卡路里限制对阿尔茨海默病转基因小鼠神经行为学及脑蛋白组的影响研究

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暨南大学硕士学位论文题名(中英对照)：卡路里限制对阿尔茨海默病转基因小鼠神经行为学及脑蛋白组的影响研究EffectsofCalorierestrictiononneuralbehaviorsandbrainproteomeintransgenicmicewithAlzheimer'sdisease作者姓名：何开武指导教师姓名：许华，杨细飞及学位、职称：博士研究员；博士研究员学科、专业名称：理学微生物与生化药学学位类型：学术学位论文提交日期：2017年4月18日论文答辩日期：2017年5月26日答辩委员会主席：雷毅雄教授论文评阅人：雷毅雄教授郑青研究员学位授予单位和日期：暨南大学年月日 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日学位论文作者毕业后去向：工作单位：电话：通讯地址：邮编： 暨南大学硕士学位论文摘要目的：阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）俗称老年痴呆症，是最为常见的一种神经退行性疾病。随着人口老龄化的到来，AD发病率呈急剧上升的趋势。卡路里限制属于饮食限制的一种，但它不会引起营养失调，在AD的众多干预措施中，卡路里限制正越来越显示出其在改善或减轻神经退行性变化方面的强大作用。本文旨在探究卡路里限制对AD转基因小鼠脑蛋白组的影响，进一步为AD的防治提供科学依据。方法：本文选用3月龄的三转基因AD（3xTg-AD）小鼠和野生型（WT）小鼠作为实验小鼠，以40%的卡路里限制（calorierestriction,CR）饮食处理其3个月，同时以随意采食（adlibitum,AL）的3xTg-AD小鼠和WT小鼠作为对照。首先，通过旷场实验、黑白箱实验和高架十字迷宫实验探究卡路里限制对3xTg-AD小鼠焦虑行为的影响；通过强迫游泳实验和悬尾实验探究卡路里限制对3xTg-AD小鼠抑郁行为的影响；通过水迷宫实验探究卡路里限制对3xTg-AD小鼠记忆行为的影响。随后，利用荧光差异凝胶电泳（2D-DIGE）结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MADLD-TOF-MS）技术研究卡路里限制对小鼠海马组织蛋白质组的影响。最后，利用Westernblot对差异蛋白进行验证。结果：行为学结果表明，卡路里限制改善了3xTg-AD小鼠的焦虑、抑郁和空间记忆损伤。蛋白质组学结果表明，在卡路里限制处理的WT小鼠和随意采食的WT小鼠中有11个差异蛋白的表达；在随意采食的3xTg-AD小鼠和随意采食的WT小鼠中有30个差异蛋白的表达；在卡路里限制处理的3xTg-AD小鼠和随意采食的3xTg-AD小鼠中有13个差异蛋白的表达。生物信息学分析显示，差异蛋白主要参与代谢、细胞凋亡、细胞间信号传导等进程，且有多个表达异常的蛋白已有研究报道与AD的发生发展密切相关，其中突触相关蛋白synapsin-2（SYN2）和伴侣分子14-3-3proteinepsilon（14-3-3E）经Westernblot验证与2D-DIGE结果一致。结论：综上结果表明，卡路里限制改善了3xTg-AD小鼠的焦虑、抑郁和空间记忆损伤，其中SYN2和14-3-3E等分子的表达改变可能在卡路里限制改善AD转基因小鼠行为学异常中发挥重要作用。关键词：阿尔茨海默病；卡路里限制；三转AD小鼠；荧光差异凝胶电泳I 暨南大学硕士学位论文ABSTRACTObjective:Alzheimer’sdisease(AD),alsotermeddementia,isoneofthemostcommonneurodegenerativedisease.Withtheagingofthepopulation,theonsetofADisdramaticallyincreased.Calorierestriction(CR)isakindofdietaryrestriction,butitdoesnotcausemalnutrition.InnumerousinterveningmeasuresofAD,CRshowsitsmultiplepowerfuladvantagesinimprovementofneurodegeneration.Thepurposeofthisstudyistoexploretheeffectsofcalorierestrictiononbehavioralabmormaltiesandbrainproteomein3xTg-ADmice.ThisstudywouldbeexpectedtoprovidescientificbasisforthepreventionandtreatmentofAD.Methods:Inthisstudy,weselectedthetripletransgenicAD(3xTg-AD)miceandwildtype(WT)miceastreatedgroupthatwereassignedtothedietaryregimenof40%CR,andthecontrolgroupweregiventothedietaryregimenofadlibitum(AL).Firstofall,theopenfieldtest,elevatedplus-mazetestandthelight/darkboxtestwereemployedtoevaluatetheeffectsofCRonanxietybehavior;theforcedswimmingtestandtailsuspensiontestwereemployedtoevaluatetheeffectsondepressionbehavior;andtheMorriswatermazewasemployedtoevaluatetheeffectsonmemoryimpairment.Then,weusedtwo-dimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis(2D-DIGE)coupledwithMALDL-TOF-MStoexploretheeffectsofCRonthehippocampalproteomeinthemice.Western-blotanalysiswasusedtovalidatethetheexpressionofsomedifferentialproteins.Results:BehavioraltestsshowedthatCRcouldalleviateanxiety,depressionandmemoryimpairmentof3xTg-ADmice.Proteomicsanalysisrevealedatotalof11differentiallyexpressedproteinsinhippocampusinWTmicewithorwithoutCRtreatment;atotalof30differentiallyexpressedproteinsin3xTg-ADmicecomparedwiththeWTmice;atotalof13differentiallyexpressedproteinsin3xTg-ADmicewithorwithoutCRtreatment.Bioinformaticsanalysisshowedthatthesedifferentiallyexpressedproteinswererelatedtometabolicprocess,apoptosisprocess,biologicalregulationandothers,andmultipleabnormalexpressedproteinsthatwerecloselyrelatedtothedevelopmentandprogressionofAD.Amongthesedifferentiallyexpressedproteins,synapse-associatedproteinsynapsin-2(SYN2)andmolecularchaperone14-3-3proteinII 暨南大学硕士学位论文epsilon(14-3-3E)wereverifiedbyWestern-blotanalysis.Conclusion:Taketogether,ourdatasuggestedthatCRcouldalleviateanxiety,depressionandmemoryimpairmentof3xTg-ADmice,andtheexpressionchangeofthemoleculessuchasSYN2and14-3-3EbyCRmaybeinvolvedintheneuroprotectiveprocessesofCR.Keywords:Alzheimer’sdisease;Calorierestriction;3xTg-ADmice;2D-DIGEIII 暨南大学硕士学位论文目录摘要..............................................................................................................................................IABSTRACT...............................................................................................................................II目录............................................................................................................................................V第一章前言...............................................................................................................................11.1阿尔茨海默病背景介绍..................................................................................................11.2AD的发病机制................................................................................................................11.3AD与卡路里限制............................................................................................................41.4蛋白质组学.....................................................................................................................61.5本课题的研究目的、意义与技术路线..........................................................................7第二章卡路里限制对三转基因AD小鼠焦虑、抑郁和记忆行为学影响的研究...............92.1引言..................................................................................................................................92.2实验材料..........................................................................................................................92.3实验方法........................................................................................................................102.4实验结果........................................................................................................................142.5讨论................................................................................................................................232.6本章小结........................................................................................................................24第三章卡路里限制对三转基因AD小鼠海马蛋白质组的影响.........................................253.1引言................................................................................................................................253.2实验材料........................................................................................................................253.3实验方法........................................................................................................................283.4结果................................................................................................................................343.5讨论................................................................................................................................513.6本章小结........................................................................................................................53第四章差异蛋白的进一步验证.............................................................................................544.1引言................................................................................................................................544.2实验材料........................................................................................................................544.3实验方法........................................................................................................................564.4结果................................................................................................................................594.5讨论................................................................................................................................614.6本章小结........................................................................................................................61第五章结论与展望.................................................................................................................625.1结论................................................................................................................................625.2展望................................................................................................................................63参考文献...................................................................................................................................64附录中英文缩略词表.............................................................................................................76攻读硕士学位期间取得的成果...............................................................................................77致谢.........................................................................................................................................78V 暨南大学硕士学位论文第一章前言1.1阿尔茨海默病背景介绍阿尔茨海默病（Alzheimer’sdisease,AD）是一种引起痴呆最为常见的神经退行性疾病，其临床表现为进行性的记忆减退，并伴随有认知功能的下降等。阿尔茨海默病一词来源于病理学家AloisAlzheimer，他在1906年对一病人的脑部检查发现其脑内存在大量的老年斑，并将这一特征性老年斑产生的疾病正式命名为AD[1]。其病理特征主要包括淀粉样蛋白聚集形成的老年斑、Tau蛋白高度磷酸化形成的神经纤维缠结（NFTs）、以及神经元丢失和突触功能紊乱[2-4]。该种疾病主要发生在老年群体中，特别是在65周岁以上的老年人中，根据患者发病年龄的不同可分为早老性痴呆和老年性痴呆，其中老年性痴呆患者占绝大部分[5]。随着老龄化步伐的加快，患AD病的人数急剧上升，给人类社会带来了巨大挑战，因而阿尔茨海默病又被称为“21世纪病”[6]。目前，全球AD患者的人数已超过3000万，预计到2050年，这一患病人数将增加至1.315亿人。而我国老龄化程度尤为突出，截止2016年，我国老年人口已突破两亿，其中痴呆患者人数已超千万，且女性患病率明显高于男性[7,8]。而且随着我国老龄人口的高速增长，这一患病人数将不断扩大。更为重要的是，由于这一疾病伴随着年龄的增长，患者会表现出明显的智力缺陷，治疗和护理都将面临巨大困难。因此，加快对AD病的研究，寻找可靠的治疗及预防策略具有非常重要的意义。1.2AD的发病机制目前，对于AD的发病机制尚无比较确切的定论，但经过几十年的研究，学者们一致认可的假说有以下几种。1.2.1淀粉样毒蛋白假说淀粉样毒蛋白沉积一度被认为是AD病的主要病理因素，这其中主要涉及Aβ1-42和Aβ[9]1-40在胞外沉积形成的老年斑。研究表明，淀粉样前体蛋白（Amyloidprecursorprotein，APP）跟AD病有着密切的关系。如图1.1所示，它在人体内会经历两种剪切过程，正1 暨南大学硕士学位论文常情况下，APP被α和γ分泌酶相继切割，产生一系列的可溶性短片段Aβ，一般不具有毒性作用；反之，病理状态下，APP首先被β分泌酶切割成sAPPβ，后经γ分泌酶切割成具有毒性形式的Aβ1-42和Aβ1-40，成熟的Aβ1-42和Aβ1-40不断在胞外累积，无法清除，最终形成老年斑，影响正常的脑部机能[10-12]。此外，研究发现，AD病人的脑内都有不同程度的淀粉样蛋白聚集。淀粉样毒蛋白假说正是建立在其沉积形式对人体的病理危害上的，目前，关于这一假说主要集中在以下几个方面：1)毒蛋白影响细胞功能。淀粉样毒蛋白对细胞功能的影响主要涉及到线粒体损伤，研究表明[13]，毒蛋白能够诱导机体产生大量的活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS），而活性氧的大量聚集会使细胞产生一种过氧化环境，使线粒体膜结构遭到破坏，进而影响线粒体的能量供应。此外，由于线粒体功能的损害，造成细胞内稳态的失衡，加速钙离子的内流，加重细胞损伤[14]。2)毒蛋白加重了Tau蛋白磷酸化的进程。有文献报道[15]，淀粉样毒蛋白的累积早发生于Tau蛋白磷酸化形成的神经纤维缠结，Aβ1-42的不断聚集破坏细胞结构，造成其功能的严重损害。Tau蛋白具有稳定细胞结构的作用，随着毒蛋白毒性作用的不断加强，加速了Tau蛋白的磷酸化进程，进一步的造成神经纤维缠结的形成。3)毒蛋白调控凋亡过程。研究发现，Aβ[16]1-42可能激活caspase-3的活性，触发凋亡过程。我们知道caspase-3通路的激活是细胞程序性死亡的主要途径，而神经元的存活对于脑部功能具有十分重要的作用，毒蛋白触发凋亡过程严重影响神经元的生理活性。图1.1淀粉样蛋白剪切过程Fig1.1Amyloidprecursorproteincleavageprocess2 暨南大学硕士学位论文1.2.2Tau蛋白磷酸化假说Tau蛋白是一种微管结合蛋白，其基因位于17号染色体上，可编码6种长短不一的Tau蛋白异构体，主要分布在神经细胞的轴突中[17,18]。其主要功能在于其与微管结合从而维持微管的稳定，保障细胞内物质转运的进行，同时还参与了神经元的信号转导[19]。当Tau蛋白过度磷酸化时，Tau蛋白会从微管脱离，从而聚集形成神经纤维缠结[20]。且过度磷酸化的Tau蛋白广泛存在于神经元胞体、异常轴突以及树突中，这些磷酸化的Tau蛋白会破坏这些部位的细胞骨架内微管系统的稳态，而Tau蛋白的异常磷酸化可能是因为细胞内磷酸化蛋白激酶和脱磷酸化的蛋白酶不平衡所造成的[21-23]。而愈来愈多的研究表明[24-26]，AD患者脑内Tau蛋白磷酸化水平较正常人偏高，提示AD病变与Tau蛋白的过度磷酸化有关。1.2.3基因异变假说阿尔兹海默病按病理原因主要分为家族性和散发性两种类型，其中散发性阿尔茨海默病占绝大多数[27]。最近的一些研究发现，14号染色体上的早老素PS1和PS2基因以及21号染色体上的APP基因是家族性阿尔兹海默病的主要致病基因[28-32]。而19号染色体上的APOE基因、CLU、CR1、PICALM基因则是与散发性AD高度相关的致病因子[33-36]。APP基因突变容易导致Aβ蛋白的分泌增多，而PS1、PS2基因突变则容易加剧Aβ的聚集而沉积，从而引发神经毒性作用[37-39]。载脂蛋白APOE与突触相关，存在于神经纤维缠结、老年斑、淀粉样病变中，具有运送磷脂和胆固醇的功能[40,41]。APOE基因突变导致载脂蛋白APOE的异常表达，从而引起Aβ的聚集，Tau蛋白过磷酸化以及损害胆碱酯能神经元[42-44]。1.2.4神经炎性假说近年来对AD发病机制的研究发现，慢性炎症反应参与并促进了AD的发生和发展。AD发生早期可激活小胶质细胞释放可降解Aβ的酶，通过清除蓄积的Aβ，发挥保护神经元的作用，同时激活的小胶质细胞还能分泌具有修复神经元功能的脑源性营养因子，从而控制AD的发病进程[45-47]。Aβ聚集沉积导致神经元损伤从而激活小胶质细胞，释放大量炎症细胞因子，进而使得更多的小胶质细胞参与局部炎症反应，加重神经元损伤，形成恶性循环[48]。这种恶性循环使得神经元损害和脑内功能紊乱加重，加重了AD的发病进程。3 暨南大学硕士学位论文1.2.5胰岛素信号通路假说胰岛素是一种胰岛B细胞分泌的蛋白质，不仅对血糖的调节具有重要作用，同时还广泛存在于中枢神经系统，对脑部功能具有十分重要的作用。研究发现[49]，海马区存在大量的胰岛素受体，具有调节组织利用血糖的能力，对认知功能起着调控作用。虽然这一调控的机制不清楚，但是研究结果提示海马组织内胰岛素水平的高低与AD存在着密切的关系。另外，有文献报道[50,51]，胰岛素含量的变化可能改变微管相关蛋白的表达，这提示胰岛素可能参与AD的Tau病理过程。值得一提的是，在对AD合并糖尿病人的研究发现，在患者远端胰腺组织中研究者发现有淀粉样毒蛋白的存在，这就暗示了糖尿病跟AD存在着某种关联[52]。因而，我们推测胰岛素对于AD的发生发展一定起着某种作用。1.2.6血管因素假说来自解剖学的数据显示[53]，大多数AD患者脑内存在血管组织的结构性改变，由此说明血管因素在AD中有着重要作用。临床研究表明[54-56]，脑梗死、脑卒中和再生障碍性贫血等血管因素会使AD患者脑内新生血管生成能力降低、脑血流灌注减少、脑血管组织中内皮细胞的功能减退及内皮依赖的受损，造成血脑屏障功能的异常。而血脑屏障功能的缺失可能使APP、APOE等基因表达上调，最终使淀粉样毒蛋白含量增高，对细胞产生毒害作用[57,58]。另外，当血脑屏障受到损伤时，血管壁上的Aβ清除受体和Aβ结合受体的表达会下降，使大脑内的Aβ调控出现紊乱，造成机体本身对Aβ毒蛋白清除的减少，加重AD病理的发展[59,60]。综上所述，AD的发病机制主要涉及到淀粉样毒蛋白的毒性作用、Tau蛋白磷酸化、基因突变、神经炎性、胰岛素、以及血管因素等，它们之间可能单独起作用，也可能相互交织，关于AD病因的具体机制有待进一步的研究。1.3AD与卡路里限制卡路里限制（CalorieRestriction,CR）这一概念是由美国康奈尔大学MarryCrowell等[61]人在1934年首次提出的，它作为饮食限制的一种方式，在不引起营养失调的前提下，能够减少机体对总能量的摄入，降低机体的基础代谢率，从而抵御多种疾病的发生发展。而AD作为一种衰老相关疾病，其中衰老因素是其主要的风险因素，这就意味着4 暨南大学硕士学位论文延缓衰老将一定程度的减少AD的发生[62]。研究报道指出[63-65]，卡路里限制能够减缓多种生物体的衰老过程并延长寿命，如秀丽隐杆线虫、果蝇、大小鼠，甚至到灵长类的恒河猴，提示卡路里限制在衰老过程中起着重要作用。最近的研究表明，卡路里限制不仅对健康的老年人有改善记忆的作用，而且对AD也能起到保护作用，适度减少卡路里的摄入将有助于预防或减缓AD的发生发展[66-68]。其中，在对哺乳动物的研究中发现[69]，30%~40%的卡路里限制有利于提高大脑内的神经发生，并且明显减少了老年动物由于衰老而引起的神经发生的下调，这些数据提示卡路里限制作为一种环境干预措施能显著影响大脑的功能。AD是一种不可逆的神经退行性疾病，其发病机制尚不明确，学者普遍认为主要与胞外淀粉样斑块沉积和胞内Tau蛋白高度磷酸化形成的神经纤维缠结有关。在对一种名为Tg2576的AD模型鼠的研究发现，卡路里限制能够显著减少Aβ的沉积、以及降低Psenen和PS1基因的表达，使脑内淀粉样前体蛋白（APP）偏向非淀粉样过程进行[68]。然而，Brownlow等[67]的研究表明，与对照组相比，卡路里限制处理组的Tg4510小鼠虽然在条件恐惧和水迷宫实验中表现出明显的记忆改善，但是病理学和生化检测未发现总Tau或磷酸化Tau水平的显著变化。总体说来，卡路里限制主要影响AD的Aβ病理，对AD的Tau病理影响不明显。卡路里限制对AD的神经保护作用可能还涉及到脑内BDNF水平的改变。BDNF是一种神经营养因子，对神经元的存活起着重要的作用。卡路里限制能够增加脑内BDNF的表达，诱导其定位在海马区[70,71]。此外，卡路里限制也能够通过上调神经发生相关基因的表达和下调星型胶质激活依赖的炎性相关基因的表达来对AD产生神经保护作用，例如，卡路里限制能够降低促凋亡因子的活性和增加神经营养因子的水平[67,72,73]。值得注意的是，AD患者的内嗅皮层、海马、血清和脑脊液中已被多次报道有BDNF水平的下降[74,75]。BDNF通过和p75神经营养因子受体的相互作用参与到转录水平的调控，如NF-B和c-JunN末端激酶-p53-Bax，以及通过激活酪氨酸激酶B参与到胞内信号级联反应的激活，如Ras/MAPK和PI3K/Akt。这就允许BDNF参与到脑内众多的功能，从而为增强神经发生、调节轴突和树突生长，参与神经递质释放奠定基础[76,77]。除了改善记忆和学习外，BDNF也能保护大脑免遭代谢和氧化损伤[78,79]。5 暨南大学硕士学位论文同时，卡路里限制也参与到SIRT1的调控，它是保守的Sirtuin家族烟酰胺腺苷二核苷酸依赖性脱乙酰酶的成员之一，其在海马中表达，对小鼠的正常学习、记忆和突触可塑性是不可或缺的[80]。体内体外实验表明，SIRT1与神经保护密切相关，它能促进非淀粉样过程的进行[81,82]。卡路里限制能够增加SIRT1的表达，而SIRT1则能通过去乙酰化应激反应因子如p53、NF-B和FOXO蛋白来调控抗逆性和增强细胞存活[83]。此外，SIRT1通过下调NF-B的信号能阻止小胶质依赖的Aβ毒性[81]。总体说来，在调控AD的过程中，卡路里限制是一种保护性的饮食策略。它对AD的影响也是多方面的，主要涉及到神经发生、Aβ病理、神经营养因子、以及SIRT1蛋白的调控。但是其对AD的作用机制仍然未被阐明，进一步的研究有待继续。1.4蛋白质组学蛋白质组学这一概念是由Wilkins首次提出[84]，它是一门大规模、高通量、系统化地研究某一类型细胞、组织或体液中的所有蛋白质组成及其功能的新兴学科。虽然基因决定蛋白质的水平，但是基因表达的水平并不能代表细胞内活性蛋白的水平，蛋白质组学分析是对蛋白质翻译和修饰水平等研究的一种补充，是全面了解基因组表达的一种必不可少的手段。蛋白质组学相关技术的发展极大地推动了蛋白质组学的研究进展，使其在各研究领域得到了广泛的应用。荧光差异凝胶电泳（two-dimensionalfluorescencedifferencegelelectrophoresis,2D-DIGE）[85]主要应用蛋白质的等电点和分子量的差异来分离蛋白质混合物，同时应用荧光染料的灵敏度，使蛋白质定量更加准确。荧光染料Cy2、Cy3和Cy5能与蛋白质的赖氨酸侧链氨基反应而使蛋白质被标记，其中Cy2作为内标。被标记蛋白质的等电点和分子量几乎不受影响，等量标记好的蛋白质进行双向电泳，蛋白表达量的变化则通过Cy3和Cy5的不同荧光强度来体现。相比传统2-DE技术，其优势在与：重复性好、动态范围宽、染色时间短、蛋白质定量更加准确、荧光标记与后期质谱分析兼容。6 暨南大学硕士学位论文图1.22D-DIGE技术流程图Fig1.2Technicalflowchartof2D-DIGE1.5本课题的研究目的、意义与技术路线阿尔茨海默病是一种衰老相关的神经退行性疾病，起病隐袭，病程漫长。随着老龄化步伐的加快，我国患该病的人数正在急剧上升，给社会和家庭带来了沉重的负担。而目前对于阿尔茨海默病暂无有效的治疗药物，因此对AD的预防和干预就显得尤为重要。卡路里限制作为一种有效的AD干预措施，它能够改善学习和记忆、对抗淀粉样蛋白沉积产生的毒性反应、增加神经发生、提高神经营养因子水平等作用，在AD的病理发生发展过程中起着较好的改善作用。然而，卡路里限制的这种保护作用的相关机制尚不清楚。因此本研究着重从行为学和蛋白质组水平探究卡路里限制对AD保护作用可能的潜在机制。7 暨南大学硕士学位论文本研究拟达到以下目的：1)运用行为学的方法，探究卡路里限制对正常小鼠和AD小鼠行为学的影响，具体包括焦虑、抑郁和记忆行为；2)应用2D-DIGE技术分析卡路里限制处理前后小鼠脑内特别是海马区蛋白表达的差异，经过比对，筛选出与AD病理高度相关的蛋白。3)应用串联质谱分析的方法，确定上述相关蛋白的的分类和定位。4)采用Westernblot技术进一步验证差异蛋白在卡路里限制对AD影响的蛋白表达情况。本研究的技术路线图如下：8 暨南大学硕士学位论文第二章卡路里限制对三转基因AD小鼠焦虑、抑郁和记忆行为学影响的研究2.1引言本研究中，我们选用3月龄的三转基因AD（3xTg-AD）小鼠作为试验对象，以具有相同遗传背景的野生型（wildtype，WT）小鼠作为对照。同时以卡路里限制饮食为处理方式，处理时间为3个月，以未处理的3xTg-AD小鼠和WT小鼠作为对照。本章采用旷场实验、高架十字迷宫实验和黑白箱实验探究卡路里限制对3xTg-AD小鼠焦虑行为的影响，采用悬尾实验和强迫游泳实验探究卡路里限制对3xTg-AD小鼠抑郁行为的影响，采用水迷宫实验探究卡路里限制对3xTg-AD小鼠记忆行为的影响。2.2实验材料2.2.1实验动物及分组本实验选取WT小鼠（品系；B6129SF2/J）作为对照组，3xTg-AD小鼠作为AD模型鼠，野生鼠与三转基因AD小鼠的遗传背景是完全相同的。其中3Tg-AD小鼠携带有三个人源的AD相关基因：PS1M146V，APPSwe和TauP301L[58]，该种小鼠现已被广泛应用于AD的相关研究。实验用鼠均购自美国Jackson实验室。在本研究中，我们选取3月龄WT小鼠和3xTg-AD小鼠作为试验动物。共设立四个组别：WT小鼠随意采食组（WT-AL）、WT小鼠卡路里限制饮食组（WT-CR）、3xTg-AD小鼠随意采食组（3xTg-AL）及3xTg-AD小鼠卡路里限制饮食组（3xTg-CR），每组小鼠15只。WT-AL组小鼠和3xTg-AL组小鼠均给予正常饮食，WT-CR组小鼠和3xTg-CR组小鼠均给予40%的卡路里限制饮食，处理时间持续3个月。2.2.2实验试剂SPF级鼠料（广东省医学实验动物中心，中国）9 暨南大学硕士学位论文2.2.3主要仪器及设备名称生产厂家电子天平Sartorius,德国旷场实验装置淮北正华生物仪器设备有限公司高架十字迷宫实验装置淮北正华生物仪器设备有限公司黑白箱实验装置淮北正华生物仪器设备有限公司悬尾实验装置淮北正华生物仪器设备有限公司强迫游泳实验装置淮北正华生物仪器设备有限公司Morris水迷宫实验装置淮北正华生物仪器设备有限公司USB采集卡淮北正华生物仪器设备有限公司图像自动采集软件上海欣软信息科技公司软件分析系统上海欣软信息科技公司2.2.4主要试剂配制无2.3实验方法2.3.1卡路里限制处理方案本实验选取3月龄的小鼠进行正式实验，分为四组（WT-AL,WT-CR,3xTg-AL,3xTg-CR），每组15只。卡路里限制处理参照Halagappa等研究者的方法[86]，具体来讲就是，进行卡路里限制的前一周，测量两组随意采食组小鼠的周平均摄食量，并以此为依据对下一周处理组小鼠进行卡路里限制，使其处理组的周平均食物消耗量是对应对照组的60%。在卡路里限制处理的三个月内，仔细监测四组小鼠的周平均摄食量和周平均体重。其中小鼠的周平均摄食量根据每周测定三天，每天一次，每次间隔一天来确定，周平均体重根据连续测定三天，每天一次来确定。2.3.2旷场实验旷场实验（OFT），也称敞箱实验，用以评价实验动物在空旷环境中的自主探索行为及其紧张情况的一种焦虑行为。该实验历史悠久，是1934年由Hall等研究者发明。10 暨南大学硕士学位论文其原理基于动物有畏惧空旷场地的天性，其活动具有趋避性；而另一方面，面对新事物又会产生好奇心去探究新场所。旷场实验是用于评价动物自发活动以及焦虑状态的经典行为学实验。实验方法参照文献[87]，具体实验步骤如下：1)提前2小时将待检测小鼠转移到动物行为检测实验室，让小鼠提前适应行为检测室的环境，为了避免小鼠相互间的影响建议单只每笼。实验时必须时刻保持周边环境安静；2)提前将电脑系统内的图像采集程序设置好，包括阈值和时间的设置，将旷场主要分为四周区和中央区两大区域，完成后将小鼠轻轻放入旷场实验箱正中央，并进行计时和摄像；3)实验对小鼠进行的检测时间为5min，软件在检测期内会自动跟踪识别并记录小鼠在各区域内的停留时间和路程，系统停止摄像后实验结束，将小鼠小心的放回小鼠的笼内；4)每检测完一只老鼠，便需要用没有气味的液体擦洗上一只小鼠留下的气味。2.3.3高架十字迷宫实验高架十字迷宫（EMP）探究小鼠的焦虑行为是根据因为小鼠喜欢探究新鲜环境，但是却害怕悬于高空的敞开臂，容易形成小鼠内心的矛盾冲突行为来检测的。高架十字迷宫由中央区、两个开臂和两个闭臂组成。啮齿动物喜欢黑暗的环境喜欢在闭臂中活动，但是由于天生好奇性又喜欢在开臂中活动，在面对新异刺激时，小鼠产生恐惧与冲动，这就造成了小鼠的矛盾心理，从而产生焦虑心理。实验方法参照文献[88]，具体实验步骤如下：1)提前2小时将待检测小鼠转移到动物行为检测实验室，让小鼠提前适应行为检测室的环境，为了避免小鼠相互间的影响建议单只每笼。实验时必须时刻保持周边环境绝对安静；2)提前将电脑系统内的图像采集程序设置好，包括阈值和时间的设置，十字迷宫可用不同颜色的多边形划分为中央区、闭臂区以及开臂区，设置完毕后可将小鼠放入高架十字迷宫的中央区，头朝向闭臂，同时进行计时和摄像；3)实验对小鼠进行的检测时间为5min，软件在检测期内会自动跟踪识别并记录小鼠在各区域内的停留时间和路程，系统停止摄像后实验结束，将小鼠小心的放11 暨南大学硕士学位论文回小鼠的笼内；4)每检测完一只老鼠，便需要用没有气味的液体擦洗上一只小鼠留下的气味。2.3.4黑白箱实验黑白箱又称明暗箱（DLB），啮齿类动物天生喜欢黑暗环境，对明亮环境具有天然的厌恶和好奇倾向。因而，本实验主要是利用动物的趋暗特性和探索特性来研究动物的焦虑行为的。实验具体方法参照文献[88]，具体实验步骤如下：1)提前2小时将待检测小鼠转移到动物行为检测实验室，让小鼠提前适应行为检测室的环境，为了避免小鼠相互间的影响建议单只每笼。实验时必须时刻保持周边环境绝对安静；2)设置图像自动采集软件的追踪条件，将黑白箱分为白箱和黑箱，黑白箱之间的挡板拿开使小鼠可以自由穿梭。完成后轻轻将小鼠放入黑白箱的黑箱中央，同时进行计时和摄像；3)观察时间为5min，期间软件自动记录小鼠在黑箱和白箱分别停留的时间、路程、两箱的穿梭次数，以及总路程。时间到后停止摄像，轻轻将小鼠抓回饲养笼；4)在进行下一只动物前，先用清洗剂清洗黑白箱内壁及底面除去上一只动物残留的气味。2.3.5悬尾实验悬尾实验（TST）是将实验动物通过固定动物尾部使其头向下悬挂，动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而提供了一个无可回避的压迫环境，一段时间的实验后，动物表现出“不动状态”，即“行为绝望状态”。实验方法参照文献[89]，具体实验步骤如下：1)提前2小时将待检测小鼠转移到动物行为检测实验室，让小鼠提前适应行为检测室的环境，为了避免小鼠相互间的影响建议单只每笼。实验时必须时刻保持周边环境绝对安静；2)提前将电脑系统内的图像采集程序设置好，包括阈值和时间的设置，系统自动默认速度低于20mm/s时记录不动时长。设置完毕后用胶布将小鼠尾巴缠住悬挂在固定的悬杆上，小鼠尾巴朝上头部朝下；12 暨南大学硕士学位论文3)实验对小鼠进行的检测时间为7min，前2min不记录数据，软件在检测期内会自动跟踪识别并记录小鼠在各区域内的停留时间和路程，系统停止摄像后实验结束，将小鼠小心的放回小鼠的笼内。2.3.6强迫游泳实验强迫游泳实验（FST）是利用小鼠不喜水的特性，通过将实验动物置于一个局限的环境中，动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而提供了一个无可回避的压迫环境，一段时间的实验后，动物即表现出典型的“不动状态”，通过对小鼠在水中停止挣扎的无助程度时间来判断小鼠的抑郁程度。实验方法参照文献[90]，具体实验步骤如下：1)实验开始前一天将实验小鼠转移到行为学实验室，让小鼠熟悉实验环境，并让每只小鼠单独一笼避免相互影响。实验全程在安静的环境下进行，水温保持在25℃；2)设置图像自动采集软件的追踪条件，将小鼠保持漂浮所需的最小运动外的肢体静止，即速度小于20mm/s视为静止。完成后将小鼠头向上轻轻放入强迫游泳器材水面，同时进行计时和摄像；3)观察时间为记录6min内的等2-6min，期间软件自动记录小鼠发生静止状态的次数和时间。时间到后停止摄像，轻轻将小鼠拿出，擦干后放回饲养笼；4)在进行下一只动物前，滤去残留的小鼠粪便，必要时可更换设备中的水。2.3.7水迷宫实验水迷宫实验（MWM）是一种用以评价动物学习记忆能力的实验，广泛应用于神经科学的研究中。实验主要分为两个阶段，即定位航行阶段和空间探索阶段。实验方法参照文献[91]，具体实验步骤如下：定位航行阶段：1)水迷宫的整个区域被均匀分为四个等大的扇形区域，平台被放在目标象限的正中间，平台训练期间搁置在固定位置；2)开始进行训练时，使小鼠面向水迷宫的外围，随机取平台象限外的另外三个象限内分四个不同入水点放置小鼠入水。记录1min，若小鼠在1min内找到平台，记录找到平台所需的时间；若小鼠1min内未找到平台，则引导小鼠找到平台，并13 暨南大学硕士学位论文使其在平台上停留15s；3)小鼠连续训练5天，每天从四个入水点依次训练1min，小鼠爬上平台后于干燥地方休息15s后开始下一象限的训练，每次均需要手动将小鼠的上平台时间登记在EXCEL表。空间探索阶段：前期实验结束后让小鼠休息整整一周后，再对小鼠进行空间探索实验。将之前水迷宫中的平台移除，将小鼠从第一象限（即东北中间）放入，观察2min内小鼠在水迷宫中的活动情况，软件自动识别并记录小鼠在目标象限内的活动时间、活动路程、穿越平台区的次数及进入平台区的时间。2.3.8统计分析本研究所有数据使用SPSS20.0软件结合GraphPadPrism7.0进行统计处理，两组数据间比较采用One-wayANOVA进行检验。结果表示为Mean±SEM，p<0.05认为数据间的差异具有统计学意义。*为与WT-AL相比p<0.05，**为与WT-AL相比p<0.01，#为与3xTg-AL相比p<0.05，##为与3xTg-AL相比p<0.01。2.4实验结果2.4.1卡路里限制对3xTg-AD小鼠摄食量和体重的影响为了研究卡路里限制对3xTg-AD小鼠摄食量和体重的影响，我们对WT小鼠和3xTg-AD小鼠分别作40%卡路里限制饮食处理，观察经处理后WT-AL、WT-CR、3xTg-AL及3xTg-CR四组小鼠摄食量和体重变化。如图2.1A所示，与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AL组小鼠摄食量无明显变化。同时，与3xTg-AL组小鼠相比，3xTg-CR组小鼠摄食量显著降低。如图2.1B所示，经卡路里限制饮食处理后，WT-CR组小鼠和3xTg-CR组小鼠体重均明显小于对应的对照组小鼠。综上结果表明，卡路里限制处理对WT小鼠和3xTg-AD小鼠摄食量和体重均具有明显减少的作用。14 暨南大学硕士学位论文图2.1卡路里限制对3xTg-AD小鼠摄食量和体重的影响，结果表示为平均值±标准误，每组10-14只小鼠Fig2.1TheeffectsofCRonfoodintakeandbodyweightof3xTg-ADmice,dataexpressedasmean±SEM,n=10~14foreachgroup2.4.2卡路里限制对3xTg-AD小鼠焦虑行为的影响为了研究卡路里限制对3xTg-AD小鼠焦虑行为学的影响，我们对小鼠进行了旷场实验、高架十字迷宫实验及黑白箱实验以检测焦虑。2.4.2.1旷场实验结果旷场实验是评价小鼠焦虑行为的经典实验之一，小鼠在中央区活动时间百分比越低，表明小鼠越焦虑。如图2.2A所示，四组小鼠在旷场中活动的总路程无统计学差异，说明各组小鼠在陆地环境上的运动能力未受损，运动状态良好。如图2.2B所示，与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AL组小鼠在中央区的活动时间百分比显著下降（p<0.01），说明3xTg-AD小鼠存在焦虑行为。然而，3xTg-AD小鼠经CR处理后其在中央区的活动时间百分比有明显上升的趋势，说明CR处理能一定程度的改善3xTg-AD小鼠的焦虑行为。15 暨南大学硕士学位论文图2.2旷场实验中卡路里限制对3xTg-AD小鼠焦虑行为的影响。（A）总路程，（B）中央区时间百分比，结果表示为平均值±标准误，每组10~14只小鼠。Fig2.2TheeffectsofCRonanxiety-likebehaviorof3xTg-ADmiceintheopenfieldtest.(A)Totaldistancetraveled,(B)Thepercentageoftimeincenter,dataexpressedasmean±SEM,n=10~14foreachgroup.2.4.2.2高架十字迷宫实验结果高架十字迷宫实验是评价小鼠焦虑行为的经典实验之一，小鼠在开臂的活动时间或进入开臂的次数越少，表明小鼠越焦虑。与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AL组小鼠进入开臂的次数显著减少（p<0.05）（图2.3B），在开臂的活动时间百分比和进入开臂次数占进入开臂闭臂次数之和百分比呈现降低的趋势（图2.3A,2.3D）。然而，3xTg-AD小鼠经CR处理后，发现3xTg-CR组小鼠在开臂的活动时间百分比和进入开臂次数均显著上升（p<0.05）（图2.3A-B），而进入开臂次数占进入开臂闭臂次数之和百分比则进一步显著升高（p<0.01）（图2.3D）。另外，如图2.3C所示，与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AL组小鼠进入闭臂的次数有上升的趋势，而CR处理能一定程度地降低3xTg-AD小鼠进入闭臂的次数。综上结果表明，CR处理能改善3xTg-AD小鼠的焦虑行为。16 暨南大学硕士学位论文图2.3高架十字迷宫实验中卡路里限制对3xTg-AD小鼠焦虑行为的影响。（A）进入开臂的时间百分比，（B）进入开臂的次数，（C）进入闭臂的次数，（D）进入开臂次数占进入开臂闭臂次数之和百分比，结果表示为平均值±标准误，每组10~14只小鼠。Fig2.3TheeffectsofCRonanxiety-likebehaviorof3xTg-ADmiceintheelevatedplusmazetest.(A)Thepercentageoftimeintheopenarms,(B)Thenumberofentriesintoopenarms,(C)Thenumberofentriesintoclosedarms,(D)Thenumberofentriesintoopenarms/numberofentriesintotheopenplusclosedarms,dataexpressedasmean±SEM,n=10~14foreachgroup.2.4.2.3黑白箱实验结果黑白箱实验是评价小鼠焦虑行为的经典实验之一，小鼠进入白箱的次数越少或在白箱的活动时间越短，焦虑越严重。与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AL组小鼠第一次进入白箱的潜伏期显著降低（p<0.01）（图2.4A），进入白箱的时间和穿梭于黑白箱间的次数呈现下降的趋势（图2.4B-C）。与3xTg-AL组小鼠相比，3xTg-CR组小鼠进入白箱的时间（p<0.01）（图2.4B）和穿梭于黑白箱间的次数（p<0.05）（图2.4D）均显著升高。17 暨南大学硕士学位论文这些结果提示CR能够减轻3xTg-AD小鼠的焦虑行为。图2.4黑白箱实验中卡路里限制对3xTg-AD小鼠焦虑行为的影响。（A）第一次进入白箱的潜伏期，（B）进入白箱的时间，（C）穿梭于黑白箱间的次数，结果表示为平均值±标准误，每组10~14只小鼠。Fig2.4TheeffectsofCRonanxiety-likebehaviorof3xTg-ADmiceinthelight/darkboxtest.(A)Latency,(B)Thepercentageoftimeinthelightbox,(C)Thenumberoflightboxentries,dataexpressedasmean±SEM,n=10~14foreachgroup.2.4.3卡路里限制对3xTg-AD小鼠抑郁行为的影响为了研究卡路里限制对3xTg-AD小鼠抑郁行为的影响，我们对小鼠做了悬尾实验和强迫游泳实验以检测抑郁。2.4.3.1悬尾实验结果悬尾实验通过评价小鼠在悬尾状态下不动时间的长短来判断小鼠的抑郁程度，不动时间越长，小鼠越抑郁。如图2.5A所示，与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AL组小鼠具有明显较长的不动时间（p<0.05），说明3xTg-AD小鼠存在抑郁行为。CR处理之后，3xTg-AD小鼠的不动时间显著下降（p<0.01），提示CR处理改善了3xTg-AD小鼠的抑郁行为。18 暨南大学硕士学位论文图2.5悬尾实验中卡路里限制对3xTg-AD小鼠抑郁行为的影响。（A）不动时间，结果表示为平均值±标准误，每组10~14只小鼠。Fig2.5TheeffectsofCRondepression-likebehaviorof3xTg-ADmiceinthetailsuspensiontest.(A)Thepercentageofimmobilitytime,dataexpressedasmean±SEM,n=10~14foreachgroup.2.4.3.2强迫游泳实验结果强迫游泳实验通过小鼠在强迫游泳装置中小鼠不动时间的长短来判断小鼠的抑郁成程度，不动时间越长，小鼠越抑郁。如图2.6A所示，与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AL组小鼠在强迫游泳装置中的不动时间显著升高（p<0.05），说明3xTg-AD小鼠具有抑郁症状。与3xTg-AL组小鼠相比，3xTg-CR组小鼠的不动时间明显下降（p<0.05），提示CR处理能够减轻3xTg-AD小鼠的抑郁行为。图2.6强迫游泳实验中卡路里限制对3xTg-AD小鼠抑郁行为的影响。（A）不动时间，19 暨南大学硕士学位论文结果表示为平均值±标准误，每组10~14只小鼠。Fig2.6TheeffectsofCRondepression-likebehaviorof3xTg-ADmiceintheforcedswimtest.(A)Thepercentageofimmobilitytime,dataexpressedasmean±SEM,n=10~14foreachgroup.2.4.4卡路里限制对3xTg-AD小鼠记忆行为的影响为了研究卡路里限制对3xTg-AD小鼠学习能力和记忆能力的影响，我们对四组小鼠进行了水迷宫实验。在定位航行阶段，选用逃避潜伏期作为观测指标，即小鼠第一次找到平台的时间。在空间探索阶段，选用小鼠在水迷宫中穿越平台的次数、探索平台的时间、在目标象限的活动时间百分比及活动路程百分比作为特征性指标。2.4.4.1卡路里限制对3xTg-AD小鼠学习能力的影响如图2.7A所示，小鼠随着训练天数的增加，其找到平台的时间越来越短。相比较而言，WT-AL组小鼠找到平台所需的时间最短，3xTg-AL组小鼠找到平台所需的时间最长，3xTg-CR组居中，但各组间无统计学差异。这些数据说明3xTg-AD小鼠的学习能力较差，CR处理能够一定程度地改善3xTg-AD小鼠的学习能力。图2.7卡路里限制对3xTg-AD小鼠学习能力的影响。（A）逃避潜伏期，结果表示为平均值±标准误，每组10~14只小鼠。Fig2.7TheeffectsofCRonspatiallearningof3xTg-ADmice.(A)Latency,dataexpressedasmean±SEM,n=10~14foreachgroup.2.4.4.2卡路里限制对3xTg-AD小鼠记忆能力的影响水迷宫实验的空间探索阶段，移出平台后，通过记录小鼠的穿越平台次数、探索平20 暨南大学硕士学位论文台时间及在目标象限的活动路程百分比或活动时间百分比来衡量小鼠的记忆能力。穿越平台区的次数指在空间探索阶段小鼠穿越平台区的次数，穿越平台区的次数越多，表明记忆能力越好。探索平台的时间是指小鼠从入水后第一次到达原平台所在区域花费的时间，探索时间越短，表明小鼠记忆能力越好。小鼠对目标象限的偏好性通常用目标象限的活动路程百分比或活动时间百分比来评价。小鼠对目标象限偏好性越强，则反映小鼠的记忆能力越好。如图2.8A小鼠运动轨迹图所示，与WT-AL组小鼠相比，WT-CR组小鼠在目标象限（第三象限）运动最为集中，3xTg-AL组小鼠在目标象限运动最不集中。与3xTg-AL组相比，3xTg-CR组小鼠在目标象限较为集中。如图2.8B-C所示，四组小鼠在水迷宫中的运动总路程和平均速率均无统计学差异，说明小鼠在水环境下的运动能力良好。从穿越平台的次数和探索平台的时间可以看出，3xTg-AL组相较于WT-AL组小鼠，穿越平台区的次数显著减少（图2.8D），探索平台的时间极剧增加（图2.8E），提示3xTg-AL组小鼠存在记忆损伤。经CR处理之后，3xTg-AL组小鼠在这两项指标上均发生了显著性的逆转（图2.8D-E）。如图2.8F-G所示，与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AL组小鼠在目标象限的活动路程百分比和活动时间百分比均显著下降（p<0.05）。与3xTg-AL组小鼠相比，3xTg-CR组小鼠在目标象限的活动路程百分比（p<0.01）和活动时间百分比（p<0.05）均显著升高。综上所述，水迷宫实验证实3xTg-AD小鼠存在记忆损伤，而卡路里限制能够明显改善这种损伤。21 暨南大学硕士学位论文图2.8卡路里限制对3xTg-AD小鼠记忆能力的影响。（A）运动轨迹图，（B）总路程，（C）平均速率，（D）穿越平台区的次数，（E）探索平台的时间，（F）目标象限活动路程百分比，（G）目标象限活动路程百分比，（H）目标象限活动时间百分比，结果表示为平均值±标准误，每组10~14只小鼠。Fig2.8TheeffectsofCRonspatialmemoryof3xTg-ADmice.(A)Therepresentativeswimmingpath,(B)Totaldistancetraveled,(C)Averagespeed,(D)Crossingnumber,(E)Probetime,(F)Percentageofdistancetraveledinthecorrectquadrant,(G)Percentageofdistancetraveledinthecorrectquadrant,(H)Percentageoftimespentinthecorrectquadrant,dataexpressedasmean±SEM,n=10~14foreachgroup.22 暨南大学硕士学位论文2.5讨论阿尔茨海默病不同于正常衰老，它具有明显的行为缺陷和认知障碍[92]。AD转基因模型鼠作为一种值得推荐的研究工具，它能够用来了解AD的潜在发病机制和致病病因。在本研究中，我们选用3xTg-AD小鼠作为实验模型鼠。该模型鼠被同时转入了三个人源的痴呆相关基因，即APPSWE、PS1M146V和TauP301L，而且它是迄今为止唯一种能完全表现Aβ病理、Tau病理和突触紊乱特征的模型[3]。3xTg-AD小鼠展现了明显的年龄依赖性发作的神经病理学，Aβ和Tau都表现出年龄和区域的依赖性，且Aβ病理出现早于Tau病理[93]。具体来讲就是，小鼠2月龄时，海马区出现Aβ的免疫反应，突触功能紊乱[93]；4月龄时，出现认知功能障碍，胞内Aβ开始累积，主要集中在海马CA1区、皮层和杏仁核[94,95]；6月龄时，出现胞外Aβ的累积[94]；12月龄时，可见明显的胞外Aβ斑块和Tau蛋白的免疫反应[96]；18月龄时，出现明显的神经纤维缠结[97]。除了病理变化之外，3xTg-AD小鼠还具有明显的记忆损伤和焦虑抑郁症状[98]。流行病学数据显示[99]，AD病人在中晚期常伴随有焦虑抑郁症状的出现，严重影响患者的生活质量。焦虑抑郁作为神经精神症状的一种，其病灶部位主要累及海马、杏仁核[100]。目前，关于卡路里限制对焦虑抑郁的研究主要集中在非AD模型鼠上。Kneny等[101]研究发现温和的卡路里限制对雄性大鼠具有抗焦虑的作用，而这种作用的机制有别于下丘脑-垂体-肾上腺通路。Zhang等[102]研究指出短时的卡路里限制可能诱导抑郁症病人产生一种抗抑郁的作用，其潜在分子机制可能涉及到多种病理生化过程，包括促食素信号激活、上调CREB磷酸化水平以及促内啡肽和酮的释放。在本研究中，我们首次采用3xTg-AD小鼠来探究卡路里限制对焦虑抑郁的影响，结果发现行为学实验（如旷场实验、高架十字迷宫实验、黑白箱实验、悬尾实验和强迫游泳实验）一致证实卡路里限制能有效的改善3xTg-AD小鼠的焦虑抑郁行为。有文献研究表明[67]，在对一种名为Tg4510的AD模型鼠的研究发现，35%的卡路里限制能明显改善AD模型鼠的记忆能力，但对该种小鼠的Tau病理无明显影响。此外，FoxO3a是一种胰岛素受体（IR）/胰岛素样生长因子1信号通路的关键调控因子，它的失活与AD的Aβ病理有着密切的关系，Qin等研究发现卡路里限制介导了胰岛素信号通路的激活，导致FoxO3a转录因子过度磷酸化而失活，进而对Tg2576小鼠的空间记忆起23 暨南大学硕士学位论文到保护作用[80]。而且FoxO3a也能介导SIRT1的调控，影响衰老过程，从而对AD起到延缓发生的作用[80]。结合本研究水迷宫的实验结果，发现卡路里限制显著减轻了3xTg-AD小鼠的记忆损伤，再次验证了卡路里限制对AD记忆的保护作用。综上所述，行为学实验证实卡路里限制能明显改善3xTg-AD小鼠的焦虑抑郁及记忆损伤。然而，这种保护作用的潜在分子机制不明。因此，接下来我们将对AD小鼠的海马组织进行蛋白质组学研究，以期找到起作用的关键分子，为阐明其分子机制奠定基础。2.6本章小结本章通过卡路里限制处理WT小鼠和3xTg-AD小鼠，发现卡路里限制处理均能下调相应小鼠的摄食量和体重。然后对卡路里限制处理三个月后的小鼠进行焦虑、抑郁和记忆行为学检测，发现卡路里限制处理能改善3xTg-AD小鼠的焦虑、抑郁和记忆损伤。24 暨南大学硕士学位论文第三章卡路里限制对三转基因AD小鼠海马蛋白质组的影响3.1引言AD是一种引起痴呆的最常见的神经退行性疾病，其起病隐袭，病程缓慢。其病理特征主要包括胞外Aβ累积形成的老年斑、胞内Tau蛋白高度磷酸化形成的神经纤维缠结，以及神经元和突触的丢失。患者常表现出认知障碍，并伴随着焦虑抑郁症状，严重影响个人和家庭的生活。随着我国老龄化步伐的加快，AD患者的数量急剧上升。然而，对于AD的治疗至今仍缺乏有效的药物治疗。因此，寻找可能的干预措施将是一种很好的思路。研究报道发现[86,103]，卡路里限制对AD具有神经保护作用，它能够降低由Aβ累积造成的细胞毒性反应，改善AD模型鼠的认知功能，提高记忆能力。此外，卡路里限制对焦虑抑郁的影响也被广泛研究，学者发现卡路里限制能一定程度的减轻大小鼠的神经精神症状，如焦虑和抑郁行为。由此可见，卡路里限制对脑部功能的调节起着非常积极的作用，但是卡路里限制对AD小鼠海马蛋白质组学的研究鲜有报道。综合上一章行为学的结果，我们发现卡路里限制能有效的改善三转AD小鼠的焦虑、抑郁和记忆损伤行为。因此，本章着重从蛋白质组学层面来分析卡路里限制对小鼠海马蛋白质组学的影响，进而在分子层面上探究这种保护作用可能的潜在机制。3.2实验材料3.2.1主要化学试剂名称及试剂盒试剂名称生产厂家PBS海克利思，中国2-DQuantKitGEHealthcare,美国IMMOBILINEDryStripPH3-11NL,24cmGEHealthcare,美国硫脲（Thiourea）GEHealthcare,美国25 暨南大学硕士学位论文尿素（Urea）GEHealthcare,美国Tris-HCl,pH8.8海克利思，中国CHAPSGEHealthcare,美国IPGBufferGEHealthcare,美国二硫苏糖醇（DTT）GEHealthcare,美国碘乙酰胺（IAA）GEHealthcare,美国溴酚蓝Sigma,美国甘油（87%W/W）GEHealthcare,美国十二烷基硫酸钠（SDS）Sigma,美国Tris-碱上海生工生物，中国Tris-Gly-SDS电泳缓冲液海克利思，中国琼脂糖Sigma,美国过硫酸铵（AP）Bio-RAD,美国四甲基乙二胺（TEMED）北京中生瑞泰科技有限公司，中国30%聚丙烯酰胺单体储液Bio-RAD,美国考马斯亮蓝G-250Bio-RAD,美国矿物油GEHealthcare,美国pH精密试纸Sigma,美国2D-DIGE荧光染料试剂盒（5nmol）GEHealthcare,美国异丙醇广州化学试剂厂，中国L-赖氨酸Sigma,美国二甲基甲酰胺（DMF）Sigma,美国碳酸氢铵（NH4HCO3）Sigma,美国乙腈（ACN）Sigma,美国胰酶Promega,美国三氟乙酸（TFA）Sigma,美国CHCABruker,德国26 暨南大学硕士学位论文3.2.2主要仪器及设备名称生产厂家制冰机三洋，日本电子天平Sartorius,德国BIOCOL超纯水系统装置Millipore,美国低温冰箱海尔，中国超声破碎仪Fisher,美国台式高速冷冻离心机Eppendorf,德国多功能酶标仪Bio-RAD,美国一向等电聚焦电泳仪GEHealthcare,美国二向SDS-PAGE电泳仪Bio-RAD,美国Typhoon多通道扫描仪GEHealthcare,美国MALDL-TOF-MSABSCIEX,美国恒温培养箱INFORS,瑞士高压灭菌锅HIRAYAMA，日本3.2.3主要试剂配制1)1X裂解液：用电子天平分别精确称取3.04g硫脲，8.4g尿素，0.8gCHAPS，加少量超纯水混匀，加入1.0mL1.5MTris-HCl，然后加超纯水定容至20mL。分装成每管1mL，保存于-20℃冰箱备用。2)2X裂解液：用电子天平分别精确称取1.52g硫脲，4.2g尿素，0.4gCHAPS，0.2gDTT，加少量超纯水混匀，加入0.2mLIPGBuffer，然后加超纯水定容至10mL。分装成每管1mL，用锡箔纸避光，保存于-20℃冰箱备用。3)1%溴酚蓝储备液：用电子天平分别精确称取100mg溴酚蓝，60mgTris-碱，加超纯水定容至10mL。4)水化液：精确称取4.8g尿素，0.2gCHAPS，28mgDTT，加少量超纯水混匀，加入20μL1%溴酚蓝储备液和50μLIPGBuffer，加超纯水定容至10mL。分装成每管1mL，用锡箔纸避光，保存于-20℃冰箱备用。27 暨南大学硕士学位论文5)SDS平衡缓冲液：精确称取尿素216.3g，SDS12.0g，量取并加入30mL1.5MTris-HCl(pH8.8)，207mL87%甘油，1.2mL1%溴酚蓝储备液，用超纯水定容至600mL。分装成每管30mL，保存于-20℃冰箱备用。使用前加入DTT（150mg/15mL平衡缓冲液）或IAA（375mg/15mL平衡缓冲液）。6)琼脂糖封胶液：精确称取琼脂糖0.1g，1%溴酚蓝储备液40µL，20mLSDS电泳缓冲液，水浴加热，待琼脂糖完全溶解后，保存于室温备用。7)考马斯亮蓝染色液：精确称取考马斯亮蓝G-2501.2g，硫酸铵100g，无水乙醇200mL，搅拌混匀，待固体基本溶解，加10%（w/w）磷酸100mL，然后加超纯水定容至500mL，长期保存于棕色瓶。8)脱色液：精确称取0.0395g碳酸氢铵，量取并加入10mL100%乙腈，加超纯水定容至20mL。3.3实验方法3.3.1小鼠海马组织样品分离分离WT-AL组、WT-CR组、3xTg-AL组及3xTg-CR组四组小鼠的海马组织：1)颈椎脱臼，处死小鼠2)用剪刀剪下小鼠脑袋，开颅小心取出完整的鼠脑3)将小鼠大脑放于低温环境下，沿着大脑中线切一刀，然后剥离大脑皮层，随后可见一月牙形的白色组织即为海马，用镊子剥离出该组织，且左右半脑的海马分开放置4)将海马组织放入置于冰上的EP管中并迅速转移到液氮罐中，把全部小鼠海马取出后，立即将所有海马组织转移至-80ºC冰箱保存。3.3.2蛋白提取及定量小鼠海马组织蛋白提取：1)准确称量待实验小鼠海马的重量，并做好相应标记；2)用事先预冷的已灭过菌的1XPBS清洗海马组织，以去除组织上的明显血渍，然后用滤纸吸干组织上的PBS溶液，以免盐离子影响后面的IEF；3)向每管组织中加入600μL的1X裂解液；4)超声2min，直至样品溶液全部变澄清（Pulson4s，off6s，注意不能产生气泡；28 暨南大学硕士学位论文5)冰上裂解30min；6)20000g4℃离心60min，上清液即为蛋白；7)超滤：原液分二次进行超滤，离心14000g离心20min；8)除盐：先超滤的滤管中加入200μL的1X裂解液，14000g离心20min，重复2次，最后一次离心60min，终体积约为100μL；9)1000g，2min收集样品，分装出30μL蛋白定量。小鼠海马组织蛋白定量：1)实验前准备：预先配制colorreagent（colorreagentA:colorreagentB=100:1），每管需1mL，多配制1mL；2)使用2mg/mLBSA制作标准曲线，准备6个EP管，Tube1做空白对照；3)制备含1μL、2μL、4μL的待测蛋白到EP管中（每个样品3个重复，蛋白的有效范围在0.5μg~50μg）；TubeNumber123456BSA0μL5μL10μL15μL20μL25μLProteinquantity0μg10μg20μg30μg40μg50μg4)向每管加入500μL的沉淀液Preciptant，简短涡旋混匀，室温孵育2~3min；5)向每管加入500μL的共沉淀液Co-Preciptant，涡旋混匀；6)最小以10000g离心5min，沉淀即为蛋白；7)快速将离心管取出，能看到白色沉淀，轻轻倒掉上清液；8)将离心管放入离心机中，与（6）方向一致，位置一定要相同，离心结束后，用移液枪吸走可见的上清液；9)向每管加入100μL的Coppersolution和400μL的去离子水，简短涡旋，溶解蛋白；10)向每管加入1mL显色液，加入后迅速涡旋混匀；11)室温孵育15~20min；12)使用酶标仪检测480nm处的吸光度，从（9）到（12）步应控制在40min以内。3.3.3组织样品2D-DIGE荧光标记1)样品前处理：选用1X裂解液将定完量的蛋白样品稀释成5μg/μL，调节pH到8.5左右；29 暨南大学硕士学位论文2)CyDye染料的配制：将Cy2、Cy3、Cy5染料管离心后各加入5μL的DMF溶解配制成成储存液，根据实验所需跑胶条的量，将按储存液：DMF=1:4配制成工作液；3)混合内标蛋白：将所有稀释到5μg/μL的待测蛋白样品各取5μL配制成内标液，作为2D-DIGE的内标蛋白用，用涡旋仪震荡混匀；4)样品标记：根据实验设计（表3.1），向5µL的样品管中加入1µLCy5或Cy3染料工作液。往混合蛋白的内标管（25µL）中加5µL的Cy2荧光染料工作液，避光条件下，在冰上孵育30min。向每个样品管中加入1µL10mML-lysine，向内标管中加入5µL10mML-lysine用于终止标记，震荡混匀后离心，避光条件下于冰上孵育10min。表3.12D-DIGE表格设计Table3.1Formdesignof2D-DIGE2X裂解液水化液组别Cy2(µL)Cy3(µL)Cy5(µL)(µL)(µL)Gel01内标（5）WT-AL(5)WT-CR(5)100335Gel02内标（5）WT-CR(5)WT-AL(5)100335Gel03内标（5）WT-AL(5)3xTg-AL(5)100335Gel04内标（5）3xTg-AL(5)WT-AL(5)100335Gel05内标（5）WT-AL(5)3xTg-CR(5)100335Gel06内标（5）3xTg-CR(5)WT-AL(5)100335Gel07内标（5）WT-CR(5)3xTg-AL(5)100335Gel08内标（5）3xTg-AL(5)WT-CR(5)100335Gel09内标（5）WT-CR(5)3xTg-CR(5)100335Gel10内标（5）3xTg-CR(5)WT-CR(5)100335Gel11内标（5）3xTg-AL(5)3xTg-CR(5)100335Gel12内标（5）3xTg-CR(5)3xTg-AL(5)1003353.3.4等电聚焦1)提前洗净聚焦槽，自然晾干；2)取一新的1.5mLEP管，向管中加入100µL的2X裂解液，335µL的水化液。然后加30 暨南大学硕士学位论文入两组用Cy3和Cy5标记好的蛋白样品以及内标样品，混匀；3)从冰箱中取出pH3-11的IPG胶条，室温平衡15min；4)用镊子撕掉IPG胶条上的保护膜，分清其正反方向，将胶条胶面接触聚焦槽中蛋白溶液，确保胶条的负极对应于聚焦槽底端。随后加1.5mL矿物油覆盖IPG胶条背面，盖上外盖；5)调平聚焦仪，用以下程序进行等电聚焦：表3.2等电聚焦程序Table3.1StepsofIEF步骤电压（V）时间（h）Step15018Step23002Step35002Step410002Step580008Step680008Step750010当总电压达到100000V以上即可停止聚焦，聚焦完成后可立即进行聚丙烯酰胺电泳或是-80℃冰箱中保存。3.3.5聚丙烯酰胺凝胶电泳1)配胶：提前洗干净玻璃板和制胶器具，晾干待用。根据步骤安装好制胶架，配制12.5%的凝胶溶液，具体配方如下表。用锥形瓶配制SDS-PAGE胶，待溶液混匀后，向制胶架中缓慢灌胶，距板面1cm左右停止灌胶。每块胶用1.5mL异丙醇压线，1h后用保鲜膜包住制胶器，室温静置过夜；31 暨南大学硕士学位论文表3.3SDS-PAGE胶配方Table3.1ThecomponentsofSDS-PAGEgel溶液2块胶体积（mL）4块胶体积（mL）6块胶体积（mL）30%聚丙烯酰胺溶液502002501.5mMTris-HCl2510012510%SDS14510%AP0.522.5TEMED0.040.160.2超纯水23.4694117.5终体积1004005002)胶条平衡：待等电聚焦仪电压累积升至100000V以上，取出跑好的IPG胶条（若IPG胶条保存于-80ºC冰箱中，则先在室温恢复10min），将其放入加有DTT的15mL平衡液的平衡管中，避光，室温摇床上平衡15min。一次平衡结束后，将IPG胶条放入加有IAA的15mL平衡液的平衡管中再次平衡；3)提前打开水循环系统，水温设置为12℃，随即配制4L新鲜的1XTris-Gly-SDS电泳缓冲液加入到电泳槽中；4)拆开制胶器，取出二向胶，并用超纯水冲洗，观察胶是否良好，若有气泡，则不使用。选取合格的胶并向胶顶加入1.5mL的琼脂糖封胶液，等待上IPG胶条；5)将平衡好的IPG胶条用1XTris-Gly-SDS电泳缓冲液冲洗几次，随后将IPG胶条放到二向胶的上面，胶条的背面贴在长玻璃板上，用卡片把IPG胶条弄到紧紧贴着凝胶，中间不能有气泡；6)安装好垂直电泳槽后，往内槽加入2XTris-Gly-SDS电泳缓冲液，外槽加入1XTris-Gly-SDS，保证两液面持平，盖上盖子，用布套住电泳槽避光。设置电泳条件，先以1W每块胶跑1h，然后以11W每块胶跑4.5h，直至蓝色到达胶底。3.3.6荧光图像分析使用Typhoon扫描仪对跑好的二向胶进行扫描，进行图像的采集，Cy2、Cy3及Cy5的激光扫描波长分别为488nm、532nm、633nm。用DeCyder6.5软件进行凝胶内与凝胶间的分析比较，找出差异点，P<0.05的点进行下一步分析。32 暨南大学硕士学位论文3.3.7考马斯亮蓝染色普通2DE的实验方法与2D-DIGE差不多相同，不同的是普通2DE的实验方法不需要进行荧光标记，因此也无需避光处理。从实验组或者对照组的蛋白样品中各取1.2mg蛋白进行制备胶双向电泳，再将蛋白分子质量Marker放在胶条的酸性端外侧，然后进行第一向等电聚焦以及第二向SDS-PAGE电泳，普通双向完成后取出凝胶玻璃板，冲洗后，拆开玻璃板，将跑过的胶于0.1%考马斯亮蓝染液染色中在摇床上轻摇染色过夜。倒掉染色液，再用去离子水清洗至蛋白点清晰可见为止。3.3.8挖胶及酶解1)根据2D-DIGE筛选出的差异蛋白点的位置，手动进行挖胶；2)提前将EP管编好号，随后加入500µL超纯水，将挖出的蛋白放入相应的EP管，涡旋后吸干超纯水；3)加200µL脱色液用于脱色，37ºC超声脱色30min。直至胶料由蓝色变成无色，吸干脱色液；4)加200µL浓度为100%乙腈用于脱水，待胶粒由透明变成白色后，将乙腈吸干，打开管盖，使乙腈自然挥发干；5)往EP管中加3µL浓度为0.01µg/µL的胰酶，将胰酶加到白色胶粒上，使胶粒和胰酶充分接触。随后于4ºC冰箱中孵育30min，加12µL浓度为25mM的NH4HCO3，37ºC恒温过夜。3.3.9质谱鉴定1)将质谱钢靶于甲醇中超声清洗干净之后用超纯水和质谱级丙酮冲洗后自然晾干；2)分别吸取1μL蛋白标准品及酶解后的蛋白样品于质谱钢靶上；3)待待测样品及标准品于室温下自然晾干后，再吸取1µL基质液覆盖于在样品点及标准品点的上方，自然晾干；4)上质谱仪器进行一级二级质谱鉴定；5)在鉴定结束之后，使用MASCOT软件对UniProtMusmusculus数据库进行蛋白搜索。3.3.10差异蛋白功能分析使用生物信息学软件PANTHER(http://www.pantherdb.org/)和STRING(http://string-db.org/)在线对蛋白进行功能分析。33 暨南大学硕士学位论文3.4结果3.4.13xTg-AD小鼠海马蛋白质组学分析3xTg-AD小鼠作为一种可靠的被广泛使用的AD动物模型，为了研究其海马蛋白质组的变化，我们分别提取3xTg-AL组小鼠和WT-AL组小鼠的海马蛋白，借助比较蛋白质组学技术，筛选、鉴定差异表达的蛋白，同时对这些蛋白进行功能富集分析和相互作用分析，以此在蛋白质组学水平上揭示其AD发生发展的潜在分子。3.4.1.13xTg-AL组小鼠与WT-AL组小鼠海马差异表达蛋白取3xTg-AL组小鼠和WT-AL组小鼠海马各6只，提取蛋白并对其进行CyDye荧光染料标记。标记好的蛋白依次进行第一向等电聚焦和第二向SDS-PAGE凝胶电泳，根据蛋白的等电点和分子量的不同分离海马蛋白，接着对跑好的二向胶板进行Typhoon扫描，设定好仪器相应参数，采集Cy2、Cy3、Cy5三种信号。最后使用Decyder软件分析荧光图谱，筛选差异蛋白点。选取p≤0.05的蛋白点进行质谱鉴定。与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AL组小鼠海马组织中有30个差异表达的蛋白（图3.1），其中有14个蛋白表达上调，16个蛋白表达下调。如表3.4所示，我们按照蛋白名、质谱评分值、分子量、改变倍率（ratio）及p值（p-value）列出如下差异表达的蛋白。具体包括上调蛋白有血清转铁蛋白（Serotransferrin,TRFE）、tRNA剪接连接酶RtcB同源物（tRNA-splicingligaseRtcBhomolog,RTCB）、丙酮酸脱氢酶复合物的二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶复合物（Dihydrolipoyllysine-residueacetyltransferasecomponentofpyruvatedehydrogenasecomplex,mitochondrial,ODP2）、突触囊泡回收蛋白-A1（Endophilin-A1,A2ALV3）、囊泡融合ATP酶（Vesicle-fusingATPase,NSF）、热休克蛋白-60（60kDaheatshockprotein,mitochondrial,CH60）、乳糖基谷胱甘肽裂解酶（Lactoylglutathionelyase,LGUL）、丝切蛋白-1（Cofilin-1,COF1）、α-互联蛋白（Alpha-internexin,AINX）、突触体相关蛋白25（Synaptosomal-associatedprotein25,SNP25）、电子转移黄素蛋白亚基α（Electrontransferflavoproteinsubunitalpha,mitochondrial,ETFA）、3-巯基丙酮酸转移酶（3-mercaptopyruvatesulfurtransferase,THTM）、α-晶状蛋白B链（Alpha-crystallinBchain,CRYAB）、蛋白-L-异天冬氨酸O-甲基转移酶（Protein-L-isoaspartate34 暨南大学硕士学位论文O-methyltransferase,E0CYV0）。下调蛋白有Complexin蛋白1（Complexin-1,CPLX1）、硫代吗啉羧酸脱氢酶（Thiomorpholine-carboxylatedehydrogenase,CRYM）、ATP合酶亚基γ（ATPsynthasesubunitgamma,mitochondrial,ATPG）、网格蛋白轻链B（ClathrinlightchainB,CLCB）、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基β-5（Guaninenucleotide-bindingproteinsubunitbeta-5,GBB5）、三磷酸异构酶（Triosephosphateisomerase,TPIS）、二氢嘧啶酶相关蛋白5（Dihydropyrimidinase-relatedprotein5,DPYL5）、肌酸激酶U型（CreatinekinaseU-type,mitochondrial,KCRU）、泛素羧基末端水解酶同工酶L1（Ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozymeL1,UCHL1）、谷胱甘肽S-转移酶Mu1（GlutathioneS-transferaseMu1,GSTM1）、γ-烯醇酶（Gamma-enolase,ENOG）、谷氨酰胺合成酶（Glutaminesynthetase,GLNA）、天冬氨酸转氨酶（Aspartateaminotransferase,cytoplasmic,AATC）、转录激活蛋白Pur-α（TranscriptionalactivatorproteinPur-alpha,PURA）、丝氨酸-tRNA连接酶（Serine--tRNAligase,cytoplasmic,SYSC）、肽基脯氨酰顺反异构酶A（Peptidyl-prolylcis-transisomeraseA,PPIA）。35 暨南大学硕士学位论文图3.1未处理的3xTg-AD小鼠与未处理的WT小鼠海马组织蛋白2D-DIGE代表图。（A）Cy5标记的3xTg-AL组小鼠海马组织蛋白荧光图；（B）Cy3标记的WT-AL小鼠海马组织蛋白荧光图；（C）Cy2标记的内标混合蛋白荧光图；（D）合并图；（E）3xTg-AL组小鼠与WT-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白的分布图Fig3.1Arepresentative2D-DIGEgelimageofhippocampalproteinsof3xTg-ALmicecomparedtoWTmice.(A)Cy5-labledhippocampalproteinsof3xTg-ALmice;(B)Cy3-labledhippocampalproteinsofWT-ALmice;(C)Cy2-labledhippocampalproteinsasinternalstandards;(D)ThemergedimageincludingCy2-,Cy3-andCy5-labledproteins;(E)Thedistributionofdifferentiallyexpressedhippocampalproteinsin3xTg-ALmicecomparedtoWT-ALmice.36 暨南大学硕士学位论文表3.43xTg-AL组小鼠与WT-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白Table3.4Differentiallyexpressedhippocampalproteinsin3xTg-ALmicecomparedtoWT-ALmice37 暨南大学硕士学位论文3.4.1.23xTg-AL组小鼠与WT-AL组小鼠海马差异表达蛋白的功能富集分析借助Panther软件在线分析3xTg-AL组小鼠和WT-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白，按生物过程、分子功能、细胞组分及蛋白通路对差异表达蛋白进行功能富集分析（图3.2）。结果显示代谢过程（35%）、细胞过程（27.5%）、细胞成分组织化或生物发生（12.5%）等生物过程有较好的富集（图3.2A）；催化活性（61.9%）、结合作用（28.6%）、结构性分子活性（9.5%）等分子功能有较好的富集（图3.2B）；细胞部件（43.8%）、细胞器（25%）、大分子复合物（18.8%）等细胞组分有较好的富集（图3.2C）；糖酵解（3.2%）、突触小泡运输（3.2%）、促甲状腺激素释放激素受体信号通路（3.2%）、代谢型谷氨酸受体II组途径（3.2%）、催产素受体介导的信号通路（3.2%）等蛋白通路有较好的富集（图3.2D）38 暨南大学硕士学位论文图3.23xTg-AL组小鼠与WT-AL组小鼠海马差异表达蛋白的功能分类。（A）生物过程富集分析；（B）分子功能富集分析；（C）细胞组分富集分析；（D）蛋白通路富集分析Fig3.2Functionalclassificationsofdifferentiallyexpressedhippocampalproteinsbetween3xTg-ALmiceandWT-ALmice.(A)Enrichmentanalysisofbiologicalprocess;(B)Enrichmentanalysisofmolecularfunction;(C)Enrichmentanalysisofcellularcomponent;(D)Enrichmentanalysisofpathway39 暨南大学硕士学位论文3.4.1.33xTg-AL组小鼠与WT-AL组小鼠海马差异表达蛋白的相互作用分析为了研究3xTg-AL组小鼠和WT-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白间的相互作用，我们对已鉴定出的30个蛋白进行String分析（图3.3）。结果显示，ENOG（Eno2）与9个差异表达蛋白间存在着相互作用，CH60（Hspd1）和ETFA（Etfa）与4个差异表达蛋白间存在着相互作用，AATC（Got1）、ODP2（Dlat）和ATPG（Atp5c1）与3个差异表达蛋白间存在相互作用。提示这些蛋白可能在AD的发病过程中起着重要作用。另外，结合文献查阅，我们发现CPLX1、COF1和SNP25参与到AD记忆损伤的调控。图3.33xTg-AL组小鼠和WT-AL组小鼠海马差异表达蛋白的相互作用Fig3.3Protein-proteininteractionsofdifferentiallyexpressedhippocampalproteinin3xTg-ALmicecomparedtoWT-ALmice40 暨南大学硕士学位论文3.4.2卡路里限制处理对3xTg-AD小鼠海马蛋白质组的影响为了研究卡路里限制对3xTg-AD小鼠海马蛋白质组学的影响，我们使用2D-DIGE技术筛选经卡路里限制处理后3xTg-AD小鼠海马差异表达的蛋白，并利用质谱分析对这些差异表达的蛋白进行鉴定。3.4.2.1卡路里限制处理引起3xTg-AD小鼠海马差异表达的蛋白与3xTg-AL组小鼠相比，卡路里限制处理共引起了3xTg-AD小鼠13个差异蛋白的表达（图3.4），其中有4个蛋白表达上调，9个蛋白表达下调。质谱鉴定结果按蛋白名、质谱评分值、分子量、改变倍率（ratio）及p值（p-value）列出如下差异表达的蛋白（表3.5）。具体来说，上调蛋白包括突触蛋白2（Synapsin-2,SYN2）、二氢胆脂酰脱氢酶（Dihydrolipoyldehydrogenase,mitochondrial,DLDH）、前mRNA加工因子19（Pre-mRNA-processingfactor19,J3QNL8）、26S蛋白酶调节亚基8（26Sproteaseregulatorysubunit8,PRS8）。下调蛋白包括碳酸酐酶2（Carbonicanhydrase2,CAH2）、二氢嘧啶酶相关蛋白3（Dihydropyrimidinase-relatedprotein3,DPYL3）、原肌球蛋白α-1链（Tropomyosinalpha-1chain,TPM1）、线粒体内膜蛋白（Mitochondrialinnermembraneprotein,IMMT）、α-烯醇酶（Alpha-enolase,ENOA）、硫氧还蛋白依赖性过氧化物还原酶（Thioredoxin-dependentperoxidereductase,mitochondrial,PRDX3）、14-3-3蛋白（ε14-3-3proteinepsilon,1433E）、神经丝光多肽（Neurofilamentlightpolypeptide,NFL）、星形胶质细胞蛋白PEA-15（AstrocyticphosphoproteinPEA-15,PEA15）。41 暨南大学硕士学位论文图3.4卡路里限制处理的3xTg-AD小鼠与未处理的3xTg-AD小鼠海马组织蛋白2D-DIGE代表图。（A）Cy5标记的3xTg-CR组小鼠海马组织蛋白荧光图；（B）Cy3标记的3xTg-AL小鼠海马组织蛋白荧光图；（C）Cy2标记的内标混合蛋白荧光图；（D）合并图；（E）3xTg-CR组小鼠与3xTg-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白的分布图Fig3.4Arepresentative2D-DIGEgelimageofhippocampalproteinsof3xTg-ALmicecomparedtoWTmice.(A)Cy5-labledhippocampalproteinsof3xTg-ALmice;(B)Cy3-labledhippocampalproteinsofWT-ALmice;(C)Cy2-labledhippocampalproteinsasinternalstandards;(D)ThemergedimageincludingCy2-,Cy3-andCy5-labledproteins;(E)Thedistributionofdifferentiallyexpressedhippocampalproteinsin3xTg-ALmicecomparedtoWT-ALmice.42 暨南大学硕士学位论文表3.53xTg-AL组小鼠与WT-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白Table3.5Differentiallyexpressedhippocampalproteinsin3xTg-ALmicecomparedtoWT-ALmice3.4.2.2卡路里限制处理对3xTg-AD小鼠海马差异表达蛋白的功能富集分析借助Panther软件在线分析3xTg-CR组小鼠和3xTgAL组小鼠海马组织差异表达蛋白，按生物过程、分子功能、细胞组分及蛋白通路对差异表达蛋白进行功能富集分析（图3.5）。结果显示细胞过程（30.8%）、代谢过程（30.8%）、细胞成分组织化或生物发生（23.1%）等生物过程有较好的富集（图3.5A）；催化活性（60%）、结构性分子活性（20%）、抗氧化活性（10%）等分子功能有较好的富集（图3.5B）；细胞部件（50%）、细胞器（33.3%）、大分子复合物（16.7%）等细胞组分有较好的富集（图3.5C）；糖酵解（11.1%）、突触小泡运输（11.1%）、EGF受体信号通路（11.1%）、FGF信号通路（11.1%）等蛋白通路有较好的富集（图3.5D）43 暨南大学硕士学位论文图3.53xTg-CR组小鼠与3xTg-AL组小鼠海马差异表达蛋白的功能分类。（A）生物过程富集分析；（B）分子功能富集分析；（C）细胞组分富集分析；（D）蛋白通路富集分析Fig3.5Functionalclassificationsofdifferentiallyexpressedhippocampalproteinsbetween3xTg-CRmiceand3xTg-ALmice.(A)Enrichmentanalysisofbiologicalprocess;(B)Enrichmentanalysisofmolecularfunction;(C)Enrichmentanalysisofcellularcomponent;(D)Enrichmentanalysisofpathway44 暨南大学硕士学位论文3.4.2.3卡路里限制处理对3xTg-AD小鼠海马差异表达蛋白的相互作用分析为了研究3xTg-CR组小鼠和3xTg-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白间的相互作用，我们对已鉴定出的13个蛋白进行String分析（图3.6）。结果显示，DLDH（Dld）与3个差异表达蛋白存在着相互作用，ENOA（Eno1）、PRDX3（Prdx3）、PRS8（Psmc5）和J3QNL8（Prpf19）与2个差异表达蛋白间存在着相互作用，提示这些蛋白可能参与到卡路里限制处理改善AD的作用。另外，经文献查阅，SYN2、ENOA和1433E对AD的病理发展起着重要的作用，提示这几个分子可能参与到卡路里限制的神经保护作用。图3.63xTg-CR组小鼠和3xTg-AL组小鼠海马差异表达蛋白的相互作用Fig3.6Protein-proteininteractionsofdifferentiallyexpressedhippocampalproteinin3xTg-ALmicecomparedto3xTg-ALmice45 暨南大学硕士学位论文3.4.3卡路里限制处理对WT小鼠海马蛋白质组的影响为了探究卡路里限制对野生型小鼠海马蛋白质组学的影响，我们使用2D-DIGE联合质谱技术，筛选、鉴定WT-CR组小鼠和WT-AL组小鼠差异表达的蛋白。3.4.3.1卡路里限制处理引起WT小鼠海马差异表达的蛋白与WT-AL组小鼠相比，卡路里限制处理共引起了WT小鼠11个差异蛋白的表达（图3.7），其中有5个蛋白表达上调，6个蛋白表达下调。质谱鉴定结果按蛋白名、质谱评分值、分子量、改变倍率（ratio）及p值（p-value）列出如下差异表达的蛋白（表3.6）。具体来说，上调蛋白包括异柠檬酸脱氢酶[NAD]亚基α（Isocitratedehydrogenase[NAD]subunitalpha,mitochondrial,IDH3A）、热休克蛋白HSP90-beta（HeatshockproteinHSP90-beta,HS90B）、肌动蛋白结合蛋白3（Transgelin-3,TAGL3）、α-烯醇酶片段（Alpha-enolase(Fragment),B0QZL1）、腺苷酸激酶同工酶5（Adenylatekinaseisoenzyme5,KAD5）。下调蛋白包括电压依赖性阴离子选择通道蛋白1（Voltage-dependentanion-selectivechannelprotein1,VDAC1）、异质核核糖核蛋白A2/B1（HeterogeneousnuclearribonucleoproteinsA2/B1,ROA2）、肽基脯氨酰顺反异构酶D（Peptidyl-prolylcis-transisomeraseD,PPID）、磷酸甘油酸变位酶1（Phosphoglyceratemutase1,PGAM1）、T-复合蛋白1亚基γ（T-complexprotein1subunitgamma,TCPG）、果糖二磷酸醛缩酶C（Fructose-bisphosphatealdolaseC,ALDOC）。46 暨南大学硕士学位论文图3.7卡路里限制处理的WT小鼠与未处理的WT小鼠海马组织蛋白2D-DIGE代表图。（A）Cy5标记的WT-CR组小鼠海马组织蛋白荧光图；（B）Cy3标记的WT-AL小鼠海马组织蛋白荧光图；（C）Cy2标记的内标混合蛋白荧光图；（D）合并图；（E）WT-CR组小鼠与WT-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白的分布图Fig3.7Arepresentative2D-DIGEgelimageofhippocampalproteinsofWT-CRmicecomparedtoWT-ALmice.(A)Cy5-labledhippocampalproteinsofWT-CRmice;(B)Cy3-labledhippocampalproteinsofWT-ALmice;(C)Cy2-labledhippocampalproteinsasinternalstandards;(D)ThemergedimageincludingCy2-,Cy3-andCy5-labledproteins;(E)ThedistributionofdifferentiallyexpressedhippocampalproteinsinWT-CRmicecomparedtoWT-ALmice47 暨南大学硕士学位论文表3.6WT-CR组小鼠与WT-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白Table3.6DifferentiallyexpressedhippocampalproteinsinWT-CRmicecomparedtoWT-ALmice3.4.3.2卡路里限制处理对WT组小鼠海马差异表达蛋白的功能富集分析借助Panther软件在线分析WT-CR组小鼠和WT-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白，按生物过程、分子功能、细胞组分及蛋白通路对差异表达蛋白进行功能富集分析（图3.8）。结果显示代谢过程（50%）、细胞过程（16.7%）、应激过程（8.3%）等生物过程有较好的富集（图3.8A）；催化活性（57.1%）、结构性分子活性（14.3%）、转运活性（14.3%）、结合活性（14.3%）等分子功能有较好的富集（图3.8B）；细胞部件（66.7%）、细胞器（33.3%）等细胞组分有较好的富集（图3.8C）；糖酵解（40%）、果糖半乳糖代谢（20%）、起始嘌呤生物合成（20%）、亮氨酸生物合成（20%）等蛋白通路有较好的富集（图3.8D）。48 暨南大学硕士学位论文图3.8WT-CR组小鼠与WT-AL组小鼠海马差异表达蛋白的功能分类。（A）生物过程富集分析；（B）分子功能富集分析；（C）细胞组分富集分析；（D）蛋白通路富集分析Fig3.8FunctionalclassificationsofdifferentiallyexpressedhippocampalproteinsbetweenWT-CRmiceandWT-ALmice.(A)Enrichmentanalysisofbiologicalprocess;(B)Enrichmentanalysisofmolecularfunction;(C)Enrichmentanalysisofcellularcomponent;(D)Enrichmentanalysisofpathway49 暨南大学硕士学位论文3.4.3.3卡路里限制处理对WT组小鼠海马差异表达蛋白的相互作用分析为了研究WT-CR组小鼠和WT-AL组小鼠海马组织差异表达蛋白间的相互作用，我们对已鉴定出的11个蛋白进行String分析（图3.9）。结果显示HS90B（Hsp90）与6个差异表达蛋白有着相互作用，ENOA（Eno1）与5个差异表达蛋白有着相互作用，VDAC1（Vdac1）与4个差异表达蛋白有着相互作用，PPID（Ppid）和ALDOC（Aldoc）与2个差异表达蛋白有着相互作用，提示这几个蛋白可能参与到卡路里限制处理对WT小鼠的作用。图3.9WT-CR组小鼠和WT-AL组小鼠海马差异表达蛋白的相互作用Fig3.9Protein-proteininteractionsofdifferentiallyexpressedhippocampalproteininWT-CRmicecomparedtoWT-ALmice50 暨南大学硕士学位论文3.5讨论AD是一种常见的神经退行性疾病，其病理特征主要包括胞外Aβ累积形成的老年斑、胞内Tau高度磷酸化形成的神经纤维缠结、以及神经元和突触丢失，患者常表现出明显的认知障碍，中晚期病人常出现不同程度的焦虑抑郁等神经精神症状，严重影响个人和家庭的生活质量。卡路里限制作为一种有效的饮食干预措施，它不会引起机体的营养失调，同时对AD具有神经保护作用，能改善AD患者的认知，并提高他们的记忆能力，是预防或延缓AD发展的一种很好的策略。因此，在目前AD药物治疗进展缓慢的背景下，对AD与卡路里限制的研究就显得尤为重要。本章采用2D-DIGE联合MALDI-TOF-MS/MS的蛋白质组学技术，分别对野生型小鼠和三转AD小鼠进行40%的卡路里限制处理，然后对四组小鼠海马组织进行蛋白质组学分析，结果成功筛选出众多差异表达的蛋白。Panther分析表明这些差异表达的蛋白涉及多个生物过程，如代谢过程、糖酵解等；差异表达的蛋白具有不同的分子功能，如催化活性、转运活性等。String分析显示差异蛋白间有着千丝万缕的联系，每一个差异蛋白都不是独立起作用的，而是通过蛋白间的相互作用来实现特定功能的。下面我们将着重讨论不同组间差异蛋白在AD中的作用，进一步的为阐明卡路里限制对改善AD病理状况的机制奠定基础。3xTg-AL组小鼠与WT-AL组小鼠差异表达的蛋白行为学结果证实，与WT-AL组小鼠相比，6月龄的3xTg-AL组小鼠存在着严重的焦虑、抑郁和记忆损伤行为。因此，筛选并鉴定出该种AD鼠与野生鼠的差异表达蛋白，进而探究3xTg-AD的行为异常的机制研究具有深远的意义。蛋白质组学分析结果显示在3xTg-AL组小鼠和WT-AL组小鼠间共发现30个差异蛋白的表达，其中14个蛋白表达上调，16个蛋白表达下调。进一步的功能学分析发现，ENOG、CPLX1、和SNP25等差异表达的蛋白与AD的病理发生发展高度相关。ENOG具有促生长、促分化、以及促神经元生存和再生的作用，它的神经营养样活性能够被半胱氨酸组织酶X所调控。研究者发现，ENOG的水平在Tg2576小鼠中低表达，上调ENOG的表达能够对抗Aβ产生的毒性作用[104]。CPLX1是一种调控神经递质释放的突触前蛋白，它的异常表达常见于多种神经退行性疾病和神经精神疾病，如阿尔茨海默病、帕金森病、精神分裂症、以及重大51 暨南大学硕士学位论文抑郁症等[105]。课题组前期研究发现CPLX1水平的下调与3xTg-AD小鼠的记忆损伤高度相关[106]。此外，McHnqh等[107]对大鼠海马蛋白组学的研究指出，CPLX1涉及到情绪障碍的病理生理学和抗抑郁作用。这些结果提示CPLX1可能是脑部功能紊乱的关键分子。经生物信息学分析并结合文献查阅，发现SNP25是一种记忆相关蛋白。SNP25是功能性突触的重要标志物，也是神经性可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（solubleN-ethylmaleimide-sensitivefactorattachmentproteinreceptor,SNARE）复合体形式的主要蛋白之一[108]。SNARE复合物在中枢神经系统中具有重要作用，而且对于学习和记忆也是至关重要的[109]。研究表明SNP25在AD大脑中有异常表达，且它表达水平的改变也被发现在其它类型的痴呆中，如血管性和额颞叶痴呆[110]。这些结果提示SNP水平的变化与AD的记忆损伤密切相关。3xTg-CR组小鼠与3xTg-AL组小鼠差异表达的蛋白与3xTg-AL组小鼠相比，卡路里限制明显改善了3xTg-AD小鼠的行为异常，具体包括焦虑、抑郁和记忆损伤。因此，筛选并鉴定出卡路里限制引起的3xTg-AD小鼠差异表达的蛋白，找到卡路里限制改善AD涉及到潜在分子，进一步的为后续研究奠定基础。蛋白质组学结果表明，卡路里限制引起了3xTg-AD小鼠海马组织13个差异蛋白的表达，其中4个上调，9个下调。在这些差异表达的蛋白中，经大量的文献查阅，发现SYN2和14-3-3E与AD病理高度相关。SYN2在神经递质释放中扮演着重要角色，同时据报道AD病人中该蛋白的表达水平显著下降[111]。此外，SYN2基因敲除小鼠展现着明显的认知障碍，提示SYN2在AD的认知方面起着重要作用[112]。结合本研究，发现卡路里限制显著上调了SYN2在海马中的表达，说明卡路里限制可能是通过上调SYN2的表达来实现其对AD行为异常的改善作用的。14-3-3蛋白是一蛋白分子伴侣家族，包括β、γ、ε、η、θ、σ和ξ七种蛋白，广泛表达于脑内[113]。在神经元中，1433蛋白主要定位于胞质、胞内细胞器和细胞膜上[114]。研究发现，在AD病人中1433蛋白表达水平上升，且多共定位于神经纤维缠结处[115]。其中，14-3-3E蛋白被发现在Aβ激活的细胞中显著上调，它属于一种调节蛋白，能够参与到多种重要的细胞过程，如导致神经退行性疾病[116]。此外，研52 暨南大学硕士学位论文究还发现14-3-3E蛋白在AD病人和唐氏综合征（DS）病人的多个脑区其表达水平升高，而这一过程促进了细胞凋亡[117]。结合本研究，我们发现卡路里限制改善了AD小鼠的的异常行为。因此，我们可以推断卡路里限制有可能通过降低14-3-3E蛋白的表达来实现其对AD的神经保护作用的。WT-CR组小鼠与WT-AL组小鼠差异表达的蛋白通过行为学结果，我们发现卡路里限制处理对野生型小鼠的行为影响不大，均未能对野生小鼠的焦虑、抑郁和记忆产生显著性的作用。同样，我们通过海马蛋白质组学分析，发现了卡路里限制引起了野生小鼠海马组织多个差异蛋白的表达。与WT-AL组小鼠相比，在WT-CR组小鼠的海马组织中11个差异表达蛋白的变化，其中5个上调，6个下调。这些差异表达的蛋白主要涉及到代谢过程，而卡路里限制又是一种降低能量摄入的方式，能量摄入的降低会减缓机体的代谢进程，从而参与一系列的保护性措施。因而我们猜测卡路里限制引起的代谢改变将是一种理解其保护作用的很好的思路。3.6本章小结本章使用2D-DIGE蛋白质组学技术筛选3xTg-AD小鼠与WT小鼠海马差异表达的蛋白，以及卡路里限制对3xTg-AD小鼠和WT小鼠海马组织差异表达蛋白的影响，并进一步运用质谱鉴定差异表达的蛋白，通过对这些差异表达蛋白的功能分析和相关文献的查阅，我们发现对个跟AD高度相关的蛋白。结果总结如下：与WT-AL组相比，3xTg-AL组小鼠海马组织中共发现30个差异表达的蛋白，14个上调，16个下调。其中ENOG、CPLX1和SNP25与AD的病理过程密切相关；与3xTg-AL组相比，3xTg-CR组小鼠海马组织中共发现13个差异表达的蛋白，4个上调，9个下调。其中伴侣分子1433E表达下调，突触相关蛋白SYN2表达上调；与WT-AL组相比，WT-CR组小鼠海马组织中共发现11个差异表达的蛋白，5个上调，6个下调。这些差异表达的蛋白大多参与到细胞的代谢过程。53 暨南大学硕士学位论文第四章差异蛋白的进一步验证4.1引言2D-DIGE作为一种被广泛使用的蛋白质组学技术，它能从细胞或组织整体水平研究不同处理方式对蛋白质组的影响，具有高通量、高灵敏性等特点。在本研究中，我们采用2D-DIGE技术研究卡路里限制对WT小鼠和3xTg-AD小鼠海马蛋白质组学的影响，研究发现，卡路里限制能够改善AD小鼠的异常行为，并且改变了海马组织内多种蛋白的表达。经质谱鉴定及生物信息学分析发现，这些差异表达的蛋白参与到脑内的多种生物过程，发挥着重要的分子作用，而且某些差异表达的蛋白也介导了AD的调控，对AD的发生发展有着重要的影响。综合文献查阅，我们发现伴侣分子14-3-3E和突触相关蛋白SYN2在卡路里限制处理调控AD中起着重要作用。因此，本章选取这两个蛋白做Westernblot验证，以期确证蛋白质组学的结果。4.2实验材料4.2.1主要化学试剂名称试剂名称生产厂家Tris上海生工，中国RAPA裂解液碧云天生物技术研究所，中国5X上样缓冲液碧云天生物技术研究所，中国甲醇广州化学试剂厂，中国异丙醇广州化学试剂厂，中国甘氨酸上海生工，中国Tris-HCl,pH6.8海克利思，中国Tris-HCl,pH8.8海克利思，中国NaCl上海生工，中国TBS海克利思，中国吐温-20上海生工，中国54 暨南大学硕士学位论文SDS上海生工，中国30%单体储液Bio-RAD，中国过硫酸铵（AP）Bio-RAD，中国TEMED北京中生瑞泰科技有限公司，中国脱脂奶粉伊利，中国PVDF膜Millipore，美国SYN2抗体Abcom,美国1433E抗体Abcom,美国beta-actinSantaCruz，美国HRP标记的山羊抗鼠二抗ThermoScientific，美国HRP标记的山羊抗兔二抗ThermoScientific，美国4.2.2主要仪器及设备名称生产厂家电子天平Sartorius，德国超声破碎仪Fisher，美国多功能酶标仪Bio-RAD，美国Westernblot电泳仪Bio-RAD，美国半干转移槽Bio-RAD，美国冷CCD成像系统GEHealthcare，美国4.2.3主要试剂配制1)1X半干转膜液：用超纯水将10X半干转膜液稀释成1X的，其中配制100mL体系时，向800mL的1X半干转膜液中添加200mL的甲醇。2)1XTBST缓冲液：精确量取100mL的10X母液，用超纯水稀释至1000mL。3)1.0MTris-HCl缓冲液：用电子天平准确称取Tris60.58g，用超纯水最终定容至500mL，调节pH至6.8，长期保存于室温。4)1.5MTris-HCl（pH8.8）：用电子天平准确称量Tris18.17g，用超纯水溶解后，将pH调至8.8，再用超纯水定容至100mL，0.22μm膜过滤，室温保存。55 暨南大学硕士学位论文5)10%SDS：用电子天平精确称量SDS10g，用超纯水溶解并定容至100mL，调节pH至7.2，常温放置待用。6)10%过硫酸铵（AP）：精确称取0.1g过硫酸铵，用1mL超纯水溶解，涡旋，4ºC冰箱保存。注意现配现用。7)5%脱脂牛奶（封闭液）：用电子天平准确称取2.5g脱脂牛奶，将其加入量取好的50mLTBST中，搅拌直至奶粉完全溶解。注意现配现用。4.3实验方法4.3.1小鼠海马组织蛋白提取详见第三章3.3.2所述4.3.2蛋白BCA定量1)取BCA定量试剂盒，根据下表配制不同浓度的标准样品；EP管编号1XPBS(ml)BSA（ml）终浓度(μg/ml）A0.90.1200B0.80.240C0.50.520D0.50.510E0.50.55F0.50.52.5G0.60.41H0.50.50.5I100备注：A管取0.1ml的BSA标样，B管BSA取A管混合液的0.2ml，后面的标样管取BSA体积类似；2)然后根据样品数量配制工作液(MA液:MB液:MC液=25:24:1)并充分混匀；3)取96孔板，向每孔依次加入100μL不同浓度的标样和蛋白样品，标样及蛋白样每孔重复3个；4)再向已加入标样及蛋白样的每一个复孔加入100μLBCA工作液；5)完成后将96孔板放入37℃温箱孵育30min；56 暨南大学硕士学位论文6)检测562nm波长下光吸收值,绘制标准曲线并得到该曲线公式，利用标准曲线公式及吸光度计算蛋白样品浓度。4.3.3WesternBlot4.3.3.1样品准备1)从-80℃冰箱中取出的组织，快速加入事先预冷溶解的0.6mL的RAPA裂解液；2)用超声破碎仪破碎组织样品，冰水混合液上超3s停5s，超声2min，随后冰上裂解半小时；3)将破碎好的组织蛋白液于4℃12000×g离心20min，吸取上清蛋白液；4)取少量上清蛋白液进行BCA定量；5)蛋白变性：按LoadingBuffer：上清蛋白液=1：4的比例添加相应的LoadingBuffer，涡旋混匀，于100℃加热5min。4.3.3.2SDS-PAGE1)实验前准备：洗净玻璃板，自然晾干或用吹风机吹干，随后对齐玻璃板，固定在制胶架上；2)配制分离胶：配制10mL的分离胶，按表4.1的配方配制，待全部加入后，立即混匀，灌胶，最后加1mL异丙醇压线；3)浓缩胶配制：配制3mL的浓缩胶，按表4.2的配方配制，灌胶结束后立即插入干净的梳子，避免有气泡的产生。待浓缩胶凝固后，拔出梳子；4)上样：组装好电泳装置，根据BCA定量结果，按每个样品加入20µg的蛋白液上样；5)电泳：先按80V跑40min，跑齐样品，随后按120V跑60min分离蛋白。57 暨南大学硕士学位论文表4.1SDS-PAGE分离胶配方（10mL）ThecomponentsofseparationgelforSDS-PAGE(10mL)1.5M30%10%ddH2OTris-HCl10%APTEMED胶浓度Acr/BisSDS(mL)(pH8.8)(µL)(µL)(mL)(µL)(mL)6%5.322.510010088%4.62.72.5100100610%43.32.5100100412%3.342.5100100415%2.352.51001004表4.2SDS-PAGE浓缩胶（5%）配方Thecomponentsofspacergel(5%)forSDS-PAGE1.5M30%10%胶体积ddH2OTris-HCl10%APTEMEDAcr/BisSDS(mL)(mL)(pH8.8)(µL)(µL)(mL)(µL)(mL)21.40.330.252020242.70.670.54040464.110.756060685.51.3180808106.81.71.25100100104.3.3.3转膜1)实验前准备：事先将PVDF膜浸泡在甲醇中1min；2)用半干转液浸泡硬纸板和PVDF膜2min，之后将胶在半干转液中浸泡2min；58 暨南大学硕士学位论文3)按顺序放好两张膜，从下至上依次为硬纸板、PVDF膜、胶和硬纸板。注意应使用推子赶走膜间的气泡；4)转膜条件：每块胶38mA，电转1.5h。4.3.3.4免疫反应1)转膜结束后，取出PVDF膜，将其放入事先配好的5%脱脂奶粉封闭液中封闭2h；2)根据目的条带和内参分子量的大下并参照Mark切下相应的条带。整个过程尽量快，避免条带过干；3)一抗孵育：用TBST以适当比例稀释相应蛋白抗体，然后将条带放入对应的一抗孵育液中，室温下2h或者4ºC过夜；4)洗膜：一抗孵育结束后，在摇床上用TBST漂洗条带3x10min；5)二抗孵育：用TBST按1:3000稀释二抗，将条带放入对应的二抗孵育液中室温孵育50min；6)二抗孵育结束后，用TBST在摇床上漂洗条带3x10min。4.3.3.5显影提前配制一定体积的发光液，接着把保鲜膜垫在显影的垫板上，将发光液滴在PVDF膜的表面，把垫板放入冷CCD成像系统中拍照。使用ImageQuantTL（GEHealthcare，美国）软件分析结果。4.3.4数据统计分析所有数据采用GraphPadPrism7.0软件进行统计处理，数据结果以Mean±SEM表示。三组及以上均数间比较采用单因素方差分析，两组均数间比较采用t检验分析。p<0.05认为差异具有统计学意义。4.4结果通过综合分析蛋白质组学的结果，我们发现，与WT-AL组小鼠相比，3xTg-AD小鼠海马组织表现出明显的14-3-3E蛋白表达水平的上调和SYN2蛋白的显著下调，而经CR处理后，3xTg-AD小鼠海马组织中这两种蛋白的表达被显著纠正。因此，我们推测14-3-3E和SYN2可能对AD的病理发生发展起着重要的作用。所以，我们分别提取了四组小鼠的海马组织蛋白，每组小鼠设置三个生物学重复，使用Westernblot的方法对蛋59 暨南大学硕士学位论文白质组学的结果进行验证。如图4.1所示，与WT-AL组小鼠相比，14-3-3E蛋白在3xTg-AL组小鼠海马组织中有一个上调的趋势，SYN2蛋白在3xTg-AL组小鼠海马组织中表达量显著下降（p<0.05）。而3xTg-AD小鼠经CR处理以后，与3xTg-AL组小鼠相比，14-3-3E蛋白的表达量显著下降（p<0.05），SYN2蛋白的表达量显著升高（p<0.01）。Westernblot的结果与蛋白质组学的结果一致。图4.114-3-3E和SYN2在WT-AL小鼠、WT-CR小鼠、3xTg-AL小鼠和3xTg-CR小鼠海马组织中的相对表达量，（A）、（B）14-3-3E的相对表达量；（A）、（C）SYN2的相对表达量，结果表示为平均值±标准误，每组3只小鼠。Fig4.1Therelativeexpressedlevelsof1433EandSYN2inhippocampusofWT-AL,WT-CR,3xTg-AL,and3xTg-CR.(A),(B)Therelativelevelsof14-3-3E;(A),(C)TherelativelevelsofSYN2.Dataexpressedasmean±SD,n=3foreachgroup.60 暨南大学硕士学位论文4.5讨论目前，由于AD的药物治疗几乎全部宣告失败，而卡路里限制作为一种积极的有效的AD干预措施正被越来越多的人所关注。然而，对于这一方面的机制研究则较为少见。2D-DIGE作为一种新型的蛋白质组学技术，由于引进了荧光染料的加入，使得样品的检测更加灵敏。而且这种荧光染料的标记与后期的质谱鉴定十分兼容，从而实现了蛋白样品的定量。该技术不仅能够同时高效的筛选出大量的差异表达蛋白，还能够对蛋白质的功能作进一步的深入研究，因而它对于研究疾病的发病机制具有非常深远的意义。本章针对蛋白质组学的结果，对筛选到的差异表达蛋白做进一步的westernblot验证，以期探究可能的分子机制。结合Westernblot的结果，我们发现卡路里限制降低了14-3-3E在海马组织中的表达。有文献报道，14-3-3E的表达在AD中显著上调，而卡路里限制能够逆转这一作用，且改善3xTg-AD小鼠的焦虑、抑郁和记忆损伤。因此，我们可以大胆推测卡路里限制的这种保护作用可能是通过下调14-3-3E在海马中的表达来实现的。AD的病理特征之一就是突触的功能紊乱或丢失，这其中包括突触素和突触蛋白的异常变化，使得突触间的联系丧失，从而加重AD脑组织的病变。SYN2作为一种突触蛋白，它表达水平的上升与良好突触功能有关。对AD病人尸检发现，其脑内存在突触蛋白的广泛丢失，提示突触蛋白的下调至少是AD病程发展的直接后果之一。western进一步验证的结果表明，卡路里限制上调了SYN2的表达。综合行为学的结果，我们可以得出这样的结论：卡路里限制的神经保护作用可能是通过上调SYN2的表达，进而发挥其修复突触功能紊乱的作用。4.6本章小结本章综合上一章蛋白质组学的结果，对具有代表性的差异表达蛋白进行westernblot的验证，结果发现经卡路里限制处理后3xTg-AD小鼠海马组织1433E的表达下调，SYN2的表达上调，进一步验证了2D-DIGE的结果。61 暨南大学硕士学位论文第五章结论与展望5.1结论本研究选用3月龄的WT小鼠和3xTg-AD小鼠作为实验动物，以40%的卡路里限制作为实验处理方式，处理时间为3个月，同时以未处理的WT小鼠和3xTg-AD小鼠作为对照。首先通过行为学的方法（如旷场实验、高架十字迷宫实验、黑白箱实验、悬尾实验、强迫游泳实验和水迷宫实验）检测小鼠的焦虑、抑郁及记忆行为，接着利用2D-DIGE联合MALDI-TOF-MS的蛋白质组学的方法，成功的筛选出了多个参与AD发病相关的分子。最后采用Western-blot等方法验证了2D-DIGE的结果。得出的主要结论如下：1)与WT小鼠相比，3xTg-AD小鼠表现出明显的焦虑、抑郁及记忆损伤行为；2)通过行为学检测，我们发现卡路里限制能显著改善3xTg-AD小鼠的焦虑、抑郁及记忆损伤；3)蛋白质组学结果揭示了卡路里限制能够引起WT小鼠和3xTg-AD小鼠海马组织多种蛋白的差异表达；4)突触相关蛋白synapsin-2、伴侣分子14-3-3E等分子的表达改变可能参与了卡路里限制对AD的神经保护作用。62 暨南大学硕士学位论文5.2展望近些年来人口老龄化的人数在快速增加，导致AD患者的数量也在急剧上升，此挑战对21世纪人类来说相当的严峻，亦被称为“21世纪病”。目前，对于AD的治疗仍进展缓慢，至今缺乏有效的药物治疗。因此，治疗前干预对于防治AD及减缓AD发生发展就显得尤为重要。卡路里限制作为AD的一种有效干预措施，已被广泛报道，它能够减轻AD的异常行为，改善患者的认知障碍。但其机制研究尚未阐明，结合本文研究，提出如下展望：1)本研究发现SYN2和14-3-3E可能是参与卡路里限制改善AD小鼠行为异常的关键分子。那么，为了进一步证实其在AD转基因小鼠中的作用，我们可以运用SYN2或14-3-3E基因基因过表达或沉默模型来深入探究卡路里限制改善AD症状的潜在分子机制；2)本研究的行为学结果提示，卡路里限制能明显改善三转AD小鼠的焦虑、抑郁和记忆损伤。为了进一步探究这种保护作用的机制，我们可以从病理学层面入手，通过免疫荧光或免疫组化技术确证卡路里限制对AD病理（Beta淀粉蛋白、tau病理、神经存活或凋亡等）的影响；3)卡路里限制作为一种低能量摄入的干预方式，其影响的主要生物过程便是代谢过程，因而我们可以借助代谢组学的方法深入研究卡路里对AD的这种保护作用的机制。63 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暨南大学硕士学位论文[101]KENNYR,DINANT,CAIG,etal.Effectsofmildcalorierestrictiononanxietyandhypothalamic-pituitary-adrenalaxisresponsestostressinthemalerat[J].PhysiolRep,2014,2(3):e00265.[102]ZHANGY,LIUC,ZHAOY,etal.TheEffectsofCalorieRestrictioninDepressionandPotentialMechanisms[J].CurrNeuropharmacol,2015,13(4):536-542.[103]PARRELLAE,MAXIMT,MAIALETTIF,etal.ProteinrestrictioncyclesreduceIGF-1andphosphorylatedTau,andimprovebehavioralperformanceinanAlzheimer'sdiseasemousemodel[J].AgingCell,2013,12(2):257-268.[104]HAFNERA,GLAVANG,OBERMAJERN,etal.Neuroprotectiveroleofgamma-enolaseinmicrogliainamousemodelofAlzheimer'sdiseaseisregulatedbycathepsinX[J].AgingCell,2013,12(4):604-614.[105]DREWCJ,KYDRJ,MORTONAJ.Complexin1knockoutmiceexhibitmarkeddeficitsinsocialbehavioursbutappeartobecognitivelynormal[J].HumMolGenet,2007,16(19):2288-2305.[106]YUJ,LUOX,XUH,etal.Identificationofthekeymoleculesinvolvedinchroniccopperexposure-aggravatedmemoryimpairmentintransgenicmiceofAlzheimer'sdiseaseusingproteomicanalysis[J].JAlzheimersDis,2015,44(2):455-469.[107]MCHUGHPC,ROGERSGR,GLUBBDM,etal.Proteomicanalysisofrathippocampusexposedtotheantidepressantparoxetine[J].JPsychopharmacol,2010,24(8):1243-1251.[108]XIAOH,LIUB,CHENY,etal.Learning,memoryandsynapticplasticityinhippocampusinratsexposedtosevoflurane[J].IntJDevNeurosci,2016,48:38-49.[109]GAOQ,LIUL,CHENY,etal.Synaptosome-related(SNARE)genesandtheirinteractionscontributetothesusceptibilityandworkingmemoryofattention-deficit/hyperactivitydisorderinmales[J].ProgNeuropsychopharmacolBiolPsychiatry,2015,57:132-139.74 暨南大学硕士学位论文[110]GREBERS,LUBECG,CAIRNSN,etal.Decreasedlevelsofsynaptosomalassociatedprotein25inthebrainofpatientswithDownsyndromeandAlzheimer'sdisease[J].Electrophoresis,1999,20(4-5):928-934.[111]HOL,GUOY,SPIELMANL,etal.Alteredexpressionofa-typebutnotb-typesynapsinisoforminthebrainofpatientsathighriskforAlzheimer'sdiseaseassessedbyDNAmicroarraytechnique[J].NeurosciLett,2001,298(3):191-194.[112]ETHOLML,BAHONJICE,WALAASSI,etal.Neuroethologicallydelineateddifferencesintheseizurebehaviorofsynapsin1andsynapsin2knock-outmice[J].EpilepsyRes,2012,99(3):252-259.[113]BOSTONPF,JACKSONP,THOMPSONRJ.Human14-3-3protein:radioimmunoassay,tissuedistribution,andcerebrospinalfluidlevelsinpatientswithneurologicaldisorders[J].JNeurochem,1982,38(5):1475-1482.[114]TODDA,COSSONSN,AITKENA,etal.Humancruciformbindingproteinbelongstothe14-3-3family[J].Biochemistry,1998,37(40):14317-14325.[115]LAYFIELDR,FERGUSSONJ,AITKENA,etal.NeurofibrillarytanglesofAlzheimer'sdiseasebrainscontain14-3-3proteins[J].NeurosciLett,1996,209(1):57-60.[116]DIFRANCESCOL,CORREANIV,FABRIZIC,etal.14-3-3epsilonmarkstheamyloid-stimulatedmicroglialong-termactivation[J].Proteomics,2012,12(1):124-134.[117]FOUNTOULAKISM,CAIRNSN,LUBECG.Increasedlevelsof14-3-3gammaandepsilonproteinsinbrainofpatientswithAlzheimer'sdiseaseandDownsyndrome[J].JNeuralTransmSuppl,1999,57:323-335.75 暨南大学硕士学位论文附录中英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称ADAlzheimer’sDisease阿尔茨海默病CRCalorierestriction卡路里限制ALAdlibitum随意采食APPAmyloidprecursorprotein淀粉样前体蛋白Aβbeta-amyloidβ淀粉样蛋白NFTsneurofibrillarytangles神经原纤维缠结ROSReactiveoxygenspecies活性氧组分PS1Presenilin1早老素1PS2Presenilin2早老素2BDNFBrainderivedneurophicfactor脑源性神经营养因子IRInsulinreceptor胰岛素受体SIRT1Sirtuintype1抗衰老酶1two-dimensionalfluorescence2D-DIGE荧光差异凝胶电泳differencegelelectrophoresiscAMPresponseelement-bindingCREB环磷腺苷效应元件结合蛋白proteinSYN2synapsin-2突触蛋白-214-3-3E14-3-3proteinepsilon14-3-3蛋白EENOGGamma-enolaseγ-烯醇酶CPLX1Complexin-1Complexin蛋白1SNP25Synaptosomal-associatedprotein25突触相关蛋白25WTWildtypemice野生型小鼠3xTg-ADmiceAtripletransgenicmousemodelofAD阿尔茨海默病小鼠PBSPhosphate-bufferedSaline磷酸盐缓冲液PFAParaformaldehyde多聚甲醛OFTOpenfieldtest旷场实验EPMElevatedplusmaze高架十字迷宫DLBDarklightbox黑白箱TSTTaisuspensiontest悬尾实验FSTFrocedswimmingtest强迫游泳实验MWMMorriswatermaze水迷宫76 暨南大学硕士学位论文攻读硕士学位期间取得的成果1)KaiwuHe,FeiQi,ChunniGuo,ShuqinZhan,HuaXu,JianjunLiuandXifeiYang.MovementDeficitsandNeuronalLossinBasalGangliainTRPC1DeficientMice.Oncotarget.2016OctOct25;7(43):69337-69346.(IF=5.008)2)KaiwuHe,QianSun,XifeiYang.Long-termLow-doseCopperExposureAlteredHippocampalProteinExpressionofTransgenicMiceofAlzheimer’sDisease.The5thForumofCSOTYoungToxicologists,2016Oct.25-28.3)获得2016年研究生国家奖学金77 暨南大学硕士学位论文致谢光阴似箭，岁月如梭，三年的研究生学习生涯即将结束。在暨南大学和深圳市疾病预防控制中心的学习使我受益良多，非常感谢他们给予我的指导和帮助。在这里，谨以此文表达我深深的谢意，谢谢你们！感谢我的导师老师许华教授！许老师知识渊博，学术严谨，平易近人，在学习、工作和生活方面都是我学习的榜样。从课程学习到论文撰写，许老师都精心指导，让我受益颇多。许老师在学习和生活中给予我最大的帮助和支持，令我永不忘怀！在此，向许老师致以崇高的敬意和深深的感谢！感谢我的指导老师杨细飞研究员！感谢杨老师在实验设计、实验实施、论文写作方面给与的悉心指导和鼓励！杨老师博才多学、科研严谨、思维敏捷，是我终生学习的楷模。感谢杨老师在生活上给予的关心和照顾！在此谨向杨老师致以衷心的感谢！在深圳疾病预防控制中心完成硕士论文期间，得到了中心领导的关心和支持，在此向他们表示衷心的感谢。感谢毒理科的刘建军教授、徐新云教授、吴德生博士、周丽老师、黄海燕老师、黄新风医生。感谢任晓虎博后、陈效博后、辛仁忠、张艳玲、孙倩等师兄师姐在实验上给予的帮助。感谢聂露琳、林雪梅、陈高舒、刘海龙、邓荣霞、郑剑、沈自慧等同学的关心和帮助，感谢王典、余海涛、刘盼、汪静、程洁鸿等师弟师妹。感谢暨南大学药学院的各位老师和学位管理工作人员给予的帮助。最后，由衷地感谢我的家人，感谢他们对我的关爱和支持！感谢一路关心支持我的亲人，朋友！何开武2017年5月于深圳市疾病预防控制中心78