卷曲巴克斯霉原变种（Backusella+circina+var.circina）形态学观察及致病性的动物实验研究

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授予单位代码10089学号或申请号20132434中国图书分类号R756.6HebeiMedicalUniversity硕士学位论文科学学位卷曲巴克斯霉原变种(Backusellacircinavar.circina)形态学观察及致病性的动物实验研究研究生：杜娟导师：万力教授专业：皮肤病与性病学二级学院：第四医院2016年3月 巧北医科大学学位论文使用授权及知识产权归属承诺本学位论文在导师（或指导小组）的指导下，由本人独立完成。本学。位论文研究所获得的研究成果，其知识产权归河北医科大学所有河北医科大学有权对本学位论文进行交流、公开和使用。凡发表与学位论文主要一内容相关的论文，第署名为单位河北医科大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河北医科大学所有。否则，承担相应法律责任。研究生签名导师签章；＾二级学晓领导盖章：年月日河北医科大学研究生学位论文独创性声明本论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特别加标注和致谢等内容外，文中不包含其他人己经发表或撰写的研究成果，文责自负。，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写研究生签名：未导师签章年月日ｄ 目录中文摘要············································································································1英文摘要············································································································4英文缩写············································································································8研究论文卷曲巴克斯霉原变种形态学观察及致病性的动物实验研究前言············································································································9材料与方法······························································································10结果··········································································································15附图··········································································································18附表··········································································································37讨论··········································································································39结论··········································································································44参考文献··································································································45综述深部真菌感染研究进展······································································47致谢··················································································································62个人简历··········································································································63 卷曲巴克斯霉原变种(Backusellacircinavar.circina)形态学观察及致病性的动物实验研究摘要目的：巴克斯霉属(Backusella)属于真菌门，接合菌亚门，接合菌纲，毛霉目，广泛分布于土壤、粪便及腐烂的动植物尸体上。一般为条件致病菌，当机体抵抗力下降时侵入，引起人体浅部或深部真菌病。卷曲巴克斯霉原变种是巴克斯霉属其中的一个变种，目前国内外尚无该菌引起人体感染的相关报道。本研究所用菌株是2009年从我院1例白血病患者的面部皮损中分离而来，最终经中国科学院微生物研究所的郑儒永院士鉴定为卷曲巴克斯霉原变种(Backusellacircinavar.circina)(已测出基因序列)。本实验一方面通过对卷曲巴克斯霉原变种进一步的形态学观察，为实验室鉴定该菌提供依据；另一方面通过动物实验检测其是否可以引起系统性感染，并观察不同免疫状态和接种途径小鼠的一般状况及死亡情况，同时通过对小鼠进行解剖、组织真菌逆培养、组织病理学检查等方法观察各脏器的感染情况，进一步了解此菌的致病力、脏器播散情况及组织病理学特点，为临床上诊断和治疗卷曲巴克斯霉原变种感染提供实验室依据。方法：1菌落形态学观察1.1菌落大体形态学观察：常温下复苏保存菌株，3天后转种于沙堡氏琼脂培养基(SDA)平皿上，分别于27℃和37℃的温箱内培养，每天观察并记录菌落生长情况。1.2小培养(方块法)：挑取菌落点种于SDA小培养基上，分别置于27℃和37℃的温箱内，每天观察菌丝生长及孢子产生的情况。1.3光镜观察：每天挑取两个温度下的菌落置于载玻片上，滴加酚棉兰溶液，加盖盖玻片，光镜下观察。2动物致病性试验2.1卷曲巴克斯霉原变种系统性感染动物模型的制作：常温下复苏保存菌株，转种于SDA培养基上，置于27℃温箱培养3天。挑取菌株加入无菌生理盐水制成菌悬液，通过皮下、腹腔两种途径分别接种至免疫状态1 不同的小鼠。2.2小鼠活动情况及死亡率的观察：观察并记录各组小鼠感染后的一般状况以及4周内的自然死亡日期和数量。2.3内脏的大体形态观察：随机抽取不同感染阶段的小鼠处死解剖，分离出心、肝、脾、肺、肾各脏器，并观察有无肿大或萎缩、有无颜色变化等大体形态改变。2.4组织真菌逆培养：将小鼠各脏器在无菌条件下研磨至匀浆状，3点接种至SDA试管培养基斜面上，每个脏器移种2管，27℃下培养3天，观察生长菌落的大体形态及制成湿片后的光镜下形态。2.5组织病理学检查：将脏器用10℅福尔马林浸泡固定，依次经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、展片，分别经过HE染色和PAS染色，光镜下观察各脏器有无组织病理学改变。结果：1SDA培养基上的菌落直径：菌落在SDA培养基上27℃下较37℃生长快，第1天、3天、7天直径比较均有显著性差异(P＜0.05)。2SDA培养基上的菌落形态：接种8h后开始有菌落生长，形态大体为白色羊毛状。27℃下菌落生长速度快，气生菌丝稀疏、蓬松，向上生长趋势较为明显。37℃下菌落生长较慢，且菌落边缘不整齐。两种温度下培养基背面均呈白色，未见明显颜色变化。3光镜下形态：可见大量粗大、透明、多核、无分隔的菌丝，直径粗细不均匀，分枝比较明显，部分有侧生菌丝。菌丝顶端可见膨大的球形孢子囊，破裂后可释放出大量具有荧光、壁薄、圆形或椭圆形的孢子，破裂的孢子囊偶见囊领状结构。4小鼠感染后一般状况：不同免疫状态皮下组小鼠活动及进食量无明显改变，免疫抑制组较免疫正常组出现的接种部位局部损害严重，但均可自愈。腹腔接种组小鼠活动量及进食量减少，毛发倒逆无光，逐渐消瘦，有自然死亡情况，免疫抑制组的一般状况更差。5小鼠感染后自然死亡情况：免疫抑制腹腔组接种后第2天小鼠出现死亡，第5天达到死亡高峰，1周死亡率为56.7%，2周死亡率达96.7%；免疫正常腹腔组接种后第2天开始死亡，第9～10天达到死亡高峰，1周死亡率30%，2周死亡率80%，2周后无自然死亡。两组生存天数差异有2 显著性(P＜0.05)，免疫正常腹腔组较免疫抑制腹腔组的生存天数长。不同免疫状态皮下组均无自然死亡。6各脏器的大体改变：腹腔组自然死亡小鼠心肺充血、水肿，肝脾普遍可见不同程度肿大，呈紫红色，肾脏偶见呈紫红色充血水肿，部分小鼠肝﹑脾和肺表面可见针尖至粟粒大小白色化脓感染灶。皮下组各脏器未见明显大体改变。7组织真菌逆培养：皮下组中，免疫抑制小鼠皮肤组织生长出与接种菌株形态相同的菌落，免疫正常小鼠皮肤组织未见菌落生长，不同免疫状态小鼠的内脏组织逆培养均为阴性。腹腔组部分脏器逆培养有菌落生长，其菌落大体及镜下形态均与接种的菌株相同，免疫抑制和免疫正常两组真菌逆培养阳性率有显著性差异(P＜0.05)，免疫抑制小鼠脾脏、肺脏、肝脏阳性率明显高于心脏、肾脏(P＜0.005)。8组织病理学变化：不同免疫状态皮下组小鼠的各内脏均无明显病理学变化。不同免疫状态的腹腔注射组，HE染色可见血栓形成和邻近组织变性、坏死，有大量炎细胞浸润，少量巨噬细胞增生。两种染色均可见坏死组织、血管内有大量紫红色的菌丝及孢子。结论：1卷曲巴克斯霉原变种只有一种菌落形态，在最适合其生长的SDA培养基上27℃下较37℃生长良好。2通过腹腔注射途径可以成功建立卷曲巴克斯霉原变种系统性感染小鼠模型；皮下注射接种不能导致小鼠系统性感染。3该菌属于条件致病菌，机体免疫力低下时更易引起感染，且感染也更加严重。但较大菌量也可导致正常免疫小鼠系统性感染，说明该菌致病力及侵袭性强。4卷曲巴克斯霉原变种引起的特征性组织病理学改变为极易侵犯血管导致血栓形成和组织坏死，伴有各种炎细胞浸润。5无论何种免疫状态，肝、脾、肺均为该菌最易感染的器官；而心、肾较不易感染。关键词：卷曲巴克斯霉原变种,形态学,动物模型,免疫状态,组织病理,致病性3 ExperimentresearchonthemorphologyofBackusellacircinavar.circinaanditsAnimalLaboratoryStudyonthePathogenecityABSTRACTObjective:BackusellabelongstotheEumycota,zygomycetessubphylum,ClassZygomycetes,Mucorales.Itiswidelydistributedinthesoil,excrementandrottingbodiesofanimalsandplants.Itisusuallyconditionalpathogenicbacteria,whichcanleadtosuperficialmycosesordeepmycoseswhentheimmunityislower.B.circinavar.circinaisonevariantofBackusella,butthereisnorelatedliteraturereportofhumaninfectionwiththefungusbyfar.Weisolatedthestrainfromonecaseoffacialskinlesionsonthepatientwhohasgotleukemiain2009,anditwasidentifiedasBackusellacircinavar.circinabyInstituteofmicrobiologyChineseacademyofsciences.Itsgenesequencehasbeendetected.ThisstudycouldprovidethebasisforlaboratoryidentificationofthisfungusbyfurthermorphologicalobservationofB.circinavar.circinaontheSDAmedium.Ontheotherhand,thepossibilityofsystemicinfectioncouldbedetectedbyanimalexperiments.Weobservedthegeneralconditionanddeathsituationofmiceindifferentimmunestatusandinoculationways.Themainviscerainvariousstageswereexaminedbyfungalcultureandhistopathology.Allofstudycouldhelpustoknowmoreaboutitspathogenicityandpathologicalfeatures,furthermore,itcouldprovidepowerfulbasisforclinicaldiagnosisandtreatmentontheinfectionofB.circinavar.circina.Methods:1MorphologyobservationontheSDAmedium1.1Colonygeneralmorphologyobservation:PuttheisolateundertheordinarytemperatureaboutthreedaysandinoculateditontheSDAmedium,cultureditunder27℃and37℃,thenobservedthedevelopmentsituation4 everyday.1.2Slideculture:InoculatedthestrainonthemicrocultureofSDAmediumat27℃and37℃,andobservedthegrowthofhyphaeandsporeseveryday.1.3Observationunderlightmicroscope:PutsomesamplestakenfromtheSDAmediumcolonyontheglassslide,addedafewdropsoflactophenolcottonblueandtookacoversliponthem.Thenobserveditunderlightmicroscope.2Animalpathogenicexperiment2.1EstablishinganimalmodelwithsystemicinfectionofB.circinavar.circina:PuttheisolateundertheordinarytemperatureandinoculateditontheSDAmediumat27℃for3days.Thenmadeupthefungalsuspensionwithsterilenormalsaline.Miceindifferentsimmunestateswereinoculatedthefungalsuspensionthroughintradermalandintraperitonealpathways.2.2Observationofactivityconditionanddeathrate:Observedthedeathrateandactivityconditionofeachgroupinthefourweeksafterinfectedthefungi,andrecordedthedateandnumberofdeath.2.3Generalobservationoftheviscera:Dissectedthesacrificedmiceinvariousstagesundertheasepticconditions,andobservedvisceralchangesofsize,color,andsoon.2.4Fungalcultureofthetissue:Grindedtheinfectedtissuesofmiceinsterileconditions,theninoculatedsomeofthemintotesttubeswhichcontainingSabourand’sAgar.Afterculturedat27℃for3days,wecountedthepositivenumbers,andobservedthecolonymorphologyandtheshapeofhyphaeandspores.2.5Histopathologicalexamination:Thelesiontissueswerefixedwith10%formalin,thendehydrated,cleared,embedded,sliced,stainedwithHEandPASrespectively.Finally,observedunderlightmicroscope.Results:1ThecolonydiametersontheSDAmedium:Thecolonygrowedfasterat27℃than37℃ontheSDAmedium.Therearesignificantdifferenceson5 thefirst,thirdandseventhday(P＜0.05).2ThemorphologyofcolonyontheSDAmedium:Wecouldseecolonyofwhiteandwoolly.Thecolonywassparse,fluffyandobviouslyupwardgrowthtrendat27℃.Theedgeofthecolonywasnotneatat37℃.Mediumonthebackwaswhitebothat27℃and37℃.3Morphologyunderlightmicroscope:Itshowedabundanthyalinebranchedhyphae.Themyceliumwereofunevendiameter.Alargenumberofsporangiagatheredatthetopofhyphae.Manycircularsporeswerereleasedwhensporangiaburst.4Thesurvivalstateofmice:Nomatterwhatkindofimmunestatus,thelifehabitshadnoobviouschangeafterinoculatedthroughintradermalpathway.Theskinlesionofmicethatimmunosuppressedweremoreserious.Themicethatinoculatedintraperitoneallyreducedfood-intakeobviouslyandemaciatedgradually,theimmunosuppressivemicesituationwasmoreserious.5Thedeathconditionofmice:Theimmunosuppressedintraperitonaellyinjectedgroupreacheditsdeathpeakinthefifthdayafterinoculation,anditsdeathrateofoneweekwas56.7%,andtwoweekswas96.7%.Theintraperitoneallyinjectedgroupwhichhasnormalimmunesystemreacheditsdeathpeakintheninthday,anditsdeathrateofoneweekortwoweekswas30%or80%,andaftertwoweekswithoutanaturaldeath.Bycomparingtheabovetwogroups,wefoundthatthedeathrateandmeansurvivaltimeofmicehavesignificantdifference(P＜0.05).Andothergroupshadnonaturaldeath.6Thechangeoforgans:Theorgansofintraperitoneallyinjectedmicecouldbefoundindifferentlevelsofcongestionandedema.Partsoftheliver,spleenandlunghadwhitemicroabscessonthesurface.Intradermalinoculatedgroupshadnoobviouslychanges.7Fungalcultureofthetissue:Whentheintradermalinoculation,theskintissuefungalcultureresultoftheimmunosuppressedmicewaspositive,buttheskintissuefungalcultureofthenormalmicedidn’tseethecolonygrowth,andthefungalcultureresultsofviscerainimmunosuppressedandnormal6 groupswerenegative.Whentheintraperitonealinoculation,thevisceratissuefungalculturecouldgrowoutcolonies.Thecolonialmorphologyandshapeofhyphaewereidenticalwiththatofinoculatedstrains.Thefungalculturepositiverateoftheimmunosuppressedmicewassignificantlyhigherthanthenormalmice(P＜0.05).Thefungalculturepositiverateofthespleen,lungandliverweresignificantlyhigherthantheheartandkidney(P＜0.005).8Histopathologicalexamination:Differentimmunestateofintradermalinoculatedmicedidn’tshowobviouslypathologicalchangesoforgans.WhenstainedwithHE,theimportantpathologicalchangesofintraperitoneallyinoculatedmicewerethrombosisandtissuenecrosis,withalargenumberofinflammatorycellsinfiltration.StainedwithPASandHE,therewerealotofpurplehyphaeandsporesinthenecrotictissueandbloodvessel.Conclusions:1TherewasonlyonecolonymorphologyofB.circinavar.circina.Andthecolonygrowedbetterat27℃than37℃ontheSDAmedium.2SystemicinfectedmurinemodelscausedbyB.circinavar.circinacouldbesuccessfullyestablishedthroughintraperitonealpathwayinthisstudy,butnotintradermal.3Backusellacircinavar.circinaisanopportunisticpathogen.Miceinimmunosuppressedstateweremoresusceptibletobeinfected,andthedegreeofinfectionwasmoreseriousalso.Wheninoculatedmorefungi,healthymicecouldbeinfectedaswell.Therefore,thevirulenceandinvasivenessofthisfungusisverypowerful.4Thecharacteristicpathologicalchangesofmicecausedbythisfunguswereeasytoinvadebloodvessels,andcouldleadtothrombosisandtissuenecrosis,withalargenumberofinflammatorycellsinfiltration.5Theliver,spleenandlungwerethemostsusceptibleorgans.Keywords:B.circinavar.circina,Morphology,Murinemodel,Immunestate,Histopathology,Pathogenicity7 英文缩写英文缩写英文全称中文全称SDASabouraudsAgar沙氏琼脂CFUClonalFormationUnit菌落形成单位HEHematoxylin-Eosin苏木精-伊红PASPeriodicAcid-Schiff过碘酸-希夫AIDSAcquiredImmuneDeficiency获得性免疫缺陷综合征SyndromeCOPDChronicObstructivePulmonary慢性阻塞性肺疾病DiseaseGMGalactomannan半乳甘露聚糖LALatexAgglutination乳胶凝集法EIAEnzymeImmunoassay酶免疫测定PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链反应DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸RNARibonucleicAcid核糖核酸RAPDRandomlyAmplifiedPolymorphic随机扩增多态性DNADNASSCPSingleStrandConformation单链构象多态性分析PolymorphismRFLPRestrictionFragmentLength限制性片段长度多态性Polymorphism8 卷曲巴克斯霉原变种(Backusellacircinavar.circina)形态学观察及致病性的动物实验研究前言巴克斯霉属(Backusella)属真菌门，接合菌亚门，接合菌纲，毛霉目，广泛存在于大自然环境中。毛霉目真菌可分为14科，55属，400多种；一般为条件致病菌，当人体发生重大疾病或恶性疾病晚期、机体抵抗力下降时侵入，引起人体浅部或深部真菌病，近年来国内外有关毛霉菌感染的报道已越来越多。卷曲巴克斯霉是一个多系类群，与毛霉属(Mucor)、放[1]射毛霉属(Actinomucor)、根毛霉属(Rhizomucor)的谱系关系很密切，卷曲巴克斯霉原变种(B.circinavar.circina)是其中的一个变种，目前尚无该菌引起人体感染的相关文献报道。本实验所用菌株是2009年从我院1例白血病患者的面部皮损中分离而来，最终经中国科学院微生物研究所的郑儒永院士鉴定为卷曲巴克斯霉原变种(Backusellacircinavar.circina)(基因序列已测出)。本实验研究一方面通过对卷曲巴克斯霉原变种进一步的形态学观察，为实验室鉴定该菌提供依据；另一方面通过建立卷曲巴克斯霉原变种系统性感染的动物模型，观察不同的免疫状态和给菌途径条件下小鼠的死亡情况，并通过对实验小鼠进行解剖、组织真菌逆培养、组织病理学检查等方法观察各脏器的感染情况，进一步了解此菌的致病力及其引起的组织病理学特点，为临床上诊断和治疗卷曲巴克斯霉原变种感染提供实验室依据。9 材料与方法1实验材料1.1实验菌株分离自1例白血病患者的面部皮损中，冻存于河北医科大学第四医院皮肤科门诊真菌检查室-80℃冰箱内。1.2形态学观察培养基1.2.1沙堡氏琼脂培养基(SDA)蛋白胨10g、葡萄糖40g、琼脂18g、蒸馏水1000ml、氯霉素按照0.1mg/ml添加。先将琼脂加水，热溶后再加入其它成分，分装平皿及试管中，116℃30分钟高压灭菌。1.2.2小培养培养基(方块法)先将9cm直径空平皿、V形玻璃棒、载玻片、盖玻片高压消毒，然后将灭菌后的SDA培养基倒入其中一个空平皿中，约15~20ml，待培养基冷却凝固后，用无菌手术刀切成1cm×1cm大小的方块，挑取培养基方块置于载玻片上，载玻片放到V形玻璃棒上，并一同放入空平皿中待用。1.3实验动物昆明种远交系小白鼠(清洁级)，雄性，6～8周龄，体重18~22g，150只，购于河北医科大学实验动物中心(合格证编号：1510313)。室温下饲养于具有层流装置的屏蔽系统内，喂养经消毒的鼠颗粒饲料。1.4药物注射用环磷酰胺，200mg/支，江苏恒瑞医药股份有限公司生产。1.5主要仪器高压蒸汽消毒器山东新华医疗器械股份有限公司澳柯玛冰箱青岛澳柯玛公司电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械一厂SW-CJ-1F净化工作台苏净集团苏州安泰空气技术有限公司HC-TP12型架天平天津市天马仪器厂血细胞计数板上海医疗器械厂微量移液器德国Eppendorf公司光学显微镜日本OLIMPUSBH-210 摊烘烤片机沈阳市龙首电子仪器有限公司石蜡切片机德国LEICARM21352实验方法2.1培养基形态学观察2.1.1菌种复苏与培养将置于-80℃冰箱内菌株取出，置于常温下复苏，3天后转种于沙堡氏琼脂培养基(SDA)平皿上，分别于27℃和37℃温箱内培养，每天观察并记录菌落生长情况。2.1.2小培养(方块法)挑取少量菌落分别点种于方形SDA培养基的上方四边中点处，加盖盖玻片，平皿内还需放一滴加了生理盐水的消毒棉球，分别置于27℃和37℃的温箱内，每天观察菌丝生长和孢子产生的情况。2.1.3光镜观察每天挑取两个温度下的少量菌落置于载玻片上，滴加少许酚棉兰溶液，加盖盖玻片，然后在OLYMPUS双孔显微镜下观察。2.2动物致病性试验2.2.1动物模型的制作2.2.1.1实验小鼠适应性喂养3天2.2.1.2动物分组将150只小鼠根据要求不同的免疫状态和给菌途径随机分为4组：免疫正常状态的分为皮下组15只、腹腔组60只；免疫抑制的分为皮下组15只、腹腔组60只。再将其中的免疫正常腹腔组和免疫抑制腹腔组小鼠分别随机分为以下两组：自然死亡率观察组30只小鼠和分期处死解剖组30只小鼠。2.2.1.3菌悬液制备将激活的菌株接种在SDA培养基上，27℃培养3天，在无菌条件下挑取适量菌落，置于无菌研磨器中，滴加适量生理盐水，再充分研磨至肉眼观察为毛玻璃状为佳，再用3~4层医用无菌纱布过滤多次，去除掉过多的菌丝和杂质，用带有一次性无菌枪头的移液器将滤液滴入血细胞计数板5中，在显微镜下调整孢子及菌丝浓度至1~1.5×10CFU/ml(一个孢子或一个菌丝分隔段计为1个CFU)，孢子与菌丝的比例为1:1，制好备用。11 2.2.1.4免疫抑制小鼠模型的建立免疫抑制组的小鼠在接种该菌菌悬液前经过腹腔注射途径给予环磷酰胺200mg/Kg，每天1次，连续注射3天，诱导机体免疫抑制，第4天[2]小鼠的白细胞计数最低，所以第4天给予菌悬液。2.2.1.5菌悬液的接种本实验采用两种途径接种菌悬液：①皮下注射：小鼠背部皮肤需脱毛并消毒，皮下缓慢注射菌悬液0.5ml/只；②腹腔注射：腹部皮肤需脱毛消毒，沿腹中线左或右下腹部进针，有落空感时回抽注射器，确定无肠液、尿液后缓慢给予菌悬液0.5ml/只。2.2.2小鼠接种菌悬液后活动情况和生存率的观察观察并记录各组小鼠感染后的一般状况(包括反应﹑活动、饮食和毛发变化情况)，以及4周内的自然死亡日期和数量。2.2.3分期处死解剖组小鼠的内脏大体形态变化的观察小鼠接种菌悬液后的第3天、5天、7天、2周、3周、4周，采用颈椎脱位法处死各时期随机抽取的分期处死解剖组小鼠，每一配对小鼠均取自同一感染病程，自然死亡的小鼠随时提取，至4周末仍未死亡的小鼠要全部处死。首先将小鼠用75%酒精浸泡，然后在无菌条件下将其解剖，观察各内脏有无肿大或萎缩、表面是否出现脓性感染灶、有无颜色变化等大体改变，将小鼠的心、肝、脾、肺、肾各脏器分离取出，并把每个脏器分为2份分别进行组织真菌逆培养处理和组织病理学检查。2.2.4组织真菌逆培养将不同时期死亡的分期处死解剖组小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏各脏器在无菌条件下研磨至匀浆状，3点接种至SDA试管培养基斜面上，每个脏器移种2管，于27℃的恒温箱中培养，3天后观察结果。阳性结果判定标准：①观察试管中生长菌落的形态并挑取少许菌落制成湿片，光镜下观察如果其菌落形态、显微镜视野下孢子和菌丝的形态均与接种菌株相同，即为逆培养阳性。②各个脏器两个接种管中只要有1管阳性，即视为该脏器逆培养结果为阳性；两管均阴性则视为阴性；两管均污染则应被剔除。③1个及1个以上脏器阳性即视为小鼠系统性真菌感染阳性。[3]④一般浅部真菌超过2周、深部真菌超过4周仍无生长，可报告阴性。2.2.5组织病理学检查12 将脏器首先用10℅福尔马林浸泡固定，然后依次常规脱水，透明，浸蜡，包埋，4μm切片，展片，分别经过HE(苏木素-伊红)染色及PAS(过碘酸-雪夫)染色。2.2.5.1HE染色方法如下：2.2.5.1.1待烘干的石蜡切片逐渐冷却后依次浸入二甲苯I、II中脱蜡，每个5分钟。2.2.5.1.2依次放入100℅、95℅、85℅、75℅各梯度的酒精中各3分钟，彻底去除二甲苯，用自来水充分冲洗。2.2.5.1.3浸入Harris苏木精染液中5分钟，依次用自来水冲洗3次。2.2.5.1.4放入1℅盐酸酒精溶液中分化20秒，流水冲洗。2.2.5.1.5使用1℅氨水返蓝5分钟后，用流水冲洗。2.2.5.1.6放入0.5℅醇溶性伊红液中染色20秒。2.2.5.1.7依次放入80℅、85℅、95℅、无水乙醇I，II各梯度酒精中，每个5分钟。2.2.5.1.8用二甲苯I、II各透明5分钟，使用中性树胶封片。2.2.5.1.9光镜下观察切片：细胞核嗜碱性呈蓝色，细胞浆嗜酸性呈红色。2.2.5.2PAS染色方法如下：2.2.5.2.1常规4um切片，脱蜡至水洗。2.2.5.2.2用蒸馏水洗1～2分钟。2.2.5.2.31%过碘酸水溶液中氧化5～10分钟，并用自来水冲洗。2.2.5.2.4用蒸馏水冲洗数次。2.2.5.2.5shiff氏液中浸染5～10分钟，若温度较低可以适当增加时间。2.2.5.2.6不经水洗，直接使用新配制的亚硫酸氢钠溶液洗3次，各2分钟，再用自来水冲洗10分钟。2.2.5.2.7放入明矾苏木素液中2～3分钟使胞核浅染，若染色过深则用0.5%盐酸酒精液分化，自来水充分冲洗5～10分钟。2.2.5.2.8经过逐级酒精脱水，使用二甲苯透明，再用中性树胶封片。2.2.5.2.9光镜下观察切片：不同形态的菌丝及孢子可被染成紫红色，细胞核呈蓝色。2.3统计学处理13 使用SPSS21.0统计软件处理实验数据。在SDA培养基上不同温度下(27℃与37℃)生长第1天﹑第3天和第7天菌落直径比较用两样本t检验(Independent-SamperTtest)；免疫抑制和免疫正常腹腔注射组的生存天数用两个独立样本比较的Wilcoxon秩和检验；免疫抑制和免疫正常腹腔组的真菌逆培养阳性率比较用四格表确切概率法(Fisher’sexacttest)；免疫抑制腹腔组小鼠心、肝、脾、肺、肾各脏器阳性率比较采用行×列表资料的22χ检验；其两两比较采用基于χ分割法的多个样本率间多重比较的方法。P＜0.05为有统计学意义(其中多个样本率间多重比较的检验水准为α’=0.005)。14 结果1形态学观察1.1绘制生长曲线卷曲巴克斯霉原变种于SDA培养基上前3天生长迅速，此阶段菌落生长速度与时间呈正比，且27℃较37℃生长快(Fig.37)。1.2SDA培养基上的菌落直径菌落在两种温度(27℃与37℃)的SDA培养基上生长，第1天、3天、7天直径比较均有显著性差异(P＜0.05)(Table1，Table2，Table3)，认为菌落在27℃下较37℃生长快。1.3菌落形态接种8h后SDA培养基上开始有菌落生长，形态大体为白色羊毛状(Fig.1)，接种24h后在27℃与37℃下菌落的平均直径分别为1.76cm、1.12cm，72h后两种温度下的平均直径分别为8.01cm、4.53cm。菌落的生长直径与时间成正比。27℃下菌落生长速度较快，在96h后已长满整个平皿(9.00cm)，气生菌丝较蓬松、稀疏，向上生长趋势较为明显(Fig.2)。37℃下菌落生长较慢，7天后平均直径为7.87cm，且菌落边缘不整齐(Fig.3)。两种温度下的培养基背面呈白色，未见明显颜色改变(Fig.4)。1.4光镜下形态菌丝生长状况较好，可见大量粗大、透明、多核、无分隔的菌丝(Fig.5)，菌丝直径粗细不均匀，分枝比较明显，部分有侧生菌丝(Fig.6)。菌丝顶端可见膨大的球形孢子囊(Fig.7)，破裂后可释放出大量孢子，孢子具有荧光、壁薄、大小不一、呈圆形或椭圆形(Fig.8、9)，破裂的孢子囊偶见囊领状结构。2致病性试验结果2.1接种菌悬液后小鼠的一般状况不同免疫状态皮下组小鼠的活动量及进食量均无明显变化，免疫正常皮下组小鼠在接种部位发现有局部红肿反应，1周后即可自愈；免疫抑制皮下组小鼠的局部损害比较严重，出现局部结节样损害(Fig.10)，部分小鼠发生皮肤及皮下组织坏死(Fig.11)，但2～3周后均可自愈。免疫正常腹腔组在接种该菌两周内的活动量稍有减少，毛发散乱，有自然死亡情况，15 2周后一般状况逐渐恢复；免疫抑制腹腔接种小鼠表现为活动量与进食量均明显减少，逐渐消瘦，身体畏缩，毛发倒逆无光(Fig.12)，不断出现自然死亡小鼠。2.2自然死亡情况免疫抑制腹腔组在接种该菌后第2天小鼠出现死亡，第5天达到死亡最高峰，1周死亡率为56.7%(17/30)，2周死亡率达96.7%(29/30)；免疫正常腹腔组在接种后第2天出现死亡，第9～10天达到死亡高峰，1周死亡率为30%(9/30)，2周死亡率为80%(24/30)，2周后小鼠无自然死亡。小鼠自然死亡折线图见(Fig.38)，两组生存天数用Wilcoxon秩和检验两样本比较法检验，Z=-2.389，P＜0.05，差异有显著性，可认为免疫正常腹腔组较免疫抑制腹腔组的生存天数长。免疫正常和免疫抑制皮下组均无自然死亡情况。2.3解剖后各脏器大体改变免疫抑制及免疫正常腹腔组各时期自然死亡的小鼠心肺充血、水肿(Fig.13)，肝脾普遍可见不同程度肿大，呈紫红色(Fig.14、15)，肾脏偶见呈紫红色充血水肿(Fig.16)，部分小鼠肝脏﹑脾脏和肺脏表面可见针尖至粟粒大小白色化脓感染灶(Fig.17、18、19)。不同免疫状态皮下组小鼠各脏器未见明显大体病理改变。2.4组织真菌逆培养2.4.1皮肤组织真菌逆培养将免疫抑制皮下组小鼠皮损处的痂皮、坏死组织及周围鼠毛接种于SDA培养基上27℃培养１周，40％(6/15)生长出菌落，菌落的大体和镜下形态均与接种菌株形态相同(Fig.20)；免疫正常皮下组小鼠皮损处的痂皮及鼠毛培养1周均无菌落生长。2.4.2内脏组织真菌逆培养①不同免疫状态皮下组小鼠的各脏器真菌逆培养结果均为阴性。②免疫抑制腹腔处死组30只小鼠，心﹑肝、脾、肺及肾组织真菌逆培养的阳性结果依次为：10、25、27、26、7；免疫正常腹腔处死组30只依次为6、18、19、19、1，且2周内所处死小鼠各脏器逆培养均有阳性结果出现，而2周后处死的小鼠各脏器均为阴性。免疫抑制和免疫正常腹腔组两组真菌逆培养阳性率统计学分析(Table4)，P＝0.030，按α＝0.0516 水准，认为有显著性差异。③免疫抑制腹腔组小鼠心、肝、脾、肺、肾各脏器真菌逆培养阳性率比较有显著性差异(P＜0.05)。各脏器间阳性率比较：脾脏、肺脏、肝脏阳性率明显高于心脏、肾脏，有显著性差异(P＜0.005)；脾脏、肺脏、肝脏两两比较均无统计学意义(P＞0.005)；心脏与肾脏阳性率比较无统计学意义(P＞0.005)。(多个样本率间多重比较的检验水准α’=0.005，见Table5)。2.5组织病理学检查不同免疫状态的皮下组，小鼠内脏均无明显病理学变化。不同免疫状态的腹腔注射组，所有感染内脏的主要病理学变化如下：心脏：血管扩张充血、血栓形成(Fig.21)，心肌纤维间可见散在红细胞。心肌细胞横纹模糊不清，部分心肌细胞坏死、断裂(Fig.22)，弥漫散在淋巴细胞浸润(Fig.23)，可见少许中性粒细胞。心腔内未见菌丝及孢子。肝脏：早期肝细胞肿胀，肝窦狭窄，部分肝细胞变性、坏死(Fig.24)，严重者肝小叶结构破坏，肝组织内散在淋巴细胞、中性粒细胞浸润；晚期巨噬细胞增生(Fig.25)。脏器多灶性真菌感染，HE染色及PAS染色均可见血管内有大量紫红色的粗大分枝菌丝和孢子(Fig.26)，部分肝组织内可见少量菌丝及孢子(Fig.27)。脾脏：可见组织充血性改变，散在中性粒细胞等急性炎细胞浸润，并且纤维组织增生(Fig.28)。脏器多灶性真菌感染，HE染色及PAS染色均可见血管和组织内大量紫红色的短粗、分枝而不分隔的菌丝和圆形孢子(Fig.29)。肺脏：主要为间质性肺炎的改变，表现为毛细血管扩张充血、出血，小叶间隔及肺泡壁明显增宽、充血水肿，弥漫性淋巴细胞、中性粒细胞等炎细胞浸润(Fig.30)，偶见巨噬细胞增生。脏器大小血管内血栓形成，部分肺组织坏死，肺泡间隔断裂、融合(Fig.31)。另有急性支气管炎的改变，受累粘膜上皮坏死脱落(Fig.32)，部分管腔内充满渗出物。肺泡间质及血管壁内可见弥漫分布的大量PAS染色阳性的粗大菌丝和孢子(Fig.33)。肾脏：表现为急性肾小球肾炎的改变，肾小球及肾小管变性、坏死(Fig.34)，肾皮质和髓质充血、水肿，弥漫性淋巴细胞、中性粒细胞等炎细胞浸润，少量巨噬细胞增生(Fig.35)，肾小管内可见大量管型形成(Fig.36)。肾实质内未见菌丝及孢子。17 附图Fig.1ColonyonSDA:anteriorviewofwhite,woollycolonyFig.2ThecolonyonSDAat27℃iswhite,sparseandfluffy,upwardgrowthtrend18 Fig.3TheSDAmediumcolonyedgeisnotneatat37℃Fig.4Dorsalviewofwhitecolony19 Fig.5Themyceliumishyaline,multinuclearandnoseparate(×400)Fig.6Thebranchedmyceliumwithunevendiameter(×400)20 Fig.7Alargenumberofsporangiagatherandthethickhyphae(×400)Fig.8Sporesarescatteredaroundthehyphae(×400)21 Fig.9Alargenumberofbuddingspores(×400)Fig.10Anoduleinbackofimmunosuppressivemouseinjectedthroughintradermalpathway22 Fig.11SeriousnecrosisinmicebackskinandsubcutaneoustissueFig.12Themouseintheimmunosuppressedstate:obviouslyemaciatedandhairwithoutgloss23 Fig.13HeartandlungofthemousearecongestiveandedematousFig.14Claret-coloredintumescentliver24 Fig.15Hyperemiaandedemaofmousespleen,showingpurpleFig.16Purplecongestionandedemaofthemousekidney25 Fig.17WhiteabscessonthesurfaceofliverFig.18Scatteredwhitemicroabscessonthesurfaceofspleen26 Fig.19WhiteabscessonthesurfaceoflungFig.20Whitewoollycolonyintubemedium27 Fig.21Thrombusformationinthebloodvessel(HE,×100)Fig.22Myocardialcelldeathandtransversestriationdisappearance(HE,×400)28 Fig.23ThecardiacmuscletissueisinfiltratedbyalotofRBCandlymphocytes(HE,×400)Fig.24Livercelldegenerationandnecrosis(HE,×400)29 Fig.25Macrophageproliferationattheadvancedstageofliver(HE,×400)Fig.26Alotofhyphaeandsporesinthebloodvessel(PAS,×400)30 Fig.27Hyphaeandsporesinsidethehepatictissue(PAS,×400)Fig.28Generoushyphaeinsidethesplenictissueandvessel,fibroustissuehyperplasiacanbeseenbesides(HE,×400)31 Fig.29Thesplenictissueisinfiltratedbyneutrophilicgranulocytesandhyphae(HE,×400)Fig.30Inflammatorycellsinfiltration,telangiectasisandhyperemiaoflung(HE,×400)32 Fig.31Pulmonarytissuenecrosis(HE,×400)Fig.32Thrombosisofbloodvesselsandbronchialmucosalepithelialnecrosis(HE,×100)33 Fig.33Magnanimoushyphaeoflung(PAS,×400)Fig.34Degenerationandnecrosisofglomerulusandrenaltubule(HE,×400)34 Fig.35Macrophageproliferationofkidney(HE,×400)Fig.36Casttoformintherenaltubule(HE,×400)35 菌落生长曲线图Fig.37ThegrowthcurvesontheSDAmediumat27℃and37℃小鼠自然死亡折线图Fig.38Thenaturaldeathgraphofimmunosuppressedandnormalmicewhichwereinoculatedintraperitoneally36 附表Table1ThecolonydiametersontheSDAmediumcomparedat27℃and37℃onthefirstday(Independent-SampleTtest)温度例数平均直径tP27℃51.7616.5250.00037℃51.12Table2ThecolonydiametersontheSDAmediumcomparedat27℃and37℃onthethirdday(Independent-SampleTtest)温度例数平均直径tP27℃58.0177.8150.00037℃54.53Table3ThecolonydiametersontheSDAmediumcomparedat27℃and37℃ontheseventhday(Independent-SampleTtest)温度例数平均直径tP27℃59.0044.3220.00037℃57.87Table4Thefungalcultureresultsofimmunosuppressedandnormalmicewhichwereinoculatedintraperitoneallyinfourweeks组别例数阳性数P值免疫抑制腹腔组3027免疫正常腹腔组30190.030Notes:P＜0.0537 Table5Thefungalcultureresultsofviscerainimmunosuppressedintraperitoneallyinoculatedgroup2组别例数阳性数PearsonχP值脾脏302753.6840.000肺脏3026肝脏3025心脏3010肾脏307Notes:1Thefungalculturepositiverateofthespleen,lungandliverweresignificantlyhigherthantheheartandkidney(P＜0.005).2Spleen,lungandliverhadnostatisticaldifferencewitheachother(P＞0.005).3Nostatisticaldifferencebetweenheartandkidney(P＞0.005).38 讨论毛霉(Mucor)又称长毛霉，属于接合菌亚门、接合菌纲、毛霉目、毛霉科，广泛分布于土壤、粪便、禾草、空气及腐烂的动植物尸体上。毛霉的经济用途很广，能糖化淀粉、生成少量乙醇，常在酒药中出现；产生蛋白酶，能分解大豆蛋白，常用来做豆豉、豆腐乳；许多毛霉还能产生乳酸、琥珀酸、草酸、甘油等；有的毛霉能产生果胶酶、凝乳酶、脂肪酶等；一般常用的有总状毛霉(M.racemosus)、鲁氏毛霉(M.rouxianus)、高大毛霉(M.mucedo)等。毛霉目又可分为很多属，其中能导致人类致病的有毛霉属(Mucor)、根霉属(Rhizopus)、根毛霉属(Rhizomcor)、鳞质霉属(Apophysomces)、犁头霉属(Absidia)、小克银汉霉属(Cunninhamella)、瓶霉属(Saksenaea)、科克属、并头状菌属(Syncephalastrum)等。1855年Kurchenmeister报道了首例肺癌患者合并毛霉菌感染，1885年Paultauf报[4]道了1例由伞状犁头霉引起的全身播散性毛霉菌病。毛霉一般为条件致病菌，当机体发生疾病免疫力下降时侵入，引起人体浅部或深部真菌病，近几年国内外有关毛霉菌感染的报道已逐渐增多。巴克斯霉属(Backusella)属于毛霉菌属真菌，卷曲巴克斯霉原变种(B.circinavar.circina)为巴克斯霉属的其中一个变种，截止到目前尚无该菌引起人体感染的相关文献报道。本研究所用菌株分离自1例白血病患者的面部黑色痂皮中。河北医科大学第四医院皮肤科万力教授等已对卷曲巴克斯霉原变种临床分离株进行了初步实验研究，找出了其最适合的培养基为沙堡氏培养基，适宜的生长温度为27℃和32℃，且只有一种菌落形态，尿素酶实验阳性，其在电镜下特点是圆形孢子囊外周呈放射状疣状结构、疣之间相互[4]无连接；并通过将不同菌丝与孢子比例且不同浓度的该菌菌悬液经腹腔注射接种于不同免疫状态的小鼠体内，观察小鼠感染后的一般状况及死亡情况，对该菌的致病力有了初步认识，认为该菌致病力及侵袭力强，且致[5]病能力主要来源于菌丝。本实验研究一方面通过对卷曲巴克斯霉原变种进一步的形态学观察，为实验室鉴定该菌提供依据；另一方面通过建立卷曲巴克斯霉原变种系统性感染的动物模型，观察免疫状态和接种途径各不相同时小鼠的一般状况及死亡情况，并通过对实验小鼠进行解剖、组织真菌逆培养、组织病理学39 检查等方法观察各脏器的感染情况，进一步了解此菌的致病力、脏器播散情况及其引起的组织病理学特点，为临床上诊断和治疗卷曲巴克斯霉原变种感染提供有力的实验室依据。目前真菌的分类鉴定主要是根据形态学分析、生理生化学实验和分子生物学方法等，其中应用最常见的仍是形态学观察。同一菌种在同一种培养基而不同温度时，菌落生长速度和形态包括颜色﹑质地﹑结构等都会有[6]所不同，因此鉴定菌种必须在标准﹑适用的培养基及培养条件下进行。[7]真菌生长、繁殖必须要有氮源、碳源、无机盐、维生素、水。其中最适合菌丝生长的碳源、氮源分别需要培养基中的葡萄糖、蛋白质来提供，SDA培养基中富含葡萄糖、蛋白胨，因此卷曲巴克斯霉原变种在SDA培养基上生长状态最佳、速度最快。同样在SDA培养基上，在不同温度下，该菌菌落的生长速度也不相同，在27℃下明显快于37℃时，考虑在37℃下培养基中水分蒸发丢失较快，不能较好的为菌落生长提供充分的水分，致使其生长缓慢。但该菌在37℃下仍能生长的耐热特性，对于其在人体内生长尤为重要。卷曲巴克斯霉原变种菌落大体为白色羊毛状，气生菌丝相对稀疏、蓬松，向上生长趋势明显，培养基背面呈白色，无明显颜色改变。平皿培养基能够更完整的观察菌落的形态和变化情况，但是很容易被污染。玻片培养(又称小培养)时菌丝和孢子按一定的规律发育生长，自然状况下的结构特征不易被破坏，通过显微镜可以直接进行观察。实验中观察到菌丝生长状况较好，可见大量透明、多核、无分隔的菌丝，直径粗细不均匀，分枝明显，部分有侧生菌丝，菌丝的顶端可见膨大的孢子囊，破裂后释放出大量具有荧光、壁薄、大小不一、呈圆形或椭圆形的孢子。表明卷曲巴克斯霉原变种主要是以孢囊孢子的形式繁殖，属无性繁殖的范畴。近年来，不断发现了很多新的真菌或真菌变种可以引起人类深部真菌感染，例如国际上报道的首例由多变根毛霉规则变种引起的损毁性毛霉病；世界上发现了首例葡萄孢维郎那霉所致人体感染；我国首例由棘状外[8、9]瓶霉引起的系统性暗色丝孢霉病等。患者多有营养不良、糖尿病酸中毒、大面积严重烧伤、外伤、手术、白血病、淋巴瘤、AIDS或其他严重消耗性疾病，或者使用免疫抑制剂、细胞毒药物、糖皮质激素等。所以，免疫抑制状态是引起系统性真菌感染的重要原因之一。环磷酰胺是常见的40 免疫抑制剂，能够导致小鼠的外周血和脾内活化的T淋巴细胞及NK细胞[10]的数量、增殖能力及活性均降低，因此腹腔注射环磷酰胺可造成小鼠的免疫抑制状态。免疫抑制腹腔组在接种后第2天开始出现死亡，第5天即达到死亡高峰，1周死亡率为56.7%(17/30)，2周死亡率达96.7%(29/30)，30只小鼠的真菌逆培养阳性结果为27；免疫正常腹腔组在接种后1周死亡率为30%(9/30)，第9～10天为高峰，2周死亡率为80%(24/30)，30只小鼠有19只逆培养为阳性，且其中2周后的小鼠无自然死亡情况，这些小鼠各脏器逆培养均为阴性。两组小鼠自然死亡情况及组织真菌逆培养的结果表明：小鼠在免疫力低下状态，腹腔注射菌悬液后因机体的细胞免疫受到严重抑制，该菌可迅速穿透宿主抵御感染的结构屏障，更容易使小鼠发生全身播散性感染，导致死亡的迅速发生，并且感染菌体在小鼠体内持续的时间长，感染的程度更重，为致死性的；而免疫正常组的小鼠早期有正常免疫力抵御真菌的侵犯，故死亡高峰出现的较免疫抑制小鼠的晚，且2周后无自然死亡及逆培养阴性，可能和小鼠获得性免疫应答建立和增强，使体内的菌逐渐被清除有关，进一步说明卷曲巴克斯霉原变种虽然是一种条件致病菌，但同样也会导致免疫正常小鼠致病，而仅仅是感染程度较免疫抑制小鼠轻。由此看来，机体的免疫状态在卷曲巴克斯霉原变种所致系统性感染中的作用是至关重要的，这也向我们提示在临床治疗该菌系统性感染时，使用免疫增强剂和抗真菌药物的联合治疗方案效果可能会更佳。通过腹腔途径接种菌悬液，腹膜面积大，并且分布有大量的血管和淋巴管，所以吸收菌量多，可以成功建立卷曲巴克斯霉原变种系统性感染的小鼠模型。无论何种免疫状态的小鼠，皮下注射该菌菌悬液仅导致注射部位产生局部感染灶，内脏组织真菌逆培养和组织病理学检查均为阴性，可能是由于皮下接种途径通过皮下组织的微血管吸收侵入内脏的少量真菌还不能够引起系统性感染。并且即使免疫抑制小鼠皮损炎症反应比免疫正常小鼠严重，而2～3周后两组都能自愈，这可能是因为小鼠的免疫系统在逐渐的恢复和重建，进一步说明卷曲巴克斯霉原变种引起的浅部真菌感染的病变程度同样也与机体免疫状态密切相关。但是在人体致病性方面，临床上由该菌引起的浅部真菌病会不会导致系统性感染还有待进一步考证。41 组织真菌逆培养对深部真菌病的诊断有重要的意义，是判断内脏组织是否存在真菌感染的可靠方法，还可以从中分离得到纯菌种，其中试管培[11]养法是临床上最常用的培养方法。我国《血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则(修订版)》中指出：在无菌条件下取得的临床表现或影像学检查怀疑感染而原本无菌部位的标本，其真菌培养阳性[12]是确诊深部组织真菌感染的重要依据。计数各脏器逆培养的阳性数可以表现各脏器的易感程度，但是不能代表组织的感染程度。免疫抑制腹腔处死组30只小鼠，心脏﹑肝脏、脾脏、肺脏及肾脏组织真菌培养阳性结果依次为：10、25、27、26、7；免疫正常腹腔处死组30只依次为6、18、19、19、1。发现无论是免疫抑制还是免疫正常腹腔注射菌悬液，肝脏﹑脾脏、肺脏阳性率明显高于心脏、肾脏。考虑肝脏受累机率高，可能与腹腔途径接种更容易通过门静脉回流直接进入肝脏，且肝脏血供丰富有关。脾脏血供也很丰富，而且还是清除血中各种有害微生物的重要过滤器官，真菌容易在此定植增殖。胸腔脏器即肺脏和心脏的逆培养阳性结果可以排除通过腹腔注射菌悬液而将菌株直接被接种到腹腔脏器造成逆培养假阳性的可能，因胸腹腔间有横膈膜的存在。组织病理学可以根据在脏器组织中发现真菌病原体、并显示真菌在组织内的侵袭情况和宿主的局部组织反应来诊断深部真菌感染，可初步确定真菌的种、属，检查明显快于真菌培养。大多数真菌在传统的HE染色时，菌丝及孢子不宜着色或很浅，很难发现组织中是否存在真菌结构，需要配合PAS染色。而与大多数真菌相反，毛霉极易在苏木精伊红染色的组织切片中发现，果莫里乌洛托品银染色可以清楚地显示，而特殊的真菌染色[13]如过碘酸希夫染色则不能很好地显示真菌。为了更清楚的呈现卷曲巴克斯霉原变种在组织中的形态特点，本实验采用了HE染色及PAS染色两种染色方法。深部真菌病的病理改变特征各不相同，例如急性或慢性炎症、化脓性[14]炎症、化脓性肉芽肿、结核性肉芽肿、血栓性血管炎、钙化等。本实验发现卷曲巴克斯霉原变种引起的系统性感染可以累积心、肝、脾、肺、肾等各脏器，大体病理改变表现为各脏器不同程度的充血、水肿，部分小鼠肝脏﹑脾脏和肺脏表面可见针尖至粟粒大小白色化脓感染灶。组织病理学检查发现卷曲巴克斯霉原变种易侵袭血管、淋巴管、组织，尤其是大小动42 脉，很少侵犯静脉，导致血栓形成、血管壁坏死和邻近组织变性、坏死、梗死，感染严重的组织内可见大片坏死和大量菌丝及孢子的浸润。有大量淋巴细胞、中性粒细胞、少量浆细胞等炎细胞广泛浸润，少量巨噬细胞增生。病变区域内包括坏死组织、血管壁、血管腔和血栓内都可见到该菌，菌丝粗大宽阔，壁薄，不分隔或偶有分隔，菌丝两侧不呈平形状，有时扭曲、折叠、形态多样，偶有局限性的泡状膨大，分枝少、大多呈直角；孢子壁薄、大小不一、呈圆形或椭圆形。上述组织病理特点解释了小鼠感染卷曲巴克斯霉原变种后易发生早期播散和死亡的作用机制可能是：真菌随着血液可迅速到达各脏器，以腐物寄生形式存在并侵入组织，很快出芽形成大量菌丝，可引起周围组织炎症、坏死；其次该菌极易侵犯血管，尤其是大小动脉，故在动脉内膜下层繁殖，引起血栓形成、栓塞及组织坏死；坏死组织缺血、缺氧呈酸性，又为其生长提供了更加适宜的环境，引起恶性循环，导致小鼠早期各脏器功能衰竭并死亡；临床治疗中使用各种免疫抑制剂、糖皮质激素、广谱抗生[15]素等也能够加剧其播散。本研究中免疫正常与免疫抑制腹腔组的小鼠心脏及肾脏逆培养结果是阳性，但组织病理学检查未见菌丝或孢子，考虑可能处于感染过程中某一阶段，致病菌体数量少或局限在组织局部，切片时[16]没有切到病变处导致。毛霉广泛存在于自然界中，其引起的系统性感染对机体任何一种脏器的损伤都可以是致命性的，因此在临床上要提高对毛霉目真菌致病性的认识和警惕，尤其是对免疫功能低下的患者更应加强预防及诊治。卷曲巴克斯霉原变种为临床上至今罕见的一种条件致病菌种，其致病性方面如逃逸机体防御反应机制、在组织内侵袭及增殖的过程、特异性免疫应答的建立及作用机制，和该菌在生理、生化、分子生物学、药物敏感性等各方面仍需进一步的研究及探讨。43 结论1卷曲巴克斯霉原变种只有一种菌落形态，在最适合其生长的SDA培养基上27℃下较37℃生长良好。2通过腹腔注射途径可以成功建立卷曲巴克斯霉原变种系统性感染小鼠模型；皮下注射接种不能导致小鼠系统性感染。3该菌属于条件致病菌，机体免疫力低下时更易引起感染，且感染也更加严重。但较大菌量也可导致正常免疫小鼠系统性感染，说明该菌致病力及侵袭性强。4卷曲巴克斯霉原变种引起的特征性组织病理学改变为极易侵犯血管导致血栓形成和组织坏死，伴有各种炎细胞浸润。5无论何种免疫状态，肝、脾、肺均为该菌最易感染的器官；而心、肾较不易感染。44 参考文献1郑儒永,刘小勇,王亚宁.中国新记录巴克斯霉属Backusella的两个分类单元(英文)[J].菌物学报,2013,32(3):330.2田小芸,焦瑞清,郑明明,等.rhM-CSF对化疗小鼠抗白念珠菌感染的实验研究[J].南京大学学报,2002,38(6):850~854.3符美华,陈辉,宋琳毅,等.面部毛霉病一例[J].国际皮肤性病学杂志,2006,3,32(2):67~69.4黄攀登.巴克斯毛霉(Backusellacircina)的生理学试验及培养基形态学观察[D].河北医科大学,2013,3:10~12.5李静.卷曲巴克斯霉原变种(Backusellacircinavar.circina)感染小鼠的生存试验观察及致病性的动物实验研究[D].河北医科大学,2014,3.6殷凯生,王彤,廖万清.国产注射用两性霉素B脂质体治疗深部真菌病的疗效与安全性的临床研究[J].中华医院感染学杂志,2004,14(8):850~854.7吴绍熙.现代医学检验手册[M].第2版.北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,2005:65~66.8LiRY,WangDL,DaiWL.DematiaceousfugalinfectionsinChina[J].CurrTopMedMycol,1995,6:283~305.9LiRY,WangDL.StudiesonphaeohyphomycosisanditscausativeagentsinChina[J].JpnJMedMycol,1996,37:135~141.10杨颖,蔡玟,黄志彪,等.环磷酰胺致小鼠免疫功能低下模型建立与评价[J].中国公共卫生,2008,24(5):581~583.11徐红,顾菊林.医学真菌检验[J].中国真菌学杂志,2006,4,1(2):11~116.12沈志祥.关于"血液病/恶性肿瘤患者侵袭性真菌感染的诊断标准与治疗原则(修订版)"[J].中华内科杂志,2007,46(7):607~610.13贾杰.现代真菌病学[M].郑州:郑州大学出版社,2001:95~105.14马蕾.真菌病的组织病理学[A].王端礼.医学真菌学-实验室检验指南[C].北京:人民卫生出版社,2005:38~55.15韦兴国.Marneffei青霉致病性动物实验研究[J].广西医药,1999,21(5):887~889.16王晓慧,张峰,李若瑜,等.链格孢对ICR小鼠致病性的研究[J].中华皮肤45 科杂志,2004,37(12):718~720.46 综述深部真菌感染研究进展真菌（Fungus），广泛存在于大自然环境中，大约共有150多万种，大多数的真菌都不同程度的对人体有益或无害，但仍有400多种可导致人[1]体深部真菌感染，即致病性真菌。据统计，2007年至2011年5年间真[2][3]菌在临床病原菌中所占比例已由7.8％上升至26.2％，李玉等也得出了相近的结果。而由于深部真菌感染造成的死亡人数也大幅增加，各种欧洲死亡病例的分析显示，1983-1997年间因深部真菌感染死亡的人数占所有[4]死亡病人数的5.1％，1998-2002年比例上升为7.8％。真菌引起的疾病依不同的感染部位可粗略分为浅部真菌病及深部真菌病，浅部真菌病是指侵犯人类或动物的毛发、表皮及指（趾）甲造成的病变，深部真菌病可以[5]累及皮肤角质层以下、皮下组织及黏膜，甚至侵犯各种内脏。另有众多研究人员使用侵袭性真菌病（IFD）的名称，定义为各种真菌侵犯了机体[6]组织或血液，造成组织损害或功能障碍的病理改变表现。但也有学者提[7]出质疑，从真菌感染机理、临床确诊的复杂性，到临床治疗及预后判断，使用侵袭性真菌病诊断名称都存在很多误解，例如许多浅部真菌病在发病[8]机制上也存在侵袭性，国外学者也开始对使用IFD提出看法。近几年深部真菌感染率逐渐升高，病情进展快，且菌株的变化情况复杂、条件致病菌增多、感染部位多元化，而诊断难、疗效差、病死率高、治疗费用高，所以临床上要高度重视深部真菌感染的诊治。1深部真菌感染的危险因素及易感病因随着对各种疾病的深入了解，实验室检查技术和治疗方法也迅速发展[9]多样化，使得深部真菌感染的危险因素越来越复杂。①年龄：高龄（≥65岁）者各组织器官退行性变化、功能衰退、细胞因子合成减少，婴幼儿（＜1岁）阶段免疫系统尚未发育成熟；②基础疾病：一项对33例深[10]部真菌感染患者的调查结果显示63.6％患者有肾功能不全、51.5％合并[11]恶性肿瘤、24.2％有呼吸系统疾病。另一项调查显示呼吸系统的基础疾病最多见，如重症肺炎、COPD并发慢性肺源性心脏病，且肺部所患病种[12]越多真菌感染的机会也越大，老年患者肺部生理功能减退且免疫力较低47 [13]，更容易感染各种真菌。调查发现患有急性白血病者感染真菌的发生率[14]高达20％，这是由于患者化疗后中性粒细胞减少、骨髓抑制，导致免[15][16]疫力下降。艾滋病患者中90％可发生假丝酵母菌感染，位于东南亚[17]的艾滋病患者最多见的死因是马尔尼菲青霉病。内分泌系统疾病如糖尿[18-19]病也是真菌感染的重要基础疾病之一。③抗生素：使用≥3种且时间≥2周，抗生素的滥用会引起菌群失调和二重感染，真菌活跃，由肠腔侵入血循环。④器官移植：患者要使用免疫抑制剂来预防发生排异反应，所[20]以更容易感染真菌，感染的菌种也各不相同，其中28％的移植可合并[21]新型隐球酵母菌感染。⑤化疗药物／免疫抑制剂。⑥糖皮质激素：研究表明长期使用不但可以导致白细胞向刺激物所在部位作定向移动和吞噬病原菌的能力大大降低，还影响了溶酶体膜降解和释放酶的能力，从而降[22]低了免疫力。⑦创伤和外科手术。⑧各种侵入性操作：如气管切开或插管、静脉留置导管、内镜检查等。⑨感染细菌或病毒的机体状态：据报道[23]，机体感染巨细胞病毒是进一步感染念珠菌和曲霉菌的危险因素。⑩环境：例如曲霉菌属广泛分布于环境中，尤其是在医院环境中，食物、地毯、空气通风系统或建筑粉尘等常常存在大量的曲霉菌，进一步导致高危人群[24]感染曲霉的可能性增大。从以上各易感因素可看出，机体正常的细胞免疫功能对于抵抗深部真菌感染非常关键，其中最关键的是中性粒细胞和+[25]CD4辅助细胞。2发病机制深部真菌感染的发病机制实质上是各种真菌与宿主往来互相影响作[26]用的过程，宿主正常的防御系统可以抵抗真菌侵入，真菌利用自身毒力因子打破各种防御关卡而造成机体病变。其中宿主的免疫系统包括天然免疫和适应性免疫：天然免疫系统包括黏膜和角质层等物理屏障、巨噬细胞等细胞识别功能、信号通路传导、细胞因子的分泌等，它是防御外来病原菌入侵的首道防线，能非特异性的快速产生抑制入侵的反应，并可提供第二信号启动下一步的特异性免疫；特异性免疫即为适应性免疫，包括细胞免疫应答、体液免疫应答。真菌的自身毒力是感染发生的另一重要方面，现已通过基因敲除等方法分离出了许多毒力因子：①黏附：对许多真菌来说，黏附于宿主上皮和细胞外基质的能力是其侵入机体和进一步感染扩散的首要条件。②侵袭性48 酶类：大量研究发现有些真菌可以分泌特异性酶，导致机体的有效防御成分破坏，进而使感染扩散，包括磷脂酶和蛋白酶。③菌体形态转换：例如白假丝酵母菌感染机体时产生了可以分泌芽管特异性抗原的假菌丝，使其对宿主的黏附能力大大提高。④抵抗宿主防御的相关物质：多项实验发现有些真菌的结构成分或其产生的物质与其毒力有关，如硅酸、荚膜多糖、[27-30]甘露醇、黑色素等。⑤信号转导：神经钙蛋白、G蛋白、Ras蛋白等[31-32]在菌株繁殖的很多方面都是必需的。3菌群分布的现状多项调查结果表明深部真菌感染的主要菌种还是念珠菌，其中热带念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌及近平滑念珠菌等非白念珠菌在所有念珠菌感染中占有的份额加大，这一点从宁夏医科大学附属医院深部真菌感染的流行特点调查的数据中可以直观的发现，2004年非白念珠菌深部感染[33][11]占比17.89%，2011年已经上升为30.83%。虽然白色念珠菌感染占总[34-36]念珠菌感染的比重下滑，但它仍旧是其中最多见的菌种。曲霉菌感染[37]仅低于念珠菌感染，包括烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉等。位于第三位的是隐球菌病，主要是由新生隐球菌及格特隐球菌引起。另外，近几年人类发现了越来越多新的条件致病菌，包括罕见的或从未发现的菌种，以及很多以前公认的不致病的菌株发现也会导致人体疾病，例如毛霉、组织胞浆菌、酵母样真菌等，值得一提的是马尔尼菲青霉导致的地域性流行感染已被越[38]来越多的研究学者熟知。以上表明，深部真菌感染菌群分布的现状正在发生变化，同时各种检测技术的快速发展也为人类探索和发现新菌种提供了有力条件。4易感部位及临床表现由于深部真菌感染患者多有各种基础疾病，所以由真菌感染造成的本身没有特异性的症状和体征常常不能较为明显的表现出来，由此看来临床上要严密监测出现原发病无法解释症状的患者病情进展情况，尤其是[39-40]ICU、肿瘤科、血液科、感染科以及烧伤、移植病房。多项调查显示，肺部和口腔是最常见的易感部位，泌尿道感染位居第二，另有血液系统、[41]消化道、脑等部位。但也有报道中枢神经系统最易感染真菌，其次是血液感染。因此不同地区或不同医院之间深部真菌感染的流行特征都有很大[42]差异。深部真菌感染的早期较易侵犯机体局部黏膜，若病情进一步加重49 就可能出现真菌菌血症播散。患者可局部表现为寒战高热（或同时使用激素者可无发热），咳嗽、咯黏稠样痰，长期腹泻、偶有血便，血尿，侵犯内眼会导致视力下降，女性外阴部位瘙痒、白带增多，脑膜炎会有头痛、脑膜刺激征及颅内高压症的表现，甚至出现中毒性休克的症状。近几年，深部真菌感染有明显的向多部位、多器官侵袭的势态，所造成的病情也趋向于复杂多变。当机体两个部位以上存在定植菌的时候，需要警惕播散性[43]深部真菌感染的发生。[44]临床上还要重视机体感染受侵部位与菌种的关系。常见的念珠菌主要侵犯机体各部位黏膜，如口腔、上下呼吸道、消化道及女性阴道黏膜等，引起各部位的相应症状，进而侵袭至血液系统，造成播散性深部真菌感染；曲霉菌早期较易累及肺部，接着逐渐扩散至中枢神经系统，甚至危及全身系统；隐球菌有明显的噬神经特性，容易导致脑膜炎或脑膜脑炎等病变；毛霉菌因其特异性的侵犯各部位血管，可迅速引起血栓形成、组织坏死。另外，还要注意的是医院内各科室病房或不同环境下的深部真菌感染[44]的菌种也有各自的分布特点。肿瘤科病区最常见的深部真菌感染菌株是曲霉菌和接合菌，尤其是烟曲霉感染；ICU病房中明显多见的是念珠菌感染，约占90%的比重，白念珠菌又是其中最多见的；社区获得性深部真菌感染以隐球菌引起的中枢神经系统受累最常见；医院获得性深部真菌感染最常见的是念珠菌属，最易感染血液。5实验室诊断进展近几年，深部真菌感染的诊断技术有了突飞猛进的发展，现代科技发现了很多新方法，能够在感染早期阶段即可检测出真菌。当前，深部真菌病的实验室诊断技术主要包括直接镜检、真菌培养、组织病理学检查、血[45]清学诊断和分子生物学方法。5.1直接镜检与真菌培养传统的真菌镜检与培养是其中最经典的简便方法，虽然检查的灵敏度低，时间消耗长，不能早期为临床提供诊断依据，且对检验者操作及判断经验要求高，但一直以来众多学者都认同凡是本应无菌的组织直接镜检发现菌丝并伴有组织损害，或者正常情况下无菌组织经真菌培养发现真菌并[46]伴有感染性疾病过程可确诊为侵袭性真菌病，该法仍然是常规临床实验室中最可靠和最基本的方法，因此需综合传统的形态学方法以及新近发展50 的方法进行诊断。5.2组织病理学检查组织中存在真菌病原体是确诊深部真菌感染的“金标准”。组织病理学检查可以初步确定感染真菌的种、属，可以确诊致病菌存在于机体的状态是定植还是已致病，并能够反应其在组织内的播散情况和机体的应对状[47]态，检查快、耗时少。当传统的HE染色和各种特殊染色法观察到的组织中菌丝或孢子较少，不易与组织中其他物质的染色区别时，或者无法鉴别形态相似的真菌时，可以采用免疫组化及原位杂交的方法来进一步鉴别。目前已设计出用于免疫组化诊断念珠菌、曲霉菌、隐球菌的特异抗体，大大提高了检测出组织标本中致病菌的阳性率；原位杂交技术是将分子生物学科与组织化学两者相结合的一种方法，目前已用于深部曲霉感染的诊[48]断中。但是组织病理学检查因侵袭性的取材方法在临床应用中有时也难以展开，部分危重病人不能忍受该方法。5.3血清学诊断血清学实验快速、简便、敏感性和特异性强，是早期诊断感染的有力实验室检查手段，包括检测真菌的抗原、抗体和代谢产物。①其中抗原检测最为常用，目前临床应用较多的是GM试验、G试验、隐球菌乳胶凝集[49]法等。曲霉GM检测是现已被公认的早期诊断技术，但是易受一些食[50]物和药物的影响而导致假阳性，患者受到马尔尼菲青霉感染时也会出现假阳性结果；检测真菌细胞壁成分的G试验可以用于念珠菌和曲霉感染的早期诊断，但不能检测接合菌和隐球菌，同样也会出现假阳性或假阴性[51][52]结果，而且无法区分真菌种类；隐球菌荚膜多糖抗原检测可以快速[53]诊断隐球菌性脑膜炎和肺隐球菌病，包括LA法和EIA法；另外，念珠菌的热不稳定蛋白、甘露聚糖和胞浆烯醇化酶抗原阳性可以提示念珠菌感[54-55]染。②抗体检测在临床上应用较少，这是由于免疫低下患者难以产生足量的抗体而导致检测的敏感性不高，且检测处于定植而非感染的真菌时[56]也可能出现假阳性结果，但是可用于诊断某些地方性条件性真菌感染[57]。③最先应用于实验的真菌特异性代谢产物是D-阿拉伯糖醇，可以诊断除光滑念珠菌和克柔念珠菌外的其他深部念珠菌病，采用酶荧光法检测血、尿标本D-阿拉伯糖醇/肌酐的比值或用气相色谱法检测D-阿拉伯糖醇[58]/L-阿拉伯糖醇比值，但尚未应用到临床。51 5.4分子生物学诊断该技术可以从分子水平层面诊断深部真菌感染，还可用于分类鉴定、基因分析、致病机制、药物制作、耐药性等研究。现已应用的有：①聚合酶链反应PCR，改进PCR技术如巢式PCR、多重PCR及实时荧光定量[59-60]PCR等在真菌感染诊断中最常用，其灵敏度可达到90％以上，但交[61]叉污染率高，设备技术要求特殊。②DNA序列分析，能够获得DNA分子变异最可靠的信息，是分子生物学研究中最根本的方法，能够快速了解各真菌的基因结构，达到探索基因表达和分子进化过程的目的。③分子核酸杂交，将待测真菌的基因组DNA或细胞总RNA和带有标记的已知核酸序列的片段相杂交，即可检测待测核酸标本中有没有靶基因，而操作[62]复杂、耗时长是其一大缺点。④基因芯片技术（DNA微阵列），是将待测真菌的DNA和芯片进行杂交，进而通过分析获得的特异性图谱来鉴定致病真菌，可用于真菌的毒力筛选。⑤DNA指纹技术：RAPD分析已用于酵母菌及曲霉的鉴定、分类，可同时进行种间鉴定和种内分型；SSCP分析对于判定致病株与非致病株、耐药株与非耐药株、相近属种的鉴定等[62][63]均有一定意义；RFLP分析及MLST可较可靠的对不同曲霉进行鉴定。此外，影像学检查由于缺乏敏感性和特异性，只能作为辅助方法来帮助诊断深部真菌感染，例如肺部高分辨CT显示“晕轮征”或“新月征”[64]可提示患有肺曲霉病的可能；颅脑CT和MRI可用于诊断新生隐球菌脑膜炎或脑膜脑炎，以及暗色丝孢霉病的神经系统病变。值得我们注意的是，不论哪种实验室诊断方法都有其优点及缺点，只有将多种检查方法相互结合，才能使深部真菌感染的诊断更加完善。6最新治疗进展[1]常用的抗真菌药物以作用机制分为：①作用于真菌的细胞膜，包括影响麦角固醇合成的药物三唑类、吗啡类、丙烯胺类，损害脂质结构的多烯类；②干扰细胞壁合成的棘白菌素类，如卡泊芬净、米卡芬净；③影响核酸合成，如5-氟胞嘧啶；④影响蛋白质翻译过程的在研新药和碘化钾等其他药物。其中近年来发展较快的是三唑类和棘白菌素类。第二代三唑类药物伏立康唑、雷夫康唑和泊沙康唑的抗菌谱较第一代的伊曲康唑和氟康唑更广泛，对很多耐氟康唑的条件致病性真菌有较好的治疗活性，美国感[65]染病学会已经把伏立康唑列为系统性曲霉病的首选药。卡泊芬净及米卡52 芬净对治疗许多曲霉感染和念珠菌感染有很好的疗效，还可以同两性霉素B或氟康唑等传统抗真菌药联合应用，而不会造成重复作用用药，且作用于真菌细胞壁对人体毒性小。一些抗菌效果好而毒副作用大或药物吸收途径单一的传统药物，也在积极地改进创新，例如脂质型两性霉素B不但将两性霉素B的强杀菌活性保持下来，还具有使真菌感染灶局部药物浓度高的性能，降低了两性霉素B的毒副作用，适用于全身性深部真菌感染，尤其是感染曲霉菌，是肾功能障碍患者的首选药。在联合应用抗真菌药物治疗方面，虽然有报道证实了系统性念珠菌和隐球菌感染使用联合治疗效果较单一用药好，但是缺乏药代动力学资料和临床系统性资料，联合治疗的药物组合形式、疗程、适应指征等都还有很多的不确定性，很多专家学者也对此表示争议，仍需要进一步深入研究。与目前临床上应用的抗真菌药物相比，中草药拥有其药源广、价格低、不良反应少、耐药情况少、能调节免疫功能并且可以对其他抗真菌药物产生增效作用等独特的优势。皂苷、蛋白质、萜类、酮类等中草药中的发挥[66]抗真菌作用的有效成分已经被分离和鉴定出来；研究发现五蓓子、七叶一枝花、大黄、知母、黄芩、黄莲6味中药对白色念珠菌和新生隐球菌表[67]现出了抑制作用；丁香的己烷提取物，广藿香的丙酮、己烷提取物，苦楝皮、土槿皮、辣椒的丙酮乙醇提取物都对白色念珠菌有很高的抑制活性[68]；实验证实补中益气汤能明显提高机体的抗体水平和细胞免疫功能，是[69]机体的有效免疫激活剂。在对海洋天然产物进行生物勘探后，发现了大量可用来生产抗真菌药物的资源，包括聚酮、大环类脂、生物碱和脂肪酸酯，其中大多数已处于临床前研究或早期临床的发展，有些药物已经上市，例如阿糖胞苷，有些[70]很快也将被批准上市，如ET743。新药发现过程中近几年兴起了“现有药物再利用”的思想，发现很多现有非抗真菌药物还具有抗真菌的活性，并将这些药物作为单一试剂或者作为辅助试剂与现有抗真菌药联合使用。例如将抗抑郁药sertraline与氟[71]康唑联合使用，可以降低由于氟康唑单一治疗引起的真菌性大脑负担；[72]抗肿瘤药物17-AAG能够显著地提高氟康唑的体外抗真菌活性。总之，治疗深部真菌感染应从病原真菌的种类、微生物学特性和药物效能，还要从患者的全身健康状况、用药依从性和经济方面全面综合考量，53 选择既高效、广谱，又低毒、廉价的合理治疗方案。7深部真菌感染的预防措施控制深部真菌感染的发病率和死亡率关键在于预防。患者往往存在机体免疫功能低下的高危因素，因此临床上需重视改善易感者的机体免疫状态，目前各种细胞因子及免疫激活剂包括粒细胞或巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素和胸腺肽等已应用于深部真菌感染的预防或辅助治疗中[73]。正在积极研制的各种疫苗也给深部真菌感染的预防带来了曙光，现阶[74]段有重组亚单位或表位疫苗、减毒或灭活的全菌疫苗、DNA疫苗等。另外，各科室住院患者应尽量缩短住院时间，正确合理应用广谱抗菌药物、激素或免疫抑制剂，尽量减少没有操作必要的侵入性检查或治疗，对长期放化疗患者或免疫功能缺陷的高危人群，可以适当给予抗真菌预防治疗措施。同时要注意加强个人及环境卫生，勤洗手，定时通风、消毒。8展望目前，深部真菌感染的耐药菌株日渐增多，深入研究真菌耐药机制将是以后亟待解决的难题之一。深部真菌感染的研究仍缺乏充分的流行病学调查资料，未来在真菌感染的预防监测、诊断检验和控制治疗方面都需要进一步的研究。54 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