OR=7.99，95%CI：2.50，25.52）。但是，由于此单倍型在本研究人群中的频率较低，具有此单倍型的样本数较小，因此得出的置信区间较大，结果的解释需要谨慎。该研究结果还需要通过增大样本量加以证实。交互作用结果显示，汞暴露与CAT基因位点rs10488736和rs17881846在高血压的患病风险中存在相乘交互作用，其中汞暴露与rs10488736的相乘交互作用在经过多重校正后依然保持显著。汞暴露不仅能够对机体产生氧化应激损伤，而且可以减弱机体的抗氧化防御机制。汞对巯基、酶和氨基酸（如N-乙酰半胱氨酸、α-硫辛酸和谷胱甘肽）等体内重要的抗氧化剂都具有高亲和力。汞与这些抗氧化剂结合后能够加大氧化应激造成的损伤，进而导致心血管疾病的发生。动物实验结果表明CAT与汞的毒性效应密切相关。Lund等人[119]发现低浓度的汞能够通过受损的呼吸链电子传递消耗大鼠体内的谷胱甘肽，导致线粒体中的H[120]2O2增多、组织发生氧化应激损伤。一项关于亚马逊社区人群的研究发现，在食用鱼肉而造成汞暴露的人群中，其体内各种抗氧化酶的浓度都随汞暴露程度的增加而下降，其中女性CAT的水平与血汞和发汞均存在显著的负相关。还有研究进一步指出甲基汞代谢相关酶的基因多态性能修饰汞暴露与CAT活性之间的关联[121]，证实了CAT在汞毒性效应中的重要作用。然而，到目前为止，还没有关于CAT基因多态性与汞或者其他重金属的毒性效应的关联研究。不过，已有研究发现CAT基因的多态性与其他环境毒物（二甲基乙酰胺和砷）之间存在关联作用，其中rs769214的变异可以放大环境毒物的氧化应激损伤作用[103;122]。rs769214位于CAT基因启动子区域，其变异可以影响CAT的表达水平，造成体内内源性CAT生成不足，从而影响与原发性高血压发病有关的脂质过氧化等生理生化反应。CAT基因上的rs10048376与rs769214处于紧密的连锁不平衡状态（D’=0.994，r2=0.791），因此我们可以推测rs10048376多态性与汞暴露之间的交互作用可能与rs769214的功能有关，但仍需进一步的功能验证。60 华中科技大学博士学位论文本研究也发现MT2A基因中的rs1610216位点与汞暴露之间存在相乘交互作用。金属硫蛋白是富含半胱氨酸的金属结合蛋白，其巯基能与有毒金属产生强烈螯合作用，对汞和镉都有很强的亲和力，是体内重要的解毒剂。另外，MT对缺血再灌注损伤的抑制作用[100]。因此，MT在重金属的排泄、解毒和心血管的保护等方面都具有重要的意义。rs1610216位于MT2A基因的启动子区域，其多态性能影响MT的表达。rs1610216位点的多态性与多种疾病相关，包括糖尿病、慢性肾脏疾病和癌症[100]，提示其在炎症和代谢综合症中的重要作用，但是还并未发现其与心血管疾病或者重金属毒性效应相关的流行病学证据。多个研究发现，同处于MT2A启动子区域的rs28366003位点的多态性与镉、汞等重金属的毒性效应之间均存在潜在的关联。其突变基因型可以增加重金属在体内的蓄积，继而加剧重金属的不良效应[123-124]。但本研究并未发现rs28366003对重金属的心血管毒性存在修饰作用。我们分析，结果的差异可能来源于种族的不同。本研究对基因多态性与高血压患病风险进行关联性分析，并对基因多态性与重金属暴露之间的交互作用在高血压患病风险中所起的关键作用进行探讨。本文首次发现了eNOS基因、CAT基因和MT2A基因的多态性与镉、汞所致高血压效应之间存在交互作用，为重金属毒性作用机制的研究提供重要线索。本研究没有按照重金属的暴露程度对研究人群分组进行2×2的叉生分析，而是采用基于连续变量的多元Logistic模型，因为后者不会损失暴露浓度信息，更适用于环境有害物质的暴露研究。但需要注意的是，本研究结果中的交互作用是基于统计学模型得出的。鉴于真实的生物学交互作用的复杂性，不能单纯地排除本研究没有得出交互作用的两因素在生物学意义上的交互作用。此外，本研究存在几个缺陷需要引起注意。第一，尿汞只能反映近期的汞暴露，而不能准确地反映汞在体内的长期蓄积。而且，由于甲基汞主要不是通过尿排泄的，因此尿汞水平不能反映甲基汞暴露的水平。我们将使用能反映汞长期蓄积的标志物（如发汞与趾甲汞等）进行后续研究。第二，本研究中没有收集与饮食相关的流行病学信息，无法对汞暴露的重要混杂因素（如鱼肉和海产品的摄入、维生素的补充等）进行控制，因此可能会对关联结果造成混杂影响。第三，基因多态性与疾病的关联性结果容易出现假阳性错误，不能从一个阶段的研究中得到可靠的结论。因此，本研究结果仍需在另外区域的人群中加以验证。第四，由于条件的不足，本研究只对eNOS基因和CAT基因进行标签SNP的筛选与分型，而其他基因只选取了有限的几个热点或功能位点，不足以覆盖整条基因，所以可能会遗漏重要的基因交互作用信息。4结论综上所述，eNOS基因中的rs1008140、CAT基因的单倍型与高血压患病风险之间存在显著关联。在关于高血压患病风险的交互作用分析中，eNOS基因的rs2566508和rs2566511与镉暴露在相乘模型中存在交互作用，而eNOS基因的rs1008140和rs3918196与镉暴露则61 华中科技大学博士学位论文在相加模型中存在交互作用；eNOS基因的rs2566508和rs2566511、CAT基因的rs10488736和rs17881846、MT2A基因的rs1610216则与汞暴露在相乘模型中存在交互作用。其中，rs10488736在相乘模型中的交互作用经过FDR校正后仍然具有显著性统计学意义（PFDR=0.048）。本研究结果不仅可为重金属毒性效应的基础研究提供重要线索，而且对于易感人群的确定和高血压的预防工作均具有重要的理论价值和实际意义。但是本研究所发现的交互作用结果仍需进一步的机制研究与功能实验来验证、阐述其生物功能基础。62 华中科技大学博士学位论文第三部分重金属联合暴露对高血压患者肾功能的影响慢性肾病（chronickidneydisease，CKD）是世界范围内日益严重的健康问题[125]。从1990年到2010年，全球慢性肾病相关的年龄标准化死亡率从9.6/10万增加到11.1/10万[126]。作为拥有庞大人口基数的发展中国家，中国CKD的患病率一直居高不下，而且具有年轻化趋势。我国首个全国慢性肾脏病（CKD）的横断面调查显示，2012年我国CKD的总患病率达10.8%，CKD患者预计近1.2亿。据估计，在未来十年内，慢性肾脏病增长率将超过17.0%[127]。高血压与CKD关系密切。一方面，高血压是CKD的重要危险因素，持续的血压升高可致肾小球囊内压升高，肾小球纤维化、萎缩，最终导致肾功能衰竭。另一方面，在高血压人群中，肾脏的健康状况对高血压患者的治疗和预后都有很大的影响：患有肾脏疾病的高血压病人其血压更难以控制，并且具有更高的死亡率和更高风险的严重并发症[39;126;128]。其中，心血管疾病是高血压合并CKD最常见的结局，也是CKD导致死亡的主要原因[38;39]。因此，预防高血压患者并发CKD，是提高患者生活质量和预后的重要公共卫生措施之一。越来越多的证据表明环境的重金属暴露是CKD潜在的危险因素[129-131]。在普通人群中，环境的重金属暴露主要通过受污染的水和食物的摄入、受污染的空气的吸入或皮肤的接触而发生[53;132;133]。镉是具有明确肾毒性的有毒金属[40]。它可以在肾脏中蓄积，并通过氧化应激导致肾小管损伤[130]。即使是低暴露剂量的镉，也可以导致蛋白尿和糖尿病的发生，并会降低肾小球滤过率（glomerularfiltrationrate，GFR）[40;42]。除镉之外，关于其他重金属在低暴露剂量下的肾毒性效应的研究较为有限。动物模型和职业人群暴露的研究发现，铬、铊和铀也是具有潜在肾毒性的重金属[44-46;48;134]。在有关金属暴露与CKD患病风险的关联性研究中，研究者发现与血压正常的人群相比，在高血压人群中更容易观察到显著性的关联，而且关联强度更强。暴露于重金属的高血压人群其血清肌酸酐水平升高和GFR水平降低的可能性更大[49;50]。另外，也有相关报道指出重金属的暴露会增加高血压患者出现蛋白尿和β2-微球蛋白尿的风险，但是在血压正常的个体中却不易观察到这种影响[51]。因此，我们推测在血压升高的状态下，个体可能对重金属暴露的肾毒性作用更易感，进而发生肾功能障碍。然而，既往研究存在两点不足：第一，研究设计缺乏严谨性，观察到的关联可能被CKD的其他危险因素（如糖尿病和肥胖）所混淆和影响[126;127]；第二，研究通常都是评估单一金属暴露对健康的不利影响，并不能真实反映普通人群同时暴露于多种金属的实际情况。多种金属之间的相互作用效应仍有待阐述。因此，本研究基于横断面研究，首次在原发性高血压患者系统性地探索了铬、镉、铊和铀的环境暴露所致的肾脏毒性作用，并对不同金属间的联合毒性作用进行了分析。63 华中科技大学博士学位论文1研究对象和方法1.1研究对象1.1.1研究对象及排除标准本研究于2015年9月至2017年5月期间在武汉某综合医院的心内科招募符合纳入标准的研究对象，所有参与者均为年龄>30岁的新入院病人。本研究中高血压诊断与研究对象的纳入排除标准同第一部分第一节。最终，本研究中一共纳入了934例原发性高血压患者。本研究已经获得华中科技大学同济医学院道德伦理委员会批准，研究对象在参与本次研究之前均填写了知情同意书。1.1.2流行病学资料收集同第一部分第一节1.2尿样的采集与分析同第一部分第一节1.3血样的采集与分析新入院病人在经过一晚上的禁食后，于第二天早上利用真空采血管采集全血5mL，然后离心分离血清。血清样本的肌酐水平由武汉市某综合医院检验科医师利用肌氨酸氧化酶法进行测定。1.4肾功能评估eGFR的评估利用基于中国人群改良后的ModificationofDietinRenalDisease(MDRD)公式进行计算。我国eGFR课题协作组从2005年起对MDRD原始公式进行检验，通过添加种族系数对MDRD公式进行本土化，最终得出改良后的MDRD公式。改良后的MDRD公式能够用来评估中国人群的CKD病人在不同阶段的肾功能改变。公式如下：eGFR=175×Scr-1.234×age-0.179[iffemale,×0.79]；其中Scr为血中肌酐浓度（mg/dL），age为年龄（岁）；如果是女性，则需要乘以0.79。1.5统计学分析由于男性和女性血清肌酐浓度存在显著差异，因此本研究将根据性别分别进行分析。采用参数或者非参数方法分别比较连续或者分类变量在男性和女性参与者之间的差异，使用Spearman等级相关系数计算血清肌酐、尿肌酐、eGFR和尿金属浓度的相关性。使用多元线性回归模型对高血压患者中的四种重金属在尿样中的浓度与eGFR水平之间的关联进行探讨。尿样金属浓度将进行以2为基底的对数转换以增加数据的正态性。在本研究分析中，尿肌酐作为独立的自变量进入回归方程以便校正尿样中金属的浓度[135]。回归模型中其他协变量的筛选根据Greenland等人[71]的方法进行。当所有其他协变量都被选择后，经自然对数转化的尿铅浓度将被添加到最终模型中，以便控制与铅相关的肾小球高滤过作用[136]。最终的多元回归模型中纳入的协变量包括尿肌酐、年龄、BMI、吸烟状况、64 华中科技大学博士学位论文饮酒状况、收入水平、教育水平、收缩压、舒张压、降压药用药情况、高血压患病年和尿铅浓度。在本研究中，女性吸烟率低于5.0％。因此女性人群中的关联性分析没有校正吸烟状况。对于有统计意义的关联，本研究进一步使用限制性立方样条（RCS）模型分析其剂量-反应关系的形状[137]。根据eGFR水平将研究对象分为三分位数，分别研究各分位数的人群中重金属暴露与eGFR的关联，以便进行反向因果关系的相关分析。反向因果关系是指eGFR降低的同时也会降低毒物的总滤过率，从而直接降低尿液中该毒物的水平，因此可能出现尿样中的毒物浓度与eGFR的关联仅出现于低eGFR人群中[138;139]。另外，根据每种重金属的中位数，将研究人群分成重金属的高暴露组和低暴露组。在此分析过程中，我们发现铬和铀暴露之间存在协同效应，随后对这两种重金属的联合暴露效应进行分析。在亚组分析中，根据性别和其他的人群特征将研究对象进行分组，然后研究各个亚组中的人群重金属暴露量加倍所导致的eGFR变化。考虑到某些降压药可能影响肾功能，本研究对降压药的使用情况进行了单独的亚组分析。另外，采用敏感性分析验证本研究结果的稳健性，包括不调整尿肌酐的校正作用以及使用CKD-EPI（CKD-EpidemiologyCollaboration）方程计算eGFR[140]，然后重复上述多元回归分析。除RCS模型使用STATA12.0外，统计分析均在SPSS22.0软件中进行。统计检验均为双侧检验，P<0.05则认为有统计学意义，P<0.10则认为有建议性的统计学意义。2结果2.1研究人群的基本特征本研究总共包括934例原发性高血压患者，其中男性574例（61.5％），女性360例（38.5％）（表3.1）。男女之间的年龄、BMI、收缩压和尿肌酐均没有显著性差异（P>0.05）。与女性参与者相比，男性参与者吸烟和饮酒的可能性更大，并且有更高的收入水平、教育程度、舒张压和血清肌酐水平（P<0.001）。与男性参与者相比，女性参与者有更长的高血压患病年数以及更高水平的脉压和eGFR（P<0.001）。表3.1研究人群的基本特征变量男性(N=574)女性(N=360)P年龄，岁60.45±10.9963.33±10.020.142吸烟状态，N(%)<0.001从不吸烟237(41.3)347(96.4)现在吸烟196(34.1)8(2.2)以前吸烟141(24.6)5(1.4)65 华中科技大学博士学位论文表3.1续研究人群的基本特征变量男性(N=574)女性(N=360)P饮酒状态，N(%)<0.001从不饮酒208(36.2)320(88.9)现在饮酒261(45.5)29(8.1)以前饮酒105(18.3)11(3.0)收入情况，N(%)<0.001<2000元/月100(17.4)135(37.5)2000-4999元/月269(46.9)175(48.6)5000-9999元/月171(29.8)42(11.7)>9999元/月34(5.9)8(2.2)教育情况，N(%)<0.001≤小学50(8.7)109(30.3)初中118(20.6)72(20.0)高中、中专168(29.3)96(26.7)≥大学、大专238(41.4)83(23.0)降压药使用,N(%)420(73.2)289(80.3)0.015高血压患病年7±9.28±10.30.030BMI,kg/m224.61±2.9823.77±3.220.203收缩压,mmHg141±17.3139±16.20.263舒张压,mmHg86±11.883±10.3<0.001脉压差,mmHg55±14.457±13.60.018尿肌酐,g/L1.16(0.65-1.71)1.07(0.65-1.85)0.863血肌酐,mg/dL0.92(0.83-1.04)0.73(0.65-0.83)<0.001eGFR,mL/minper1.73m293.2(80.1-106.7)98.4(82.5-113.7)<0.001<86.0206(35.9)105(29.2)86.0-103.9201(35.0)110(30.6)>103.9167(29.1)145(40.3)尿液中金属浓度的分布情况如表3.2所示。男性和女性之间的铀（P=0.714）和铅（P=0.056）的水平相当。与女性相比，男性有更高水平的铬，镉和铊（P<0.05）。Spearman等级相关分析发现所有尿金属浓度之间存在显著性的正相关，rs范围为0.18-0.50（P<0.01）（见表3.3）。66 华中科技大学博士学位论文表3.2尿中金属与eGFR水平(mL/minper1.73m2)的分布百分位数变量平均值几何平均值10th25th50th75th90th男性人群铬*1.921.120.200.781.402.143.51镉*1.300.810.260.470.841.462.31铊*0.430.350.130.230.370.580.82铀0.0410.0300.0100.0190.0310.0470.070铅3.472.481.051.682.483.755.47eGFR*93.691.169.080.193.2106.7118.4女性人群铬1.910.960.150.511.262.043.73镉1.040.640.190.330.661.252.23铊0.350.270.110.170.260.460.71铀0.0480.0300.0110.0190.0300.0510.077铅3.672.290.811.462.303.625.20eGFR98.695.471.382.598.4113.7129.0总人群铬1.921.060.180.661.342.113.55镉1.200.740.230.410.781.402.28铊0.400.310.120.190.330.540.79铀0.0430.0300.0110.0190.0300.0480.072铅3.552.400.981.562.423.725.42eGFR95.592.869.981.194.7109.0121.9*男性和女性参与者中的尿金属浓度或eGFR水平存在差异，P<0.05。表3.3Spearman等级相关结果血肌酐尿肌酐eGFR铬镉铊铀铅血肌酐1.00尿肌酐-0.021.00eGFR-0.86**0.031.00铬0.19**-0.04-0.18**1.00镉0.02-0.030.040.18**1.00铊0.00-0.010.11**0.16**0.50**1.00铀0.09**-0.02-0.11**0.23**0.34**0.26**1.00铅0.05-0.02-0.030.35**0.38**0.33**0.39**1.00**P<0.01。67 华中科技大学博士学位论文2.2铬、镉、铊和铀的环境暴露与肾功能改变如表3.4所示，尿铬水平与男性和女性的eGFR均呈负相关关系。在调整了潜在的混杂因素和其他三种金属后，双倍的尿铬暴露可使男性和女性eGFR分别降低2.52（95%CI：1.44，3.60）mL/min/1.73m2和3.53（95%CI：2.07，4.98）mL/min/1.73m2。在男性参与者中，尿铊浓度与eGFR水平呈正相关，并且此关联在所有模型中都保持一致。经过混杂因素校正后，双倍的尿铊暴露可使男性eGFR水平增加3.12（95%CI：1.14，5.10）mL/min/1.73m2。未校正混杂因素之前，女性尿铀水平与eGFR之间呈现负相关，但校正混杂因素之后的模型1和模型2均未发现此关联具有显著性。在总体人群中，模型3显示尿铬和尿铀浓度每增加1倍，eGFR水平则分别降低2.90（95%CI：2.04，3.76）mL/min/1.73m2和1.87（95%CI：0.58，3.15）mL/min/1.73m2；尿铊浓度每增加1倍，eGFR水平则增加2.45（95%CI：0.89，4.01）mL/min/1.73m2。另外，敏感性分析结果均没有发生太大的改变，显示本研究结果具有稳健性（结果未列出）。68 华中科技大学博士学位论文表3.4高血压病人尿样中重金属浓度与eGFR水平的关联结果模型1模型2模型3金属β(95%CI)Pβ(95%CI)Pβ(95%CI)P男性人群铬-2.54(-3.60,-1.47)<0.001-2.44(-3.53,-1.35)<0.01-2.52(-3.60,-1.44)<0.001镉0.51(-0.81,1.83)0.4490.87(-0.62,2.36)0.2520.03(-1.65,1.70)0.977铊2.97(1.30,4.64)0.0012.64(0.87,4.41)0.0043.12(1.14,5.10)0.002铀-1.35(-2.91,0.20)0.088-1.17(-2.80,0.45)0.156-1.52(-3.15,0.11)0.067女性人群a铬-3.17(-4.52,-1.82)<0.001-3.54(-4.99,-2.08)<0.001-3.53(-4.98,-2.07)<0.001镉0.32(-1.38,2.03)0.708-0.07(-1.85,1.71)0.776-0.14(-2.23,1.95)0.938铊2.04(-0.15,4.23)0.0680.77(-1.51,3.04)0.7511.55(-1.06,4.17)0.507铀-2.54(-4.51,-0.57)0.011-1.73(-3.79,0.32)0.098-2.04(-4.20,0.11)0.060总人群b铬-2.95(-3.79,-2.11)<0.001-2.89(-3.75,-2.02)<0.001-2.90(-3.76,-2.04)<0.001镉0.18(-0.87,1.22)0.7380.57(-0.55,1.70)0.3170.05(-1.24,1.34)0.938铊2.01(0.69,3.34)0.0031.91(0.53,3.29)0.0072.45(0.89,4.01)0.002铀-1.94(-3.17,-0.71)0.002-1.49(-2.75,-0.22)0.021-1.87(-3.15,-0.58)0.004注：β为线性回归模型中的回归系数，模型1中校正了尿肌酐，模型2在模型1的基础上校正了年龄、BMI、吸烟状况、饮酒状况、收入水平、教育水平、收缩压、舒张压、降压药用药情况、高血压患病年和自然对数转换的尿铅浓度，模型3在模型2的基础上校正了其他金属浓度。a因为女性人群中吸烟率低，所以女性人群的回归模型均没有校正吸烟状况。b总人群的回归模型中没有校正性别。69 华中科技大学博士学位论文利用RCS模型进一步探讨显著关联的形状时，除铀之外，所有以上关联都可以观察到明显的剂量-反应关系（图3.1）。这些剂量-反应关系均是线性关联，且具有单调递增的性质（Pfornon-linearity>0.05）。图3.1尿液金属浓度与eGFR水平的RCS模型将人群根据eGFR水平三分位数分类后的关联分析结果如表3.5所示，尿铊浓度与eGFR水平仅在eGFR处于最低三分位数的男性参与者中具有显著的正相关关系。尿铀浓度与eGFR水平仅在eGFR处于最低三分位数的总人群中具有显著的负相关关系，而尿铬与eGFR在eGFR处于最低和最高分位数中的各个亚组人群中均呈现显著的负相关关系。70 华中科技大学博士学位论文表3.5不同eGFR水平下的关联分析结果aeGFR<86.0mL/minper1.73m2eGFR86.0-103.9mL/minper1.73m2eGFR>103.9mL/minper1.73m2Metalsβ(95%CI)Pβ(95%CI)Pβ(95%CI)P男性人群铬-1.87(-2.87,-0.88)<0.001-0.26(-0.75,0.23)0.291-2.99(-4.42,-1.56)<0.001镉0.49(-0.77,1.75)0.446-0.39(-1.08,0.30)0.264-0.31(-2.40,1.78)0.767铊1.72(0.14,3.30)0.033-0.05(-0.84,0.74)0.898-0.86(-3.45,1.73)0.512铀-1.34(-2.91,0.24)0.0950.30(-0.45,1.06)0.427-0.63(-2.57,1.31)0.521女性人群b铬-2.01(-3.78,-0.25)0.026-0.16(-0.81,0.49)0.62-2.17(-3.80,-0.55)0.009镉0.30(-1.56,2.16)0.749-0.44(-1.29,0.41)0.3070.63(-1.30,2.56)0.522铊-1.32(-3.90,1.26)0.312-0.43(-1.38,0.53)0.379-1.26(-3.86,1.34)0.338铀-1.22(-3.44,0.99)0.275-0.37(-1.38,0.65)0.4771.24(-0.96,3.44)0.265总人群c铬-1.70(-2.56,-0.85)<0.001-0.22(-0.60,0.16)0.253-2.64(-3.67,-1.61)<0.001镉0.45(-0.56,1.47)0.381-0.36(-0.88,0.16)0.1690.22(-1.13,1.57)0.747铊0.76(-0.54,2.06)0.251-0.20(-0.80,0.40)0.512-0.90(-2.66,0.85)0.313铀-1.32(-2.56,-0.09)0.0360.12(-0.47,0.71)0.6920.17(-1.24,1.58)0.812a回归模型均校正了年龄、BMI、吸烟状况、饮酒状况、收入水平、教育水平、收缩压、舒张压、降压药用药情况、高血压患病年和自然对数转换的尿铅浓度。b因为女性人群中吸烟率低，所以女性人群的回归模型均没有校正吸烟状况。c总人群的回归模型中没有校正性别。71 华中科技大学博士学位论文2.3重金属之间的交互作用首先根据每种重金属的中位数将人群分为高暴露组和低暴露组，然后在每种重金属的高、低暴露组中重复上述多元线性回归分析。大多数关联的方向和估计效应大小均和之前类似（结果未列出）。其中，尿铬和铀的暴露对eGFR水平的影响存在交互作用（如表3.6所示）。在女性高铬暴露组中，尿铀浓度与eGFR水平之间的关联从从原本不明显的关联变得有统计学意义，双倍的尿铀暴露使eGFR降低4.18（95%CI：1.42，6.95）mL/min/1.73m2。同样，在女性的高铀暴露组中也发现铬暴露对eGFR影响的增大，此时双倍的铬暴露可使eGFR降低4.33（95%CI：6.49，2.18）mL/min/1.73m2。肾脏功能随着年龄的增大而降低，称为肾脏的衰老。因此，本研究进一步探讨了铬和铀的共同暴露对肾脏衰老的影响。如图3.2所示，各人群中的eGFR均随着年龄的增加而下降，特别是在50岁以后，下降速度较之前加快。铬和铀的共同高暴露组的eGFR水平显著低于共同低暴露组（P<0.01）。以铬和铀的共同低暴露组作为对照，男性、女性和总的参与人群的eGFR下降幅度分别为6.76（95%CI：1.55，11.96）mL/min/1.73m2、11.36（95%CI：3.66，19.07）mL/min/1.73m2和7.78（95%CI：3.53，12.03）mL/min/1.73m2。72 华中科技大学博士学位论文表3.6不同铬与铀浓度下重金属与eGFR的关联结果a,b男性人群女性人群c总人群d金属β(95%CI)Pβ(95%CI)Pβ(95%CI)P低铬暴露(<1.34μg/L)镉1.20(-1.04,3.43)0.2940.72(-2.14,3.59)0.6191.07(-0.63,2.77)0.216铊2.77(0.08,5.45)0.0441.01(-2.45,4.47)0.5651.74(-0.33,3.80)0.099铀-1.77(-4.18,0.64)0.1500.33(-2.65,3.30)0.829-0.93(-2.77,0.91)0.323高铬暴露(≥1.34μg/L)镉1.01(-1.01,3.02)0.326-0.26(-2.48,1.96)0.8170.50(-0.98,1.97)0.508铊3.02(0.68,5.37)0.0120.93(-2.05,3.92)0.5372.49(0.68,4.31)0.007铀-0.35(-2.59,1.88)0.756-4.18(-6.95,-1.42)0.003-1.78(-3.51,-0.05)0.044低铀暴露(<0.030μg/L)铬-2.78(-4.43,-1.13)0.001-3.25(-5.34,-1.15)0.003-2.94(-4.20,-1.67)<0.001镉1.09(-0.84,3.02)0.269-1.22(-3.61,1.17)0.3140.17(-1.29,1.63)0.820铊1.56(-0.88,4.00)0.2090.71(-2.22,3.64)0.6341.07(-0.77,2.91)0.253高铀暴露(≥0.030μg/L)铬-2.12(-3.64,-0.59)0.007-4.33(-6.49,-2.18)<0.001-2.79(-4.00,-1.58)<0.001镉1.30(-1.21,3.81)0.3102.38(-0.60,5.36)0.1161.96(-0.11,3.81)0.540铊4.52(1.86,7.19)0.0011.92(-2.13,5.98)0.3503.80(1.65,5.94)<0.001a回归模型均校正了年龄、BMI、吸烟状况、饮酒状况、收入水平、教育水平、收缩压、舒张压、降压药用药情况、高血压患病年和自然对数转换的尿铅浓度。b根据尿中重金属浓度的中位数将重金属暴露程度分为低暴露和高暴露。c因为女性人群中吸烟率低，所以女性人群的回归模型均没有校正吸烟状况。d总人群的回归模型中没有校正性别。73 华中科技大学博士学位论文图3.2铬和铀的联合暴露对eGFR水平的影响。图a为男性人群；图b为女性人群；图c为总人群。74 华中科技大学博士学位论文2.4亚组分析男性参与者和女性参与者的亚组分析结果如图3.3和图3.4所示。结果显示男性参与者中尿铬与饮酒状况的交互作用存在统计学意义，而女性参与者中尿铬与所有研究特征的交互作用均具有显著性的或者建议性的统计学意义（P交互<0.10）。另外，在男性参与者中，尿铊与eGFR的正相关关系受到BMI、收入水平、教育水平、尿铅和收缩压水平的影响（P交互<0.05）。在女性参与者中，尿铀与尿铅水平的交互作用存在建议性的统计学关联（P交互=0.07）。在收入水平较高的男性参与者中，尿镉浓度与eGFR水平呈正相关，但收入水平与尿镉浓度的交互作用却不显著。图3.3男性人群的亚组分析结果（Pforinteraction=P交互）75 华中科技大学博士学位论文图3.4女性人群的亚组分析结果（Pforinteraction=P交互）76 华中科技大学博士学位论文此外，本研究根据参与者降压药的使用情况对重金属暴露与eGFR的关联进行了单独的亚组分析。本研究纳入分析的降压药分为利尿剂（diuretic）、β受体阻滞剂（beta-blocker，BB）、血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin-convertingenzymeinhibitor，ACE-I）、血管紧张素受体阻滞剂（angiotensinreceptorblocker，ARB）、钙通道阻滞剂（calciumchannelblocker，CCB）和α受体阻滞剂（alpha-blocker,AB）6大类。如表3.7所示，与未服用降压药的患者相比，服用BB、CCB、ACE-I或ARB的患者的eGFR水平显著降低。使用ACE-I治疗的患者的尿铬水平较高，而使用ACE-I或ARB的患者的尿镉水平较低。另外，使用BB、CCB、ACE-I或ARB的患者尿中铊水平较低（P<0.05）。如表3.8所示，利尿剂或ACE-I的使用对铊暴露与eGFR的关联存在交互作用（P交互<0.05）。另外，利尿剂的使用也对尿铀与eGFR的关联有交互作用（P交互=0.010）。使用利尿剂的人群中尿铀与eGFR呈正相关关系，但是此关联没有统计学意义。77 华中科技大学博士学位论文表3.7不同降压药使用人群的重金属与eGFR的关联结果a,b,c降压药人数eGFR铬镉铊铀未使用降压药22597.0(84.2-111.0)1.37(0.69-2.27)0.86(0.45-1.54)0.40(0.23-0.63)0.029(0.169-0.045)使用降压药529利尿剂10195.9(82.3-111.0)1.31(0.75-1.81)0.77(0.45-1.51)0.37(0.22-0.49)0.033(0.022-0.052)BB9392.9(81.4-106.0)*1.35(0.67-2.09)0.78(0.41-1.40)0.33(0.19-0.54)*0.033(0.020-0.051)CCB17592.3(80.2-106.8)*1.35(0.69-2.18)0.81(0.39-1.54)0.28(0.18-0.49)*0.030(0.020-0.049)ACE-I11492.0(76.0-106.2)*1.61(0.91-2.55)*0.76(0.36-1.15)*0.29(0.17-0.51)*0.032(0.021-0.051)ARB15793.2(78.5-107.5)*1.27(0.49-2.06)0.63(0.36-1.14)*0.29(0.18-0.50)*0.025(0.017-0.046)AB26100.9(87.0-117.7)1.18(0.67-1.83)0.63(0.35-2.24)0.38(0.16-0.51)0.023(0.016-0.036)BB：β受体阻滞剂，ACE-I：血管紧张素转化酶抑制剂，ARB：血管紧张素受体阻断剂，CCB：钙通道受体抑制剂，AB：α受体阻滞剂。a同一个参与者可能使用多种降压药。b使用其他降压药的参与者没有纳入分析（N=180）。*与未使用降压药的人群差异具有显著性，P<0.05。78 华中科技大学博士学位论文表3.8各种降压药使用人群中尿中重金属与eGFR水平的关联分析a,b降压药使用c镉P铬P交互交互铊P交互铀P交互情况未使用降压药-2.45(-4.22,-0.68)0.29(-1.85,2.43)0.17(-2.57,2.90)-2.63(-4.89,-0.37)降压药使用利尿剂-2.14(-4.67,0.38)0.999-0.34(-4.32,3.63)0.7477.13(2.41,11.85)0.0411.67(-1.98,5.31)0.010BB-0.94(-3.48,1.60)0.0820.63(-3.22,4.49)0.4550.96(-3.56,5.48)0.356-5.23(-9.92,-0.54)0.952CCB-2.82(-4.91,-0.73)0.8110.45(-1.83,2.72)0.7000.87(-2.26,4.01)0.394-1.66(-4.84,1.51)0.331ACE-I-1.67(-3.99,0.65)0.2062.12(-1.20,5.44)0.4146.55(2.92,10.17)0.019-0.87(-4.70,2.96)0.191ARB-3.07(-5.15,-0.98)0.761-0.56(-3.75,2.63)0.7662.19(-1.55,5.93)0.081-2.97(-6.02,0.09)0.509AB4.74(-5.98,15.45)0.272-1.60(-7.44,4.24)0.663-1.04(-7.85,5.78)0.7364.15(-4.11,12.40)0.097BB：β受体阻滞剂，ACE-I：血管紧张素转化酶抑制剂，ARB：血管紧张素受体阻断剂，CCB：钙通道受体抑制剂，AB：α受体阻滞剂。a同一个参与者可能使用多种降压药。b使用其他降压药的参与者没有纳入分析（N=180）。cP交互为降压药的使用对重金属与eGFR之间关联的交互作用P值，以未使用降压药的人群为对照。79 华中科技大学博士学位论文3讨论在本研究中，尿铬浓度与eGFR水平之间呈负相关关系，且在各种统计模型中均保持一致。尿铀浓度与eGFR水平在总人群中呈现负关联性，在高铬暴露的女性参与者中此关联性更强。同时，铬和铀的联合暴露对eGFR水平的影响存在交互作用，能够降低高血压患者eGFR水平，尤其是女性高血压患者eGFR水平。然而，尿铊浓度与eGFR水平的关联与预期相反，其二者之间存在显著的正相关关系，并且这种关联仅限于男性参与者。本研究结果提示重金属的暴露对eGFR水平的影响存在性别差异。三价铬被认为是体内胰岛素、糖和脂质代谢的必需元素，其六价形式则具有致癌性[141]。尿铬多用于普通人群的生物监测，在尿液中铬主要以三价形式存在。近来有报道指出，过量的三价铬暴露可能具有细胞毒性和基因毒性[142]。肾脏是铬的主要靶器官，在急性的高剂量暴露或慢性的低剂量暴露后，铬可对肾脏产生危害作用[143]。在使用铬化合物处理的动物模型中，铬能够在肾皮质中蓄积，并对近端小管造成损害。铬暴露还能导致活性氧簇的产生，由此引发内质网应激反应并造成线粒体损伤[17;130]。有报道指出铬酸的大量吸收能引起急性肾小管坏死和肾脏衰竭[144]。在中国进行的一项关于115名参与者的职业暴露研究中[45]，研究者发现铬的职业性暴露具有肾毒性效应，铬酸盐的职业接触能导致肾小管和肾小球的复杂性损伤。除铬的职业暴露研究外，关于普通人群中长期、低剂量铬暴露的研究较为有限。Tsai等人[145]在一项包含了360名台湾成年人的流行病学研究中发现，环境铬暴露能够降低参与者的eGFR（男性中尿铬的中位数为0.84μg/L，女性中尿铬的中位数为0.83μg/L）。该研究结果与本研究发现一致。铀在自然环境中普遍存在，饮用水是日常铀暴露的主要途径。铀暴露所导致的肾脏不良结果主要包括蛋白尿、糖尿和肾小管损伤，其造成的毒性大小取决于其剂量和持续时间[48;146]。动物实验和人群研究中都发现饮用水中的铀浓度与各种肾毒性结果相关[147;148]。但是，使用内暴露的生物标志物反映人体铀暴露水平的相关研究很少。美国健康和营养调查研究（9025人）[149]发现美国人群的尿铀浓度与微量白蛋白尿之间存在显著相关性（尿铀的中位数为0.009μg/L），这与本研究结果相近由于日常生活中的金属暴露具有相似的来源，所以体内金属浓度之间通常彼此相关。观察性研究和实验证据表明，这种多金属的共同暴露可能会产生不同于单一金属独立效应的联合作用[150]。然而，现有的研究主要集中在单个金属暴露的毒性效应，较少对多种金属的联合暴露所产生的肾毒性作用进行系统的风险评估。在一项针对14778名20岁以上成年人的研究中，Navas-Acien等[151]发现普通人群低水平的镉和铅的联合暴露在肾脏不良结局中存在协同作用。镉和铅的同时高暴露能够使蛋白尿的患病风险增加4倍，并降低eGFR水平。在台湾进行的一项研究80 华中科技大学博士学位论文[145]发现，一般人群中的铬、铅和镉的暴露所造成的肾毒性作用具有三因子交互作用。然而，在本研究中，我们没有观察到镉和铅暴露的交互作用，仅观察到了铬和铀的联合暴露对肾功能影响的交互作用。关于这两种重金属联合暴露所致的联合效应，其中一个可能的解释是铬和铀对细胞氧化还原电位的改变具有同向作用[44]。此外，这种效应也可能是由于铀通过消耗细胞内的抗氧化剂（例如谷胱甘肽和谷胱甘肽还原酶）破坏机体的氧化防御，进而加剧铬导致的氧化应激损伤而引起的[17;146]。丝裂原活化蛋白激酶途径也有可能参与铬和铀的协同作用[152]。与铬和铀的潜在肾毒性不同，镉的肾毒性是比较明确的，相应的动物实验证据和流行病学证据也较为充分[40;131]。然而，本研究并没有在高血压人群中发现尿镉水平与eGFR水平之间的关联。尽管亚组分析的结果提示在收入水平较高的男性人群中镉暴露与eGFR水平之间存在较弱的正相关关系，但这种关联不稳健，可能是由于残余混杂或者潜在偏倚所造成的[153;154]。一些研究发现，镉暴露与肾脏疾病的关联在高血压患者中比较明显，而在正常血压人群中不显著[49;50]。但这些研究没有考虑糖尿病、BMI和性别等已知肾脏疾病的危险因素的混杂影响，因此结论的解释需要谨慎。此外，也有一些研究发现低剂量水平下的镉暴露与肾功能之间并不存在关联[145]。铊是一种剧毒金属，对各种器官都有不良影响。其肾毒性作用机制主要包括谷胱甘肽代谢紊乱、线粒体功能受损和氧化应激[46]。在动物研究中，急性和亚急性的铊暴露都会引起肾小管的病理变化[155;156]。在注射了铊的大鼠模型中，研究者观察到大鼠的血清肌酐水平会升高，而肾小球滤过率会降低[46]。然而，与实验假设相反，本研究发现在男性人群中尿铊水平与eGFR呈正相关。Shelley等[157]在一项关于684名铅工人的研究中也观察到了类似的结果。该研究发现，即使在调整了铅暴露剂量、尿锑和尿镉水平之后，铅工人中尿铊的浓度与eGFR水平依然呈正相关。本研究中铊与eGFR之间的正相关关系可能是由于反向因果关系。反向因果关系是指eGFR降低的同时也会降低毒物的总滤过率，从而直接造成尿液中该毒物水平的降低[129;139]。当按照eGFR的水平将研究人群分成三分位数后，铊浓度与eGFR的正相关关系仅限于eGFR处于最低分位数的参与者，这支持了我们上述关于反向因果关系的假设。此外，由于在铅暴露剂量的亚组分析中，尿铊与eGFR水平只在高铅暴露的男性人群中显著关联。因此我们认为肾小球的高滤过是另外一种可能的解释。最初，肾小球高滤过通常被认为是高蛋白负荷后GFR大幅增加的一种应激现象[158]。随后的研究发现，肾小球高滤过的发生与糖尿病、肥胖以及镉和铅的暴露高度相关[42;157;159;160]。在与镉或铅暴露相关的肾小球高滤过中，研究者观察到GFR会出现初始增加然后下降的现象，这提示肾功能储备的丧失，同时也是慢性肾脏疾病的指征[42;136;157]。本研究结果提示与铅有关的肾小球高滤过可能会影响81 华中科技大学博士学位论文铊暴露与肾功能之间的关联。Hwangbo等人[42]在韩国进行的研究与我们的结果类似：该研究包含了1909个年龄≥20岁的韩国人，结果提示与铅有关的肾小球高滤过可能掩盖镉暴露与肾功能的真实关联。在另外一项研究中，Shelley等人[157]发现即使234名工人的血铅水平与eGFR呈负相关，其尿铊水平仍与eGFR呈正相关，这提示铊暴露单独诱导肾小球高滤过的可能性。然而，目前我们还无法找到与之相关的动物实验或者人群研究证据，因此无法确定这个猜测。降压药物的使用是重金属的肾毒性作用研究中一个重要的混杂因素，报道指出某些降压药能够影响肾功能[161]。在本研究中，我们发现利尿剂的使用对尿铊和尿铀与eGFR的关联有交互作用，ACE-I的使用对尿铊和eGFR之间的关联有交互作用。利尿剂的作用主要是扩大细胞外液和血浆容量，因此会增加了肾脏的血流量，尤其是肾小管周围毛细血管的血流量[162]。本研究中观察到的利尿剂对重金属肾毒性的影响可能是由于尿液增加所致。由于排尿加快，重金属的排泄会加速，进而减少机体内暴露剂量。肾损伤是使用ACE-I后的主要不良反应，与其降血压的作用机制直接相关[163]。在我们的研究中，与其他组相比，使用ACE-I的参与者eGFR水平的中位数最低。由于在未使用降压药物的参与者中没有发现尿铊与eGFR的关联，因此我们推测尿铊与eGFR的正相关可能是与低eGFR或肾损伤有关，这也间接支持了我们之前关于反向因果关系的假设。此外，据报道，一些降血压药物是有机阳离子转运蛋白或有机阴离子转运蛋白的底物，所以可能竞争性地抑制近端小管转运蛋白对肌酐的分泌作用，进而影响本研究中的关联[164-166]。重金属暴露对肾功能的影响作用可能存在性别差异。在本研究中，我们发现女性对重金属肾毒性更易感，这一发现在其他研究中也得到了支持。例如，在镉污染地区，痛痛病这种肾脏疾病和骨损伤并发的复杂性疾病，主要的易感人群就是女性[167;168]。从肾损伤的相关参数来看，同样是经过氯化镍注射的大鼠，雌性大鼠的肾损伤程度要大于雄性大鼠[169]。然而，关于铬、铊和铀毒性作用存在性别差异的证据有限。一些重金属（如镉和铬）的潜在类雌激素作用被认为是造成性别差异的可能原因。类雌激素金属具有与雌激素受体形成高亲和力复合物的能力，进而导致其对各种激素相关途径（如肝I期和II期药物代谢）产生不利影响[169;170]。据报道，女性比男性更容易受到环境雌激素的影响[171]。不同性别之间的重金属暴露和吸收差异是另一种关于性别差异的可能假设。在相同的暴露情况下，女性对镉的保留率通常高于男性[172]。Nishijo等人[173]观察到，在相似的镉摄入水平下，女性的尿镉水平、β2-微球蛋白和氨基酸水平高于男性。另外，还存在其他潜在机制，如钙和维生素D的性别相关代谢机制[174]。本研究的优点主要包括：（1）排除了多种被认为是肾疾病危险因素（如糖尿病，肥胖）的疾病[125]；（2）考虑了其他金属的混杂效应，并系统地评估了多种金属与肾功能之间的相互作用效应。但是，本研究也存在一些不足：（1）本研究是82 华中科技大学博士学位论文在医院进行的，因此选择偏倚是不可避免的。本研究的结果解读需要谨慎；（2）目前的研究结果是基于探索性的横断面研究，因此无法确定重金属暴露与肾功能之间的因果关系。这也是本研究中对于潜在的反向因果关系进行分析讨论的主要原因。本研究结果需要在前瞻性研究中进一步确认；（3）本研究利用单次尿液样本去评估体内重金属的内暴露水平，这可能导致暴露的错误分类[98]；（4）据报道，六价铬比三价铬毒性更大。而尿铬中主要为三价铬，所以使用尿铬作为生物标志物无法准确评估和区分铬在体内的两种价态形式及其暴露水平；（5）由于本研究选择的是具有特定疾病的人群（高血压人群），疾病的各个方面可能会以某种方式混淆研究结果，因此本研究所涉及的相关机制比普通人群更为复杂。4结论本研究提供了关于镉和铅以外的重金属肾毒性效应的相关人群证据。这是首次探讨高血压人群中铬、镉、铊和铀的暴露与肾功能的关联的研究。我们首次发现铬和铀的肾毒性对高血压患者具有协同作用。此外，重金属与eGFR的关联存在潜在的性别差异。本研究结果表明消除或减少肾毒性金属的暴露对高血压人群的预后有重要的意义。鉴于我国重金属污染状况严重，本研究为预防高血压患者并发CKD的干预策略提出了新方向。83 华中科技大学博士学位论文结论本研究以武汉市普通人群为研究对象，通过横断面和病例-对照的研究设计，采用内暴露标志物评估环境金属内暴露水平，应用多种统计学方法，分别从环境、基因及其交互作用三方面阐述了高血压的危险因素，并进一步探讨了环境金属暴露对高血压病人预后的影响，为高血压的预防和控制提供了有价值的线索和依据。1.采用横断面的研究设计，以尿样金属作为生物标志物来反映机体内20种金属的内暴露水平，使用多变量回归模型来评估金属与高血压的关联，并结合多金属模型对多种金属的联合暴露效应进行分析。结果表明，尿样中钒、铁、锌和硒的浓度与高血压的患病风险存在显著性的剂量-反应正相关，而尿样中汞浓度与舒张压存在显著性的剂量-反应正相关。2.采用病例-对照的研究设计，对36个SNP与高血压之间的关联以及36个SNP与重金属暴露之间的交互作用进行探讨。结果表明，eNOS基因的rs1008140、CAT基因的单倍型与高血压患病风险之间存在显著关联。在关于高血压患病风险的交互作用分析中，eNOS基因的rs2566508和rs2566511与镉暴露在相乘模型中存在交互作用，而eNOS基因的rs1008140和rs3918196与镉暴露则在相加模型中存在交互作用；eNOS基因的rs2566508和rs2566511、CAT基因的rs10488736和rs17881846、MT2A基因的rs1610216则与汞暴露在相乘模型中存在交互作用。3.采用横断面的研究设计，使用多元线性回归模型对高血压人群中重金属暴露与肾功能的关联进行探讨，并对重金属之间的联合暴露作用进行分析。结果表明，铬和铀的环境暴露可能导致高血压患者的eGFR下降，重金属暴露与eGFR的关联可能具有性别特异性。本研究的不足之处以及后续研究方向：1.本研究采用横断面和病例-对照的研究设计，只能对潜在的关联进行探讨性地分析，不能推断二者的因果关系。本研究结果需要在前瞻性研究中加以证实。2.本研究的样本来自医院以及体检中心，这可能会导致选择偏倚。后续研究应该在社区人群中进行验证。3.本研究采用单次尿液样本来评估金属的内部暴露水平，可能会导致暴露估计的偏差。后续研究应该使用24h尿样或者多次尿样进行尿中金属的检测水平的测量。另外，本研究使用同一份尿样同时测量20种金属元素的水平，有可能会导致测量误差，进而增加假阳性率。因此，本研究结果需要进一步确认。84 华中科技大学博士学位论文4.本研究中采用尿中金属浓度作为内暴露的生物标志物，但是尿样不能完全反映20种金属实际的内暴露水平，后续的研究应在不同生物机制中加以证实（比如血液、头发和趾甲等）。5.基因多态性与疾病的关联研究容易出现假阳性结论，因此不能仅从一个阶段的研究中得出可靠结论。本研究的基因关联结果需要在下一阶段的其他区域人群中加以验证。另外，本研究还会继续探索相关基因的甲基化及基因表达等与金属心血管毒性是否存在潜在的交互作用。85 华中科技大学博士学位论文参考文献[1]KearneyPM,WheltonM,ReynoldsK,etal.Globalburdenofhypertension:analysisofworldwidedata.Thelancet,2005,365(9455):217-223.[2]PoulterNR,PrabhakaranD,CaulfieldM.Hypertension.Lancet,2015,386(9995):801-12.[3]WuY,HuxleyR,LiL,etal.Prevalence,awareness,treatment,andcontrolofhypertensioninChina:datafromtheChinaNationalNutritionandHealthSurvey2002.Circulation,2008,118(25):2679-86.[4]陈伟伟,高润霖,刘力生,etal.《中国心血管病报告2017》概要.中国循环杂志,2018,(01):1-8.[5]HeJ.HypertensioninChina:alargeandincreasingpublichealthchallenge.JHypertens,2016,34(1):29-31.[6]WangB,LiZ,MaY,etal.Associationofpolycyclicaromatichydrocarbonsinhousewives'hairwithhypertension.Chemosphere,2016,153:315-21.[7]ShankarA,TeppalaS.UrinarybisphenolAandhypertensioninamultiethnicsampleofUSadults.JEnvironPublicHealth,2012,2012:481641.[8]CooganPF,WhiteLF,YuJ,etal.PM2.5andDiabetesandHypertensionIncidenceintheBlackWomen'sHealthStudy.Epidemiology,2016,27(2):202-10.[9]ValeraB,JorgensenME,JeppesenC,etal.ExposuretopersistentorganicpollutantsandriskofhypertensionamongInuitfromGreenland.EnvironRes,2013,122:65-73.[10]宋伟,陈百明,刘琳.中国耕地土壤重金属污染概况.水土保持研究,2013,(02):293-298.[11]谭吉华,段菁春.中国大气颗粒物重金属污染、来源及控制建议.中国科学院研究生院学报,2013,(2):145-155.[12]王海东,方凤满,谢宏芳.中国水体重金属污染研究现状与展望.广东微量元素科学,2010,(1):14-18.[13]丁春光,潘亚娟,张爱华,etal.我国八省份一般人群血和尿液中砷水平及影响因素调查,2012.[14]丁春光,潘亚娟,张爱华,etal.中国八省份一般人群血和尿液中铅、镉水平及影响因素调查.中华预防医学杂志,2014,(2):91-96.[15]CDC,2017.FourthReportonHumanExposuretoEnvironmentalChemicals,UpdatedTables,January2017.(Availableathttps://www.cdc.gov/exposurereport/pdf/FourthReport_UpdatedTables_Volume1_Jan2017.pdf[accessed20March2018]).[16]WangN,ChenC,NieX,etal.BloodleadlevelanditsassociationwithbodymassindexandobesityinChina-ResultsfromSPECT-Chinastudy.SciRe86 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华中科技大学博士学位论文综述金属暴露与心血管疾病综述：吴伟祥审阅：鲁青近几十年来，我国经历了一段经济改革和扩张的时期，但环境污染问题也随之日愈严重[1]。重金属因其高毒、广泛、普遍以及难降解等特性，已经成为了我国环境污染的一大难题，并受到了研究者们越来越多的重视和关注。研究显示，在我国主要致死致残的前15个危险因素中，就有3个因素——环境颗粒物污染、燃烧所致室内空气污染及铅污染，与重金属污染有关[2]。在中国，重金属污染可以说是无处不在。除了职业性暴露之外，普通人群主要的重金属暴露来源有土壤、饮用水、食物和空气。据统计，中国仅水体重金属污染率就高达80%[3]。而空气和灰尘的健康危害研究显示，其不良结局与其内重金属的成分密切相关。心血管疾病（cardiovasculardisease,CVD）是中国的主要死亡原因。据《中国心血管病报告》报道，我国心血管病现患人数约为2.9亿。心血管病死亡率居首位，高于肿瘤和其他疾病，占居民疾病死亡构成的40%以上[4]。总体上看，我国CVD患病率及死亡率仍处于上升阶段，今后10年心血管病患病人数仍将快速增长[4;5]。CVD所造成的经济负担越来越大，包括直接（如门诊和急诊就诊，住院和医疗费用）和间接（如生产力损失，职业成本和过早死亡）费用。据统计，2012年，急性心肌梗塞、颅内出血和脑梗塞患者入院总支出分别为49.6亿、147.1亿和298.5亿。另外，CVD也是中国预期寿命缩短的主要原因[2]。CVD已成为我国重要的公共卫生难题，迫切需要有效的预防与控制措施。CVD的已知危险因素包括肥胖、高血压、吸烟、不健康饮、缺乏身体活动、糖尿病和血脂异常等。最近的流行病学和实验证据表明，重金属暴露在CVD的发展中起着重要作用[6-8]。与空气污染物一样，重金属可能通过共同的作用通路去导致CVD的发生。研究表明，重金属暴露与血压、脂质代谢、动脉粥样硬化以及内皮损伤和功能障碍的变化都有关联[9;10]。本文就五种常见重金属——铅、镉、汞、砷与锰的暴露与代谢特征，以及其与CVD的健康损害和相关机制进行系统综述。1砷（Arsenic,As）1.1暴露、吸收与代谢普通人群中无机砷的暴露途径主要是饮用水（地壳中的砷污染和工业或者矿藏来源）和食物，尤其是大米、谷粒还有水果[11-13]。有机砷的暴露主要跟鱼肉的摄入有关[14]。在过去几十年中，尽管砷的职业暴露状况（冶炼过程、农药食用、99 华中科技大学博士学位论文除草剂与木材防腐剂的使用）有了显著性的改善，但饮用水中的砷依旧是一个全球性的环境健康问题[11]。2006年，美国环境保护署（U.S.EnvironmentalProtectionAgency，EPA）根据相关的健康研究结果将饮用水中砷的最大污染浓度从0.05mg/L修改为0.01mg/L，这也是世界卫生组织（WorldHealthOrganization，WHO）认可的居民安全饮水标准。按照这个标准，在美国差不多有一千万的居民居住在高砷暴露区域[11;12;15]。而在亚洲地区，砷中毒的人数比世界其他地区总和还多。其中，中国饮水型砷中毒病区主要分布在内蒙古、新疆、山西、吉林、台湾等地区[16]。据报道，饮用水中95%以上的砷会被胃肠系统吸收，食物中大约75%的砷会被人体吸收，吸收率取决于食物的基质、含水量和胃液的pH值。当砷被人体吸收后，无机形式的砷（砷酸盐和亚砷酸盐）会被代谢成单甲基化和二甲基化化合物，与未被代谢的无机砷一同通过尿液排出体外[17]。尿中无机砷和甲基砷的浓度总和是砷最常见的生物标志物，用以评估各种来源的无机砷暴露。尿中砷代谢物的分布通常为无机砷10-30%，甲基胂酸（Methanearsonicacid，MMA）10-20%，二甲基胂酸（Dimethylarsinicacid，DMA）60-80%。此分布的个体间差异较大，主要与砷代谢相关基因的多态性有关[18]。尿液中高比例的甲基胂酸和低比例的二甲基胂酸与癌症和CVD的风险有关，而低水平的甲基胂酸和高水平的二甲基胂酸则与肥胖和糖尿病的发病有关[18-20]。砷代谢过程中需要甲基化的参与，而S-腺苷甲硫氨酸作为此过程中的甲基供体在各组织中的含量不一样，因此造成了这些代谢物的健康效应在不同组织中存在差异[21;22]。营养状况差（特别是叶酸缺乏）与甲基胂酸的水平和不良健康结局的风险增高都有关联。1.2流行病学证据台湾、孟加拉国、和智利的研究证据一致表明，饮用水中高水平的砷（>100μg/L）是CVD的一个重要危险因素。职业病研究中关于健康工人效应的相关研究支持了上述的观点[23-26]。早期的低剂量砷暴露（<100μg/L）的相关研究受限于多个方面，如研究设计与检验效力[6;23;27]。在关于砷暴露中的前瞻性队列研究中，饮用水中低水平的砷含量与CVD的发生存在关联，尤其是冠心病。在来自美国农村的印第安人、白人和西班牙裔社区进行的前瞻性研究中发现，在低于10μg/L和高于50μg/L的砷暴露水平下，砷暴露与冠心病的发病率和死亡率都存在显著性的统计学关联[28;29]。尽管在这些研究中没有发现砷暴露的效应阈值，但是这些研究的暴露水平大多在5μg/L以上。然而，在一个关于砷的心血管毒性的综述中，研究者得出了小于100μg/L的砷暴露与心血管结局不存在关联的结论[30]。但这个综述不是系统性的，且评价的标准也不清晰，所以结论有待商榷。很多实验性与流行病学研究也发现砷暴露除与临床的CVD结局有关外，也与很多明确的CVD危险因素有关，比如高血压，、心电图异常（延长的QT间隔）、糖尿病和肾脏疾病[14;31-33]。在其中一个研究中，在调整了高血压、糖尿病和肾功能指标（肾小球滤过率）的100 华中科技大学博士学位论文混杂影响后，砷暴露与CVD发病率的关联强度减弱了，证明这些危险因素可能包含在砷暴露与CVD的关联通路中。1.3机制证据砷的心血管毒性可能与已知的CVD的众多病理通路中的某一条有关，它的毒性作用大小取决于暴露的持续时间、频率和水平以及被暴露者的健康与营养水平[32]。砷致CVD的潜在机制包括炎症信号的上调、氧化应激的增强、核因子-κB的激活和对一氧化氮活性的抑制[34;35]。一氧化氮能够促进内皮细胞和平滑肌细胞的增殖、细胞粘附、血小板聚集和动脉血管收缩。慢性砷暴露也与心脏电生理学变化相关（如QT间期延长），后者是心脏性猝死的危险因素之一[36-38]。实验研究证实砷暴露能造成动脉粥样硬化。将载脂蛋白E缺失的小鼠暴露于含有亚砷酸盐（10-20μg/mL）的饮用水中18-24周，主动脉内膜出现严重可辨的损伤的比例要比在未暴露的小鼠更高[39;40]。与未处理的小鼠相比，用砷处理过的小鼠的血浆、血清和动脉粥样硬化病变中能检测到更高浓度的促炎性趋化因子、细胞因子和氧化应激标志物，这些都与动脉粥样化的发生和心血管的风险相关[40]。该结果与此前关于砷暴露与颈动脉内-中膜厚度的关联研究的结果保持一致[41;42]。颈动脉内-中膜厚度是动脉粥样硬化的标志物，其与缺血性心脏病和中风的发生、发展关系密切。有其他报道指出，砷的毒性作用与糖尿病的发展有关，包括糖异生和β细胞功能受损，而糖尿病是心血管的危险因素之一[43;44]。尽管上述的大部分机制都是从高水平砷暴露的研究中得出的，但是也有证据表明，即使在相对较低的砷暴露水平，新血管形成、血管生成和血管重塑的现象也会出现[45]。砷可能会通过介导表观遗传而发挥毒性，包括DNA甲基化和组蛋白乙酰化[46-48]。在动物实验中，经胎盘的砷暴露会导致后代中心血管效应的发生。在先前关于智利人群中不同水平的砷暴露下的孕妇和儿童在心血管患病率的差异的研究得到了相近的结果，这些证据都强调了早期砷暴露在CVD的重要作用[25]。有代谢组学的研究发现，糖尿病的有无会造成研究对象对砷暴露不同的响应[49]。虽然我们仍然需要更多的研究来了解砷暴露与CVD的关联，但这些早期的研究提示我们应该从基因，表观遗传和代谢通路的交互作用入手，去探讨砷暴露在CVD和其他慢性疾病的发生发展中的作用。2镉（Cadmium，Cd）2.1暴露、吸收与代谢镉是锌矿、铅矿和铜矿的开采、冶炼和精炼的副产品。自1817年发现以来，镉在整个二十世纪的使用量持续增加，其主要运用于镍镉电池、金属镀层和塑料稳定剂[50]。工业排放物、燃料燃烧和含镉磷酸盐肥料中的镉会污染土壤。土壤中的镉会与有机基团结合，进而被蔬菜、谷类、烟草等植物富集吸收。因此食物是101 华中科技大学博士学位论文镉的一个重要暴露途径，包括贝类和器官肉类（肝脏和肾脏）。在中国，土壤中的镉含量从0.003mg/kg到9.57mg/kg，南方土壤中的镉含量高于北方[51]。另外一个关于全国31个省份的食物中镉含量的调查结果与此研究结果一致：南方人群（4.56μg/kg·bw）从饮食来源摄入的镉比北方人群（2.63μg/kg·bw）要高，据此估算出的终身患癌风险南方成年人也高于比北方成年人[52]。由于烟草中的高镉含量，吸烟（包括主动和被动吸烟）成为可吸入镉的主要来源，平均一根烟含1-2μg的镉。大气污染也是可吸入镉的一个重要暴露途径，特别是在工厂区域（如焚化炉）的附近[53]。虽然只有1-5%的摄入镉和25-50%的吸入镉会被人体吸收，但是因为镉在人体内的生物半衰期非常长（15-45年），因此其健康危害需要重视[54]。镉进入人体后会在全身广泛分布，然后进行性地蓄积在肾脏（包含体内大概一半的镉蓄积量）、肝脏、胰脏和中枢神经系统。在流行病学研究中，血样和尿样是镉暴露的常用生物标记物，分别用以反映近期暴露和总暴露。2.2流行病学证据流行病学研究，包括生态学、病例-对照、横断面和前瞻性的队列研究，都证实了镉暴露与CVD存在关联。镉暴露与CVD、冠心病、中风和心力衰竭的发生率以及死亡率存在关联。在一项关于中国镉职业暴露人群的研究中，Chen等人[55]发现收缩压和舒张压均随着血镉的增加而增加。女性血压与血镉呈正相关，而高血压患病率也随着血镉的增加而增加。另外，多个研究也发现了镉暴露与心血管危险因素的关联：Messner等人的报道提示镉暴露与颈动脉内-中膜厚度的含量显著相关，Fagerberg等人的研究提示镉暴露与颈动脉斑块的发病率有关，而Tellez-Plaza等人则发现镉暴露与外周动脉疾病的发病率与患病率都存在关联[56-59]。这些证据的主要问题在于无法解释清楚这些观察到的关联是不是由镉单独引起的，还是这仅仅只是抽烟的危害作用的一个间接反映。因此吸烟状态在镉相关研究中是一个重要的因素，需要调整其混杂影响。在最近的一个meta分析中，作者以吸烟状态作为分层因素进行了分析[7]。该研究发现在不吸烟者中，将处于最低镉暴露组别的人群作为参照组，处于最高镉暴露组别的人群罹患CVD的合并危险度为1.27(95%CI:0.97,1.67)，这个也为上述假设提供了证据支持。血镉与尿镉浓度也被发现与血压和肾功能有关，这些都是CVD的重要危险因素[60;61]。2.3机制证据镉通过氧化应激的相关机制对血管组织造成损伤，诱导内皮功能障碍以及导致动脉粥样硬化的发生[57]。镉可以从巯基将铁和铜取代出来，然后通过Fenton反应生成活性氧自由基，并间接消耗抗氧化剂（如谷胱甘肽）和解毒酶[62]。镉还可以通过与锌竞争结合金属硫蛋白（一类参与抗氧化反应的富含半胱氨酸的蛋白质）和通过结合谷胱甘肽而破坏机体对氧化应激的生理应激反应[63]。镉的其它潜在作用机制包括钙通道的激动作用、内皮屏障功能的破坏、细胞坏死的诱导和血管扩102 华中科技大学博士学位论文张物质的抑制[62;64-66]。此外，镉还能通过高血压和肾脏作用间接地引起动脉粥样硬化的发生。实验性研究中发现，镉暴露与血压的持续升高有关，这与大多数的流行病学研究结果一致[67]。近来研究发现，慢性的低剂量镉暴露与肾透析、蛋白尿和近曲小管功能不全的发生率以及肾小球滤过率的降低存在关联[68-70]。3铅（Lead，Pb）3.1暴露、吸收和代谢铅暴露的主要途径是空气、灰尘以及食物、土壤和饮用水[71]。自20世纪70年代以来，许多国家都开始在汽车燃料、涂料和焊料中禁止铅的使用，因此大幅度地减少了人们的铅暴露[72]。但如今儿童和成年人的铅暴露状况依然很严峻：电池、玩具和釉陶的过程中会使用铅；家居涂料，管道和土壤中也会存在铅的污染；工业来源以及烟草烟雾排放的废气中也含有铅[73]。统计结果显示，1997-2000年，中国儿童血铅浓度逐年升高，平均值为98.56μg/L。自2000年禁用含铅汽油之后，血铅年平均值总体呈下降趋势，2001-2010年中国儿童血铅平均值为69.61μg/L[74]。从铅暴露风险来看，我国儿童的铅暴露风险远高于北美以及欧洲[75]。在我国某些受电子产品污染的地区，如广州，儿童血铅的浓度高达15.3μg/dL[76]。而铅中毒事件更是时有发生。相关研究表明即使在低剂量的铅暴露水平下，铅暴露和心血管健康不良后果的风险存在关联[8]。由于铅会蓄积在骨骼中，半衰期长达十年，因此20世纪30年代至70年代出生的成年人不但要面临着过去的铅暴露带来的身体负担，还要面临着现在和将来的健康影响[77]。人体从呼吸道吸入铅后，几乎只要能通过肺泡膜的铅都会被全部吸收。从消化道进入体内的铅中，大概有3%到70%会被吸收，吸收比例取决于年龄、进食和营养状态（钙和铁）。在人体中，大部分铅（>95%）储存在钙化组织中，主要是骨骼。铅在骨中的半衰期在几年到几十年之间，这个时间与骨的类型，代谢状态和个体年龄有关。在流行病学研究中，血铅和骨铅可用来评估铅暴露和内部蓄积量[77]。血铅也被用作生物监测，是铅暴露的常用生物标志物，目前适用于工人和儿童的铅的相关安全标准也是基于血铅浓度制定的。3.2流行病学证据前瞻性和横断面研究发现，铅暴露与心血管结局有关。在美国普通人群中，将研究对象按照血铅水平的三分位数分组[8]。与最低的三分位数（<1.93μg/dL）相比，血铅水平处于最高的三分位数（≥3.63μg/dL）的个体心肌梗死和卒中死亡的相对风险分别为1.89和2.51[78]。骨铅的基线水平与冠心病的发病率和死亡率有关[79;80]。横断面研究发现，在校正了人口统计学和心血管危险因素后，血铅水平与外周动脉疾病相关。Muntner等[81]发现与处于血铅最低四分位数（<1.06μg/dL）的人群相比，处于血铅最高四分位数（≥2.47μg/dL）的人群罹患外周动脉疾病的103 华中科技大学博士学位论文相对危险度为1.92(95%CI:1.02,3.61)。而Navas-Acien等[82]发现与第一四分位数的人群相比，处于血铅的第二、第三和第四四分位数的研究对象罹患外周动脉疾病的风险分别为1.63(95%CI:0.51,5.15)，1.92(95%CI:0.62,9.47)和2.88(95%CI:0.87,9.47)。上述研究结果都是建立在低水平的铅暴露基础上的，都证实了即使是低水平的铅暴露依然是CVD的重要危险因素。3.3机制证据铅暴露能够促进血管平滑肌细胞和成纤维细胞的氧化应激、炎症、内皮功能障碍和增殖，并抑制心率变异性[8;83]。在分子水平上，铅可以结合多种蛋白质，在许多生物通路中模拟钙的活性[84]。铅暴露还可以下调一氧化氮和可溶性鸟苷酸环化酶，刺激肾素-血管紧张素系统和交感神经系统，并激活蛋白激酶C的活性[83]。在啮齿类动物实验中，与未处理的对照组相比，慢性铅暴露的实验组主动脉介质厚度、组织中胶原百分比以及血压水平都有所增加[85]。Navas-Acien等人[8]将大约30个流行病学研究数据和全世界约6万个个体的数据进行了meta分析，估计出血液中铅含量每升高两倍，收缩压就会升高0.81-1.25mmHg，且还没有证据表明这种升高存在阈值。关于铅暴露与心室壁参数之间的关联的研究表明，血液中的铅水平与美国成年人、美国电池制造工人和波兰工人的左心室肥厚和肿块有关，但与中国工人无关[8]。此外，中至高水平的铅暴露有明确的肾毒性证据，而低水平的铅暴露对慢性肾脏病的发展和进展也有一定的危害[69;81]。在Lin等人的一项随机试验中发现与安慰剂组相比，铅螯合疗法能使肾小球滤过率增加8.1mL/min/1.73m2[86]。铅可能会诱发表观遗传的修饰。中国的一个职业性铅暴露研究发现铅的毒性与DNA甲基化之间存在关联，LINE-1启动子的甲基化程度可能是铅毒性的一个表观遗传生物标志物[87]。其他国家的研究证实了铅暴露与DNA甲基化的关联，并发现了铅暴露与低甲基化之间的趋势[88;89]。在表观基因组关联研究中，铅暴露与COL1A2基因启动子中CpG位点的甲基化负相关[88]。此外，颗粒物中的铅暴露也与涉及氧化应激和炎症的microRNA的表达有关[90]。4汞（Mercury，Hg）4.1暴露、吸收与代谢汞在地壳中自然生成，通过火山活动、岩石风化或作为人类活动的结果，释放到环境中。自然界中的汞极少以纯金属存在，多以化合物形式存在，主要常见含汞矿物有朱砂、氯硫汞矿、硫锑汞矿和其他一些与朱砂相连的矿物，常用于制造科学测量仪器、药物、催化剂和汞蒸气灯等，也用于牙科医学和化妆品行业[91]。环境中的汞可转化为具有很强毒性的甲基汞，此过程称为汞的甲基化。甲基汞通过食物链在鱼体内累积，汞污染水体中的鱼体内其甲基汞浓度可比水中高上万倍。104 华中科技大学博士学位论文受污染的鱼类和海产品的摄入成为人类汞暴露的主要来源[91]。金属汞主要以蒸气形式经呼吸道进入体内，吸收率可达70%以上。其一般不易由肠胃吸收，如果肠胃蠕动异常，使金属汞在肠胃中停留时间过长，则有可能发生汞中毒[92]。胃肠道对甲基汞的吸收程度较高。进入体内的甲基汞大部分蓄积到肝和肾中，分布于脑组织中的甲基汞约占15%。生物监测常用的生物标志物有发汞、血汞和尿汞。汞进入体内后，一部分以无机的形式从尿中排除，另外一部分通过各种方式的吸收蓄积在体内。其中吸收进入人体内的有机汞约有10%进入毛发，因此头发中的汞含量可以反映过去一段时间体内的汞负荷。因为人们从进食鱼肉摄入的汞主要是以甲基汞的形式，故而生物监测中经常用发汞去评估体内汞及甲基汞的蓄积水平。此外，趾甲汞也是一个常用的汞蓄积指标。血汞能够反映体内汞吸收的程度，其在血中的半衰期大约是50天，可作为诊断汞中毒的辅助指标。尿汞可以反映体内汞负荷，是诊断汞中毒的指标，但不能反映体内甲基汞的暴露程度。4.2流行病学证据汞的心血管毒性在很多研究中都得到了证实，与汞暴露有关的CVD包括心肌梗死、中风、颈动脉粥样硬化、冠心病和高血压[93]。在一个纳入了9个国家684个男性心肌梗死患者的病例对照研究中，Guallar等人发现趾甲汞含量与首次患有心肌梗死的危险度有显著的相关性[94]。与对照组相比，病例组中的趾甲汞含量高了15%。此研究证明了在0.25μg/g的汞暴露水平上，汞暴露能增加心肌梗死的罹患率，此关联在校正脂肪中二十二碳六烯酸（DHA）含量后变得更强。汞能够减低进食鱼肉对心血管的保护作用。芬兰一项研究[95]发现，头发汞、24小时尿汞与心血管事件之间存在显著的相关性。在发汞浓度处于最高四分位的病人中，冠心病与心肌梗死的风险提高了2.0倍，心血管病死率增加了2.9倍。汞暴露与高血压的关联研究结果虽然存在争议，但大多数研究都发现了体内的汞水平与高血压的患病风险和血压值正相关。欧洲的一个研究[96]发现汞矿工人罹患高血压的风险比匹配的对照组高了46%，而一项美国国家健康和营养调查研究（NHANES）（1240个女性）则发现血汞水平每增加1.3μg/L，收缩压就会增加1.83mmHg[97]。但是此关联只存在于不吃鱼的参与者中。除此之外，汞还与高血压相关的因素有关，比如心率变异度、肾功能不全以及钠潴留[98-100]。4.3机制证据汞的心血管效应包括氧化应激、炎症、血栓形成、血管平滑肌功能障碍、内皮功能障碍、血脂异常和线粒体功能障碍[101-104]。汞对巯基、各种酶和氨基酸，如N-乙酰半胱氨酸、α-硫辛酸和谷胱甘肽都具有高亲和力。这些抗氧化剂是机体重要的抗氧化防御机制，可以提供约10%至50%的血浆蛋白抗氧化能力，对CVD有重要的保护作用。汞与这些抗氧化剂结合后能够增大氧化应激造成的损伤[101;102]。另105 华中科技大学博士学位论文外，汞能够与金属硫蛋白结合，代替锌、铜和其他痕量金属，降低含金属的酶的活性，从而影响机体的正常代谢功能[105]。甲基汞还与钙的稳态有关，后者对CVD有保护作用[106]。研究结果表明，甲基汞暴露能引起过量的钙流入和/或增加电压敏感钙通道的开放，也能增加细胞内钙和/或激活一些钙依赖性反应的能力。此外，汞还会导致线粒体功能障碍、腺嘌呤核苷三磷酸（adenosinetriphosphate，ATP）减少、谷胱甘肽耗竭和脂质过氧化增加。肾脏功能受损是CVD的重要危险因素，汞暴露与肾功能受损有关。汞在肾组织中蓄积，并对肾近曲小管造成损伤，从而导致蛋白尿的发生[107]。研究表明，富含omega-3脂肪酸的鱼肉和硒能够对抗汞的毒性，因此很多关于汞毒性的研究都要调整鱼肉的摄取量或者血硒的浓度[95;107]。5锰（Manganese，Mn）5.1暴露、吸收与代谢锰是一种在自然界中天然存在的元素。它是人体健康所必需的膳食营养素，是体内多种酶的辅助因子[108]。在正常浓度范围下，锰在维持人身体健康方面发挥着重要作用，包括促进骨骼的正常生长和发育，维持正常的糖代谢和脂肪代谢，维持脑和中枢神经系统的正常工作，另外还有抗衰老、抗氧化的作用。普通人群的锰的主要暴露途径是食物，糙米、米糠、核桃、花生和土豆等都富含锰[109]。中国营养学会制定的锰“安全和适宜的摄入量”中规定普通人的膳食中，锰的需要量为每天4～9mg[110]。普通人群的其他锰暴露来源还有饮用水、空气、土壤以及含锰制品的接触。而在职业性锰暴露中，呼吸道吸入是锰的最常见途径，多见于锰铁冶炼、电焊作业以及锰矿石生产相关作业的的工人。关于锰接触工人健康不良影响的职业健康研究很多。当锰的浓度过高时，机体会出现破坏性的神经损伤，并伴随一系列症状和体征，包括精神健康下降、情绪障碍和认知障碍加重、运动障碍、运动迟缓和震颤等类似于帕金森病的症状，临床上称为“锰毒”[111-113]。人体对吸入锰的吸收程度与锰颗粒的大小相关。沉积在下呼吸道的小颗粒锰主要被吸收到血液和淋巴液中，而沉积在鼻粘膜中的较大颗粒或纳米颗粒的锰可以通过嗅觉或三叉神经直接转运到大脑[108]。吸收进入体内的锰广泛分布于全身。其中，锰在肝脏、胰腺和肾脏中会有较高的水平。通过胃肠道吸收的锰量不是固定的，但通常保持在3-5%。成人可以通过调节胃肠吸收和肝胆排泄维持组织中稳定的锰水平[114]。锰的主要清除途径是通过肝胆排泄和粪便。在职业性锰暴露中，工人血中的锰水平与总锰负荷相关，而尿锰的排泄水平则被视为近期锰暴露的最有效标志物。有研究指出，血浆中和尿液中的锰在职业性锰监测中的作用不如全血中的锰，但是全血锰的运用也存在很多限制，且与暴露特征高度相关，不够稳定[115]。因此还需进一步探讨锰的其他生物标志物，如发锰、趾甲锰和红细胞内的锰的运用。106 华中科技大学博士学位论文5.2流行病学证据流行病和动物实验中已经有足够的证据证明了锰的神经毒性，但锰的心血管毒性相关证据还不充分，且存在争议。在一个关于锰冶炼厂工人的职业性研究中[116]，工作环境中空气中锰（以二氧化锰计）的几何平均浓度为0.07mg/m3。该研究发现，女性冶炼工人的心率显著加快，P-R间隔显著缩短。男性和女性冶炼工人的QRS波和T波分别也比对照组更宽和更高。该结果表明，即使是低水平的锰暴露也会对冶炼工人的心脏功能有显著的影响。心率变异性与CVD的发生密切相关。Cavallari等人[117]对PM2.5中金属成分进行了分析，并探讨了其与心率变异性之间的关联。其研究结果表明锰的暴露与夜间参与者的正常相邻心动周期差值的均方的平方根（rMSSD）存在正相关，空气中的锰每增加1μg/m3，参与者的夜间rMSSD就会下降0.130ms（95%CI：-0.162，-0.098）。锰的暴露与血压值之间存在关联，但结论不一。Mordukhovich等人研究了趾甲中锰暴露与血压的关系，并指出锰有潜在性的降压效应，这与之前的一些关于职业暴露的研究结果一致[118;119]。相比之下，KNHANES最近的一项研究报告[120]指出，锰暴露对于普通人群有增高血压的作用。血液中的锰水平每升高2倍，女性男性和总体人群分别会增加1.828、1.573和1.567倍的高血压风险。Shiue等人[121]的研究也支持了该结论，该研究中发现尿中锰浓度与高血压风险相关，OR值为1.42(95%CI:1.09,1.86)。5.3机制证据锰暴露引起CVD的机制比较复杂。动物研究表明，锰能够在心脏组织中快速蓄积。锰诱导的线粒体损伤和与心血管系统中钙通道存在交互作用，进而导致急性或亚急性CVD，如急性心脏抑制[122]。另外，锰暴露能够降低多巴胺和5-羟基色胺的水平，以及影响胆碱酯酶的合成，这些都是与CVD相关的因素[119]。锰对人体的作用取决于其暴露的剂量。Ensunsa等人[123]证明大鼠饮食中的锰缺乏会降低含锰精氨酸酶的活性，从而引起血管收缩，并增强大鼠主动脉的内皮依赖性血管舒张。然而，过量的锰暴露是否会影响精氨酸酶的活性，进而导致相反的效果仍然不清楚。在正常范围内，锰是激活锰超氧化物歧化酶（MnSOD）所必需的，它能把清除体内的超氧自由基，可以减少线粒体ROS形成并增加内皮功能[124;125]。然而，随着锰含量的增加，锰在线粒体中积累，并受到氧化呼吸链的干扰，从而影响MnSOD的抗氧化作用，导致内皮功能不全，引起CVD的发生。6展望生物标志物的使用能帮助我们评估人群内暴露的水平。然而，目前利用生物标志物去监测重金属暴露的前瞻性队列研究还很有限，且大多是横断面研究。CVD的发生发展是一个长期慢性的过程，队列研究不但能对重金属暴露后的CVD自然发展史进行研究，还可以获得预期以外的信息，进一步研究重金属与CVD的关联。107 华中科技大学博士学位论文此外，目前大部分可用的研究证据只涉及心血管发病率或死亡率，关于致死性和非致死性临床结果（如冠心病、中风和外周动脉疾病）以及亚临床结果（如颈动脉内-中膜厚度和冠状动脉钙化）的研究不多。重金属暴露与基因的交互作用在CVD及其他慢性病的发展中的作用受到越来越多的关注。基因测序技术的发展，让我们得以花费比以前少数倍不止的时间和金钱去得到更多的基因信息。但是，目前大多数相关的研究都是关于国外人群的，国内人群的研究很缺乏。由于种族在基因变异中起主导地位，国外研究所得出的证据不一定适用于我国人群，因此需要在中国人群去发现和验证。重金属暴露与CVD的关联需要更多高质量的研究进行分析探索，为CVD的公共卫生政策提供理论依据。重金属污染及其不良健康效应受到越来越多研究者的关注。基于这些研究结果，公共卫生干预手段在重金属污染的治理中起到了至关重要的作用。在二十世纪二十年代到七十年代初期，由于含铅发动机燃料的使用导致大面积的空气铅暴露，铅暴露急剧增加。当含铅发动机燃料逐步被淘汰后，我国人群的铅暴露急剧下降[75;126]。在控烟措施的实行下，镉暴露量随着吸烟率和二手烟暴露量的降低也有所下降[127]。至于砷污染，由于越来越多的证据证实砷的健康危害，世界各国的饮用水标准中砷的安全限值逐年降低。在2006年，我国出台了《生活饮用水卫生标准》（GB5749-2006）。该标准结合我国的地下水砷含量的分布情况，将饮用水中砷的安全限值规定为0.05μg/L，这无疑是降低我国国民砷暴露的一个重大公共卫生举措。但其他的暴露途径如食品中重金属的含量，由于缺乏监管标准，情况仍然得不到改善。虽然我国重金属污染情况有所控制，但有证据表明即使在目前的暴露水平下，这些重金属仍然会对心血管系统或者其他器官产生健康危害。因此，环境污染问题的解决仍然任重道远，不能掉以轻心。环境重金属暴露与健康危害之间的关联研究仍有许多问题有待探讨，大样本高质量队列研究的设计、重金属污染大数据库的建立、新型早期预警标志物的研发将是重金属污染健康危害未来的研究重点和方向。108 华中科技大学博士学位论文参考文献[1]YangX,YueW,XuH,etal.Environmentalconsequencesofrapidurbanizationinzhejiangprovince,Eastchina.IntJEnvironResPublicHealth,2014,11(7):7045-59.[2]YangG,WangY,ZengY,etal.RapidhealthtransitioninChina,1990-2010:findingsfromtheGlobalBurdenofDiseaseStudy2010.Lancet,2013,381(9882):1987-2015.[3]郝喜海,罗洁,衣潇鹏.我国重金属污染现状与微生物修复技术.广州化工,2013,41(11):42-44.[4]陈伟伟,高润霖,刘力生,etal.《中国心血管病报告2017》概要.中国循环杂志,2018,(01):1-8.[5]XiB,LiuF,HaoY,etal.ThegrowingburdenofcardiovasculardiseasesinChina.IntJCardiol,2014,174(3):736-7.[6]MoonK,GuallarE,Navas-AcienA.Arsenicexposureandcardiovasculardisease:anupdatedsystematicreview.CurrAtherosclerRep,2012,14(6):542-55.[7]Tellez-PlazaM,JonesMR,Dominguez-LucasA,etal.Cadmiumexposureandclinicalcardiovasculardisease:asystematicreview.CurrAtherosclerRep,2013,15(10):356.[8]Navas-AcienA,GuallarE,SilbergeldEK,etal.Leadexposureandcardiovasculardisease--asystematicreview.EnvironHealthPerspect,2007,115(3):472-82.[9]Navas-AcienA,SilbergeldEK,SharrettR,etal.Metalsinurineandperipheralarterialdisease.EnvironHealthPerspect,2005,113(2):164-9.[10]TyrrellJ,GallowayTS,Abo-ZaidG,etal.HighurinarytungstenconcentrationisassociatedwithstrokeintheNationalHealthandNutritionExaminationSurvey1999-2010.PLoSOne,2013,8(11):e77546.[11]NaujokasMF,AndersonB,AhsanH,etal.Thebroadscopeofhealtheffectsfromchronicarsenicexposure:updateonaworldwidepublichealthproblem.EnvironHealthPerspect,2013,121(3):295-302.[12]SchmidtCW.Low-dosearsenic:insearchofariskthreshold.EnvironHealthPerspect,2014,122(5):A130-4.[13]Navas-AcienA,NachmanKE.Publichealthresponsestoarsenicinriceandotherfoods.JAMAInternMed,2013,173(15):1395-6.[14]MaullEA,AhsanH,EdwardsJ,etal.Evaluationoftheassociationbetweenarsenicanddiabetes:aNationalToxicologyProgramworkshopreview.EnvironHealthPerspect,2012,120(12):1658-70.[15]Navas-AcienA,FrancesconiKA,SilbergeldEK,etal.Seafoodintakeandurine109 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华中科技大学博士学位论文博士研究生工作小结一、承担与参与课题承担课题：1.武汉超市食物BPA污染现状调查及高BPA饮食后体内BPA暴露的24h监测研究（研究生创新基金，项目编号：0118650057）。参与课题：1.环境内分泌干扰物与雌激素信号通路关键基因的交互作用在高血压发生中的作用及机制（国家自然科学基金，项目编号：81573237）。2.基因-环境交互作用及肿瘤发病风险预测模型的构建（国家重点研发计划，项目编号：2016YFC1302702）。3.纳米仿生识别与催化增敏机理和方法研究（国家重点基础研究发展规划973专项课题，项目编号：2015CB352100）。二、已发表或待发表论文1.WeixiangWu,KeZhang,ShunliJiang,DayangLiu,HaoZhou,QiangZeng,LimingCheng,XiaopingMiao,YeqingTong*,QingLu*.Associationofco-exposuretoheavymetalsandrenalfunctioninahypertensivepopulation.EnvironmentInternational(IF=7.088).2.WeixiangWu,ShunliJiang,QiangZhao,KeZhang,XiaoyunWei,TongZhou,DayangLiu,HaoZhou,QiangZeng,LimingCheng,XiaopingMiao,QingLu*.Environmentalexposuretometalsandtheriskofhypertension:across-sectionalstudyinChina.EnvironmentalPollution,2017,11(IF=5.099).3.WeixiangWu,ShunliJiang,QiangZhao,KeZhang,XiaoyunWei,TongZhou,DayangLiu,HaoZhou,QiangZeng,LimingCheng,XiaopingMiao,QingLu*.AssociationsofenvironmentalexposuretometalswiththeriskofhypertensioninaChinesepopulation.ScienceoftheTotalEnvironment(IF=4.90).4.WeixiangWu,YeqingTong,QiangZhao,GuangxiaYu,XiaoyunWei,QingLu*.Coffeeconsumptionandbladdercancer:ameta-analysisofobservationalstudies.ScientificReports,2015,5(Firstco-authors,IF=4.259).5.WeixiangWu,YeqingTong,XiaoyunWei,QiangZhao,XiaoqiPan,GuangxiaYu,QingLu*.AssociationbetweenInt7G24Ars334354polymorphismandcancerrisk:119 华中科技大学博士学位论文ameta-analysisofcase-controlstudies.ScientificReports,2015,5(IF=4.259).6.WeixiangWu,ShunliJiang,QingLu*.InteractionbetweencadmiumexposureandgeneticpolymorphismsonessentialhypertensioninChina(Prepared).120 华中科技大学博士学位论文致谢时光荏苒，日月如梭。五年的硕博连读生活即将走向尾声，自己也将走向新的工作岗位面临新的征程和挑战。回首五年的科研和生活经历，有过艰辛和迷茫，流过泪水和汗水；但更多的是快乐和难忘的回忆，同时也充斥着无限的感恩和感激。首先要衷心感谢我的导师鲁青教授，在她的耐心指导和栽培下，培养了我在科研上注重发现问题、分析问题和解决问题的能力，也培养了我在科研思维上的严谨性和逻辑性，同时也增强了自己专业的表达能力和团队合作意识。此外也非常感谢她在生活中给予的指引、关心和帮助。在此，我向她致以最崇高的敬意！同时，还要真诚感谢环医所的周宜开老师、吕斌老师、梅素容老师、王琳老师、郑丹老师、石云老师、沈先涛老师、荆涛老师等在我在读期间给予的各方面热心指导和帮助，以及在实验过程中给予的援助和支持。你们为人师表的风范令我敬仰，严谨治学的态度令我敬佩。在此致予我最衷心的感谢！其次，感谢赵强博士、张科博士、江顺利博士、罗丹博士、魏小云硕士、周同硕士、刘大洋硕士、周浩硕士、周爽硕士、刘慧敏硕士、李盏硕士等在课题实施过程中的大力配合与帮助，感谢环境医学研究所各位师兄师姐和师弟师妹们的支持与鼓励。最后，需要特别感谢的是我的父母和家人。他们一直支持着我漫长而坎坷的求学生涯。他们在我每一次失败后的鼓励，小有成绩后的谨劝，对我在学业和就业选择方面的充分尊重，是我拥有的最宝贵的人生财富。再次感谢所有关心和帮助过我的老师、同学、朋友和家人！吴伟祥2018年5月于同济医学院121 华中科技大学学位评定委员会办公室印制