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《库尔勒地区蛋鸡H5及H9高致病性禽流感疫苗免疫程序的优化研究及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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库尔勒地区蛋鸡H5及H9高致病性禽流感疫苗免疫程序的优化研究及应用摘要禽流感是一种禽类急性传染病，也是限制蛋鸡养殖业发展的主要传染病之一。目前禽流感预防工作主要是通过免疫接种疫苗来预防和控制，为此，疫苗的免疫程序是否合理科学是预防禽流感的重要环节。本研究通过使用重组禽流感AI（H5N1）灭活疫苗、AI二价灭活疫苗（H5N1Re-6和H9N2Re-2株）和禽-新二联重组活疫苗对库尔勒市某蛋鸡场的共900只蛋鸡进行免疫，将每种疫苗免疫组分为三个小组，分别在14、21、28日龄时首免，两周后二次免疫，并在免疫后每隔两周定期采血，用血凝和血凝抑制试验对H5、H9和新城疫的免疫抗体效价进行检测，用统计软件SPSS18.0进行结果分析，从中选出免疫效果较好的疫苗和优化免疫程序。试验结果表明，蛋鸡在14日龄时首免禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗为最佳时间，不易出现免疫空白期；使用重组禽流感病毒（（H5N1Re-6）和禽流感(H5+H9)二价灭活疫苗免疫后H5抗体效价明显优于禽流感-新城疫二联重组活疫苗；重组AI（H5N1）和AI（H5+H9）二价灭活疫苗产生的H5抗体消长规律差别不大，通过统计学t检验，差异不显著，表明这两种疫苗免疫后产生的免疫保护力基本相同，使用二价灭活苗，更经济方便。试验研究表明蛋鸡在第14日龄时首次免疫AI（H5+H9）二价灭活疫苗，第4周加强免疫，之后每隔4个月再加强免疫一次，获得理想的免疫效果。根据试验结果优化最佳免疫程序，2014年在全市六个乡镇推广应用后，AI免疫H5抗体合格率在逐年增长，免疫保护水平达到了80%以上，符合统计学要求的整体免疫保护，为库尔勒市高致病性禽流感疫情防控奠定了基础。关键词：禽流感；蛋鸡；免疫程序；推广应用IV StudyandApplicationthebestImmunizationProgramsfortheH5andH9HighlyPathogenicAvianInfluenzaofegg-breederinKORLAareaAbstractAvianinfluenza(AI)isanacuteinfectiousdiseaseofpoultry,andalsoisoneofmainlyinfectiousdiseasetolimitthedevelopmentofpoultryindustry.Atpresent,vaccinationisoneofimportantmethodstopreventandcontrolAI,soitappearsespeciallyimportanttofindascientificandreasonableandconvenienceimmunizationprogram.Inthispaper,wehavedesignedanimmunizationprogramwhichusingsingleAIvaccine(H5N1Re-6)、combinedAIvaccine(H5+H9)andavianinfluenzaandNewcastlediseaserecombinantvaccine,live(strainrLH5-6)tovaccinatethreegroupsof900egg-breederfromonepoultryfarminKORLAcity.Foreachtypeofvaccineisdividedintothreegroups,respectivelyintheageof14,21,28,immuneforthefirsttime,twoweeksafterthesecondimmunization,wecollectedserumsampleseverytwoweekstomonitortheH5、H9andNDantibodiestiter.WegottheresultsthroughusingHAtestandHItestandstatisticalsoftwareSPSS18.0tomonitortheantibodytiterandtoanalysistheresults.Theresultsshowthattheegg-breederattwoweeksofagetofirstvaccinateAIvaccine(H5+H9)wasthebesttime,andnoteasytoappeartheblankimmunizationperiod;theimmunizationofH5antibodywhichbyusingsingleAIvaccine(H5N1Re-6)andcombinedAIvaccine(H5+H9)isobviouslybetterthanbyusingavianinfluenzaandNewcastlediseaserecombinantvaccine,live(strainrLH5-6);therisingandfallingruleofantibodieswassimilarwhichbyusingthefirsttwovaccine;thedifferencewasnotsignificantbyusingstatisticaltest.theresultsshowthattheimmuneprotectionofthesetwokindofvaccinewasbasicallythesame,butincontrast,itwasmoreeconomicalandconvenientbyusingcombinedAIvaccine.ThefinalconclusionwasthattheuseofcombinedAIvaccine(H5N2+H9N2)tovaccinatetheegg-breederinsecondweeksbeforelayingopen,andtovaccinateagaininthefourthweeks,theneveryfourmonthsonceagaintovaccinatewastheoptimalimmunizationprogram.Developmentofnewimmunizationprograms,promotetheuseofthecity′ssixvillagesandtowns,afterthe2014promotingresultsoftheprojectTheprovinggroundhasgreatlyincreasedantibodiespassrate,itreachedthelevelofimmuneprotectionthattheprovinggroundantibodyprotectionrequirementsmorethan80%,IntheKORLAcityofzerooccurrenceofhighlypathogenicavianinfluenzaprovidedastrongbasisforprotection.Keywords：AvianInfluenza;egg-breeder;Immunizationprogram;PopularizationandapplicationV 目录第1章引言................................................11.1禽流感概述.......................................................11.2发生与危害.......................................................11.3病原学...........................................................21.4禽流感的临床症状和病变...........................................61.5禽流感的诊断技术研究.............................................71.6禽流感的疫苗研究................................................121.7禽流感的防治....................................................141.8研究的目的意义..................................................16第2章高致病性禽流感疫苗免疫程序的优化.....................172.1材料和方法......................................................172.2方法............................................................182.3试验结果与分析..................................................212.4讨论............................................................342.5结论............................................................37第3章高致病性禽流感H5及H9免疫程序对库尔勒六乡镇的推广应用383.1材料与方法......................................................383.2结果与分析......................................................393.3讨论............................................................413.4库尔勒市蛋鸡群禽流感防控的建议..................................423.5小结............................................................43第四章全文结论...........................................44附录A....................................................45参考文献..................................................46致谢....................................................51个人简历..................................................52VI 新疆农业大学硕士学位论文第1章引言1.1禽流感概述禽流感（BirdFlu或AvianInfluenza）是通过正黏病毒科A型流感病毒引发的一种急性传染病，世界动物卫生组织将它列为A类传染病，全名鸟禽类流行性感冒，也被称为真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，是影响蛋鸡养殖业发展的主要传染病之一。能感染禽流感病毒的[1]动物是鸡、鸭等其他一些野鸟，人类也能感染。禽流感主要临床综合症状有多种形式，如通过高致病性禽流感病毒（HighlyPathogenicAvianinfluenzavirus，HPAIV）引起的急性致死性疾病和通过低致病性禽流感病毒（LowPathogenicAvianinfluenzavirus，[2]LPAIV）引起的产蛋量降低、食量减弱、轻微呼吸系统疾病等。禽流感常常表现为暴发趋势，可引起大面积的流行，尤其是感染高致病毒株（如H5N1）能够引起鸡群大面积死亡，导致家禽养殖业经济损失惨重，受到全世界的广泛重视。1.2发生与危害第一次发现禽流感病毒的高致病力毒株是从1878年在意大利爆发的一种被称为“鸡瘟”疾病中获得的。到1955年，确认这类鸡瘟病毒是A型流感病毒，从那时起，欧洲、非洲、美洲及亚洲相继发生，并广泛传播，在全球范围内散布。从国际兽医局（OIE）[3]和世界卫生组织（WHO）每月的统计数据来看，该病仍然处于经常发病的状态。1878年意大利暴发的鸡瘟在1955年时被证实因由A型流感病毒引起的流感后，到上世纪末，先后有18起高致病性禽流感疫情在全球爆发，其中5起是火鸡爆发，13起是鸡[4]爆发。从上世纪90年代后期开始，在亚欧大陆禽流感频频暴发，不仅给许多国家的禽类养殖业带来严重的影响，而且给人类的健康也带来了严峻的挑战。美国宾夕法尼亚州在1983年4月发生的由H5N2毒株引起的流感疫情，淘汰了1700万羽家禽，关闭了当地所有鸡场，造成近达6100万美元的经济损失。1993年墨西哥禽流感疫情暴发并扩散至全国各地，家禽死亡率较高，死亡近1800万羽鸡，损失达10亿美元，三年后疫情才有所控制。1997年3月在香港行政特区暴发的流感，是由H5N1亚型毒株引起，影响3个养殖场倒闭，1 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用150万只鸡被扑杀，政府耗资1亿港币，并感染18人，6人死亡，这是全球第一次发生禽流感直接感染人类的疫病。2001年禽流感再一次在香港爆发，250万只鸡被扑杀，当局耗资近8000万港币。2003年春天，爆发于荷兰的H7N7型禽流感，在很短的十几天内，隔离了900个农场内的近1400万只家禽，扑杀了1800万只病鸡，这些数据几乎为荷兰养禽业总量的1/4，经济损失惨重（达1亿多欧元损失），当时，该病毒还感染了80人，导致1人死亡。在2003年末韩国第一个报道暴发禽流感不久，H5N1禽流感在日本、泰国、越南、中国、美国等地相继发生传播，数百万只家禽被感染死亡，23人受感染而死亡，严重的打击和制约了这些国家的家禽养殖业发展，同时威胁着人类的生命安全。在那个期间，泰国、越南、香港等地有。2004年2月我国在广西、云南、上海等多地确诊了49个H5N1疫点，3月中旬时高致病性禽流感疫情全部扑灭并解除封锁，没有发生人感染禽流感病毒的情况。2005年，H5N1禽流感的人感染报道在东亚、东南亚、欧洲等地相继传出，研究者认为H5N1病毒具备了导致另一场流感大流行所需的特点，因而众多的研究都聚焦[5]在H5N1病毒上。从此之后，禽流感疫情发生频率较高，引发疫情的病毒毒株也各不相同。如，2006年初H3N2禽流感病毒在美国发生较多；到2012年H5N2高致病性禽流感疫情在台湾第一次爆发，但同年6月我国甘肃省景泰县发生却是H5N1亚型高致病性禽流感，9月广东省湛江市爆发一起由鸭感染的H5N1禽流感病毒的高致病性禽流感疫情，2013年和2014年，我国多地先后发生了由人感染的H7N9禽流感疫情，可见这些年来，高致病性禽流感的暴发率呈逐渐上升的态势，引发疫情的毒株也在不断变化，感染的宿主也由鸡变为了鸭和人，这说明禽流感病毒的变异给全球的养禽业及人类公共安全所带来的风险是无法估计的。1.3病原学1.3.1病毒的分类禽流感（Avianinfluenza，AI）是一种高度接触性急性传染病，主要引发的病毒是禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV），具有传播快、发热和伴有不同程度的呼吸道2 新疆农业大学硕士学位论文[6]症状的特征。禽流感病毒是正黏病毒科病毒的一种，抗原蛋白的不同，使得其具有甲（A）、乙（B）、丙（C）三个血清型。这3个不同血清型的禽流感病毒所感染的宿主和流行的范围及危害程度都各不相同，其中流行范围最广，危险最大的是A型流感病毒，它可入侵许多的动物体内，如猪、马、禽类、海洋哺乳动物等，还可以感染人，是引发人和畜禽呼吸道疾[7]病的重要病原；而B型和C型主要感染人类，C型也可从猪中分离到。禽流感病毒可以分为不同的亚型，主要是因为其表面糖蛋白HA和NA抗原性的不同。目前已发现的亚型有16种HA亚型（H1～H16）和9种NA亚型（N1～N9），它们之间可以相互组合，组合的不同，导致A型流感病毒呈现许多亚型（如H1N1，H2N2，H3N2，H5N1„„等）。通常A[8]型流感病毒中H5和H7亚型能使养禽业造成巨大的打击。根据致病力的强弱A型禽流感病毒有高致病性禽流感和低致病性禽流感两种。国际学术界有人提议当人工给禽类接种该病毒后，导致禽发生死亡，如果死亡率达到75％，则认为是高致病力毒株引发的。但实际上，从一些地方的病禽体内分离出了高致病力毒株，而病禽的死亡率并没有达到75％。1.3.2病毒的结构流感病毒外有囊膜，囊膜共有三层构成，最外一层就是HA和NA这两种纤突，中间是来自宿主细胞膜或核膜的类脂膜，类脂膜是脂质双层结构，病毒粒子内的主要蛋白成分基质蛋白在囊膜最内一层。（1）血凝素（Hemagglutinin，HA）流感病毒囊膜表面的HA纤突是一个三聚体，由三个HA单位聚合在一起而形成，呈球状，里面有受体结合位点以及抗原决定簇。HA[9]由多个亚型组成，到目前为止，已经知道有16种亚型（H1～H16）。病毒要引发感染，需要将HA前体分裂为HA1和HA2亚单位，这个裂解过程是由宿主蛋白酶来完成的,而HA[10-11]就是决定AI病毒毒力最重要的蛋白质。禽流感病毒HA基因是引起禽流感病毒抗原变异、决定病毒致病力高低、影响宿主范围大小的主要因素。因为，HA蛋白具有能够与细胞表面病毒特异性受体相结合，使病毒外膜与细胞内小体膜相互融合，将病毒核衣壳[12]释放并进入胞浆，从而刺激机体产生中和抗体等3种生物功能。3 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用（2）神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）NA数量没有HA多，以4聚体形式存在，一种外切糖苷酶，能够水解唾液酸，N这一功能，能够使病毒粒子脱离宿主细胞而不聚集在一起。（3）核蛋白（Nucleoprotein，NP）NP是一种单体磷酸化的多肽，也是构成病毒核衣壳的主要蛋白成分，有特异性，根据由于抗原性的差异，流感病毒具有A、B、C三型。NP的结构不同，流感病毒的宿主也会不同。Medcalf等研究表明，AIV复制所需要的是[13]NP结合RNA的能力。（4）基质蛋白（MatrixProtein，M）基质蛋白是由第7个病毒基因组片段上的M基因编码而成。第7病毒基因组片段和两个读码框通过转录产生两个mRNA，能译出流感病毒的基质蛋白M1和M2。M1的功能主要是维持病毒形态，M2在HA合成过程中，是质子的一个通道，能够升高或降低高尔基体内的PH值，从而改变周围环境的酸碱性。反向[遗传学研究表明，去除M2蛋白胞浆尾的5个或10个氨基酸残基后，流感病毒的能力就会[14]不存在。1.3.3病毒的增殖图1-1禽流感病毒入侵体内后变异、增殖示意图（1）吸附流感病毒感染细胞后，与细胞上的特异受体即在细胞膜糖蛋白或糖脂链末端的唾液酸互相作用，将病毒吸着在细胞表面，通过吞饮作用进入细胞浆，与酸性溶酶体相互融入在一起，导致流感病毒周围的PH值降低使周围环境变为酸性，促使HA的4 新疆农业大学硕士学位论文构象发生大变动，使HA的氨基端脱离并近入吞噬细胞的脂质双层，导致病毒囊膜与吞噬细胞结合并破裂，最后病毒核衣壳被放入细胞浆内。（2）穿入病毒的囊膜掉落后，其核苷酸片段便进入宿主细胞核，通过病毒自身的聚合酶复合体发生催化作用，将宿主细胞的信使RNA上的5′帽子结构切下作引物，开始进行第一次的转录。先转录出的6个单顺子的mRNA，会转译为HA、NA、NP和三种聚合酶（PB1、PB2和PA）。每个NS和M基因的mRNA互相衔接在一起会产生出两个mRNA，根据不同阅读框架进行转录，产生NS1、NS2、M1和M2蛋白。（3）装备与释放HA和NA都在粗面内质网糖基化，在高尔基体内分别修饰成三聚体和四聚体，然后通过高尔基体到达细胞表面，进入细胞膜中，宿主细胞蛋白质又将HA分裂为HA1和HA2两个部分，并由二硫键连接。这种裂解过程中就生成了传染性病毒，病毒以出芽生殖方式脱离细胞，开始继续进行下一个侵染过程。1.3.4病毒的遗传变异禽流感病毒可以发生多种变异，如：改变抗原性、温度敏感性、宿主范围以及对非特异性抑制物敏感性等。其中改变其抗原性的变异主要有抗原性转换和抗原性漂移两种形式。对A型流感病毒而言，抗原性变异是经常可以看到的一种天然变异，流感的规模与变异幅度的大小有直接关系，其中HA变异频率要比NA高。这两种抗原的变异有三种情况，一是HA和NA单独发生变异，二是HA和NA只有一个发生变异，三是HA和NA同时发生变异。从抗原性变异的程度的角度老看，有抗原转换和抗原漂移两种方式。（1）抗原性转换（AntigenicShift）是病毒株表面抗原结构一种或两种发生变异，可以变异为新亚型，如H1N1可形成为H2N1，这种变异幅度大，由于人群对变异病毒株没有产生免疫力，引发流感大流行几率也就很大,这与之前的流行毒株抗原有所不同，在人流感的发生历史上抗原转变表现较为明显。例如，H1N1亚型在1957年由于抗原性突变转变为H2N2亚型了，1968年又是H3N2亚型毒株引发的疫情，1977年发生流感疫情又成H1N1亚型引发的。（2）抗原漂移（AntigenicDrift）通常被认为是由病毒基因点突变和人群免疫力5 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用选择造成的小幅度变异，产生不了新的亚型，一般都是引发小规模的流感。选出免疫群体中的变异体反应，它可以使病毒抗原基因突变，改变病毒表面的蛋白质和抗原结构，无法辨认和消除以前的抗体和体内免疫系统，从而造成了新的疾病，还可使致病性更强病毒的出现，这就是抗原漂移的过程。禽流感病毒HA变异率相对不高，其原因可能是因为免疫系统对病毒变异的压力不够，因为禽类的寿命较短,当发现禽类感染流感病毒[15]后，抗体持续时间比较短。1.4禽流感的临床症状和病变禽流感病毒感染家禽后，可以表现为无症状的亚临床感染至几乎100%的发病和死亡，以及消化系统、呼吸系统、神经系统和生殖系统的不正常。禽类的年龄、种类、病毒亚型不同，都会导致禽感染禽流感病毒后表现的临床症状不一样，潜伏期的长短有不一样。1.4.1高致病性禽流感根据禽流感病毒致病性和毒力的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。禽流感病毒有不同的亚型，由H5和H7亚型毒株（以H5N1和H7N7为代表）所引起的疾病称为高致病性禽流感（HPAI）。呈潜伏期非常短，一般为几小时到几天不等的特点，这与所感染的病毒的致病性强弱、感染病毒的剂量大小、获感[16]途径和不同品种的抗病性有关。该病暴发后迅速蔓延，发病急，鸡会突然死去，没有任何症状，死因不明；整个鸡群的鸡都快发病，鸡群大面积死亡，甚至是所有鸡都会死亡。主要临床症状表现为体热，食欲下降，不进食，伴有呼吸困难；精神萎顿，病鸡一会就会进入昏迷状态；羽毛凌乱，无毛处皮肤发绀，饮水量增加，水样粪便，身体非常消瘦；头颈水肿，鸡冠和肉鬓常呈紫色和皮肤出血坏死，眼睛肿胀流泪，鼻腔和口腔都有粘液性分泌物；腿脚皮肤肿胀足鳞片出血，结膜肿胀，眼睑下充血等临床症状。还会出现打喷嚏、咳嗽和啰音等逐渐加重的呼吸道症状，并伴有行动不协调、惊讶、麻痹、甩头等神经症状；蛋鸡产蛋量明显降低,，易产软壳蛋、薄壳蛋，或是畸形蛋等。以上临床症状有的是表现一种，有的带有其他并发症表现在多种。一些毒株虽然血清亚型相6 新疆农业大学硕士学位论文同（如H5N1）但是对不同家禽种类（如鸡和鸭）会表现出不一样症状，即对某一种家禽品种可能引起症状严重的疾病（如鸡感染后症状明显），而对另外一种家禽却无任何[17]明显症状（如鸭感染后症状不明显）。比如，2004年从越南鸭蛋、鹅蛋中分离到的H5N1禽流感病毒（A/Vietnam/1203/04），与1997年香港暴发的AIV同种病源很相似，尽管不[18]会引起水禽发病，但对鸡具有高致病性。因此，在疾病突发时，有的病鸡没有任何症状时就已经死亡了。鸡感染后，病毒几乎在全身任何器官和组织中都存在，就连病鸡的分泌物和排泄物，以及病母鸡下的蛋都携带病毒。急性病例病变一般不突出，比较明显的症状有头部水肿、冠发紫，脚趾肿胀，足鳞片出血，心冠脂肪和肌胃周围脂肪组织等全身组织器官有小出血点。在显微镜下观察可见有脑血管呈局部充血，有小血栓、血管套、神经细胞变性形成、周围还有局部的坏死灶形成，并伴有神经胶质细胞增生等弥散性脑炎症状，脾出现细胞性淋巴结节坏死。1.4.2低致病性禽流感特点是潜伏期长，一年四季都可发生，病毒持续时间长，传播速度慢，发病率和死亡率都较低，隐性感染较多，蛋鸡可能会出现零星死亡。不同种类的家禽由于年龄也不同，感染病毒后所表现出的临床症状也不同，没有典型的具体表现特征。病鸡主要表现为呼吸道粘膜损伤等轻微的呼吸道症状，采食量急剧下降，生长发育较慢。蛋鸡感染后较为显著的症状就是产蛋量降低，生产的蛋中褪色蛋和沙壳蛋会多一些，而畸形蛋和软壳蛋会相对少一些。1.5禽流感的诊断技术研究高致病性禽流感病毒入侵家禽后，发病急促，很快传播给群体中的其他禽只、能引起使禽类大面积死亡，还能感染人；毒力较弱的病毒能使家禽的生产性能降低显著，并能通过多种途径阴性传播，抗原漂移或抗原转变可使其变为新的毒株或毒力增强，这些都会给家禽养殖业发展和人类公共卫生安全构成严重的威胁，因此，如何在禽流感的早期时快速准确诊断引起了世界各国的高度关注和重视。这几年来，广泛应用的禽流感监7 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用测技术有多种，其中血清学诊断技术有禽流感琼脂扩散（AGP）、血凝抑制试验（HI）、神经氨酸酶抑制试验（NI）、间接酶联免疫吸附试验（ELISA）等,除此之外还有分子诊断技术（RT-PCR）、基因检测技术等。1.5.1血凝与血凝抑制试验（HA/HI）禽流感HA-HI试验是流感病毒上的血凝素蛋白（HA）能够识别并吸附于细胞表面受体的的结构。其原理就是，流感病毒的抗体能够结合该蛋白受体，这一特异性可以影响HA蛋白与红细胞受体的融合，阻止了其血凝素的活性从而抑制了HA现象，即HI试验。禽流感HA-HI试验正是利用这一特性证实流感病毒的血凝活性及排除NDV。当前，禽流感HA和HI主要用来签定流感病毒HA亚型毒株，也可用于检测禽血清中是否有与抗原亚型一致的感染或免疫抗体，是WHO和OIE采用的普遍监测试验方法。HA和HI试验普遍用的是的常量法和微量法，这两种方法是有WTO推荐的，另外还有，在4℃或室温下，抗原和抗体互相作用1～2h后再加鸡红细胞的HA加敏法，用它检测的抗体效价比一般常用的方法会高出2～4倍。假如将乙醚裂解抗原，抗原敏感性则会比普通方法高出4～16倍，不过观察时期最好控制在30min以内，不然很容易呈现假阳性。特[19]别需要说明的是，在进行HI试验时，使用的抗原和抗血清要避开神经氨酸酶同型。1.5.2琼脂凝胶扩散试验（AGP）AGP为一种免疫沉淀反应,可溶性抗原与相应的抗体是在琼脂凝胶中进行反应的，可以用已知的阳性血清和未知的抗原通过AGP实验，鉴定出病毒抗原型特异性。AGP之所以用来鉴定流感病毒，其主要原因是其可以检测A型流感病毒抗RNA-核蛋白（就是RNP）和基质蛋白（M1）抗体。该方法简易快速，有很强的特异性，受病毒亚型的限制小，缺点是灵敏度不高，较HI试验稍差一些。随着科学技术的发展，AGP试验有很多种操作方法，如双向双扩散试验、免疫单辐射扩散试验（SRD）、免疫电泳试验（CIE）等，观察可溶性抗原与相应的抗体反应和抗原抗体鉴定最基本方法的就是免疫双扩散（即双向双扩散IDD），这种实验只要是在室温下，用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（或抗体），在琼脂凝胶中如果已知抗原孔和阳性血清孔间呈现明显沉淀线，抗原孔和待检血清孔间也会呈现沉淀线同时会与阳性8 新疆农业大学硕士学位论文血清孔的沉淀线相连，说明待检血清中存在相应抗体。这种方法与普通AGP法比较，敏感度要高，时间又短，能够获得良好的结果。1987年，我国研究者提出了用AIV尿囊液[20]经超速离心以及浓缩后，再用福尔马林灭活制备Ag效果相比会更好一些。赵增连等人[21]研究在琼脂中加入3％的PEG-6000，能够进一步提高了AGP的敏感性，更加快而方便。李海燕（1998）等应用AIV快速定型双扩散法测定禽流感抗体，在该方法基础上研究出[22]了AGP诊断试剂盒。这种方法操作简便、快捷精准，是检测禽流感免疫抗体以及诊断现场疫病一种理想方法。1.5.3神经氨酸酶抑制试验（NI）该试验主要用于鉴定流感病毒的原理是，若抗血清会与NA中和，已知的标准NA分型抗血清则与病毒NA亚型相一致，降低或避开了胎球蛋白释放唾液酸，最后不发生化学[23]反应，粉红色的出现也会看不到，这说明血清对NA抑制阳性。VanDeuson等在1993年成功研究了平板微量NIT试验方法，这种方法能快捷的分类出A型流感病毒的病毒分类，并检测出抗体，但却无法提供常量法的定量，尽管如此该方法通常被世界卫生组织推荐使用，因为它可以降低抗原的使用量，还能对多种分离物同时进行抗原分类。1.5.4中和试验（VN）VN是一种血清学方法，它具有特异、快捷、敏感等特点，主要是利用动物机体感染病毒后，体内会获取与相对应的病毒粒子特异性地相结合的特异性中和抗体这一原理，来鉴定病毒的感染力。该试验敏感性和特异性及检出率都很高，但是操作比较繁琐，试验材料耗费也多，耗力费时，因此极少用来进行病毒病的诊断。通常固定病毒量与等量系列倍比稀释的血清混合（即定病毒-稀释血清法）和固定血清用量与等量系列对数稀释的病毒混合（即定血清-稀释病毒发）这两种方法用的较多些。1.5.5酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA试验属于标记免疫学技术的一种，即用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。此试验具有速度快、敏感性强、简捷且便于标准化等优点，使得其成为最广泛应用的检测方法之一。它不仅可以测出免疫酶染色各种细胞9 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用内成份，研究抗酶抗体的合成，还可显现微量的免疫沉淀反应，定量检测体液中抗原或抗体成份。2000年，李海燕等研究设立了禽流感间接酶联免疫吸附试验诊断技术(rNP-ELISA)（李海燕等，2000），用该方法采用杆状病毒表达的核蛋白为抗原检测A型禽流感病毒血[24]清特异性抗体特异性和敏感性强，且快速经济。2009年，QingpingLuo等研究建立了一种较传统的病毒分离方法准确性、敏感性和特异性都高的方法（即：诊断禽流感病毒[25]的双夹心ELISA），该方法还能检测出感染H5亚型的病料组织中的禽流感病毒，检测结果的灵敏度、特异性都很高。Yang等采用针对H5亚型的两个单克隆抗体设立了双抗体[26]夹心ELISA诊断方法，这种方法检测禽流感病毒、对H5亚型分型以及区分其他相似症状的病毒结果都很不错，如新城疫病毒等。双抗原夹心ELISA是2010年，由[27]Watcharatanyatip等研究建立的。2009年，王兆鹏等设立了检测禽流感病毒M1抗体的[28]间接阻断ELISA方法，这种方法主要是以AIV重组M1蛋白作为检测抗原，用免抗M1血清作为阻断抗体，可作为ATV抗体的检测和禽流感的流行病学调查的一种理想实验方法。1.5.6免疫荧光技术（IFA）免疫荧光技术是用荧光抗体示综或检查相应抗原的方法，故又称荧光抗体法。这种技术的操作中不仅使用了免疫学技术还用了荧光染色技术和显微镜观察方法。到1958年Riggs等人研究出来性质稳定且不易产生毒素的异硫氰酸荧光素后，免疫荧光技术便开始逐步发展。免疫荧光技术属于一种血清学反应，通过以标记过荧光素的荧光抗体（抗原）作为探针检测组织细胞内相应的抗原（抗体），形成抗原-抗体复合物。使用显微镜检测荧光所在的组织或细胞来完成对抗原、抗体的定位。此技术可靠、快速、灵敏，具有广适性，主要分为四种技术方法，即直接免疫荧光技术、间接免疫荧光技术、时间分辨荧光免疫分析法及补体法（简介免疫荧光技术改良法）。现在，免疫荧光技术已是一种诊断和治疗疾病的广泛应用技术。它能在细胞水平上对特异性的抗体（抗原）准确定位，当前，很多研究将该技术进行定量化、标准化和自10 新疆农业大学硕士学位论文动化。不过目前使用的荧光素在光稳定性和光漂白性方面存在很大的问题，因此，想要提高检测结果的可信性，就需寻找新的荧光物质、克服现有荧光抗体标记存在的问题，这也将成为一个新的研究课题。1.5.7分子生物学诊断方法目前现代生物技术发展快速，禽流感的快速诊断也广泛使用分子生物学技术，转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）诊断技术的敏感性和特异性非常高，能够快速检出AIV病毒，是一种早期快速诊断禽流感的方法，它不仅敏感、快速、实用还比较强。哈尔滨兽医研究所研究的逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)是一种体外DNA扩增技术，不但可以从基因水平检测出禽流感RNA基因，还能直接从禽粪便及尿囊液中检出H7亚型病毒，攻克了病毒分离鉴定试验周期长的缺点和因野外取材混有其他病毒造成的误诊。[29]Xie等研究设立了诊断A型流感病毒的多重RT-PCR，这种试验的敏感性和特异性非常高，H5、H7和H9的检测最小量为100pg，A型流感病毒中所有亚型的检测最小量为10pg。Chen等建立了诊断H9N2亚型的三重RT-PCR，该方法通过设计针对核蛋白、血凝素和神经氨酸酶的3对特异性引物，其敏感性和特异性与病毒分离的方法一样。所以，在H9N2亚型的检测中该方法的快速、经济特点使其具有非常广阔的应用前景。[30]刘燕等研究成功了鉴别H5和H9亚型AIV的多重RT-PCR方法，谢芝勋等研究成功[31]了鉴别H5和H7亚型AIV的多重RT-PCR方法。卢亦愚等研究成功了TaqMan-MGB荧光[32]，定量RT-PCR诊断方法，该方法针利用优化荧光定量RT-PCR反应体系与条件，对于H5亚型禽流感病毒血凝素基因的额保守区设计了特异性引物与TaqMan-MGB荧光探针。E.Starick以为，RT-PCR方法可以用于鉴别高低致病力AIV，而C.Steininger以为RT-PCR[33]技术的灵敏度要比病毒分离和ELISA高，可以防止一些错误的阴性结果。RT-PCR-酶联免疫吸附法（RT-PCR-enzymelinkedimmunosorbentassay，RT-PCR-ELISA）是一项检测病毒的新诊断技术，可以将RT-PCR技术与酶联免疫吸附试验结合起来，用此方法检测禽流感毒株H5N2和H7N1，结果证明该法阳性检出率比鸡胚[34][35]病毒分离高39%。MunchM等建立PCR-ELISA检测禽流感病毒，大大提高了检测的敏11 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用感性。1.6禽流感的疫苗研究目前，实际养殖中预防禽流感的疫苗基本上是灭活疫苗，主要是H5、H7、H9亚型为主。灭活疫苗生产方便、具有特异性、免疫持续时间长，已在全球范围内广泛应用。但在临床实践中灭活疫苗免疫剂量大，免疫效率低，关于疫病的疫苗免疫与野禽感染的缺陷在检测中很难分清楚，同时还可能会发生散毒的危险。因此，研发安全高效的新型疫苗一直以来都备受关注。目前，常用的疫苗有以下几种：1.6.1全病毒灭活疫苗禽流感灭活疫苗通常是用甲醛将禽流感病毒鸡胚尿囊增殖液灭活,辅以佐剂而成[36]。传统的灭活疫苗所用的毒株通常是强毒株，具有较强的免疫保护力，能防止同一种亚型AIV的攻击，许多国家用它预防禽流感，达到了很好的免疫效果。灭活疫苗虽然对机体没有什么感染力，但也依然保持其的免疫原性，可以诱导机体产生相应的免疫力，防止野毒株的感染。灭活疫苗具有免疫效果较好，免疫保护持续时间长，在2～8℃下能够保存一年多，还没有毒力回归或突变的特点。目前，我国已经研制成功的H5和H7亚[37]型禽流感灭活疫苗，经过试验证实免疫效果较好。当前，生产中常用的重组禽流感病毒灭活疫苗是哈尔滨兽医研究所采用国内流行的禽流感病毒为表面基因供体，利用反向基因操作技术研发的具有国际先进水平的禽流感疫苗产品，拥有自主知识产权。其中分别利用重组的H5N1和重组的H9N2疫苗免疫后产生的HI抗体和免疫持续期均高于自然[38]株制备的H5N2和H9N2亚型灭活疫苗，应用前景非常广阔。但在临床实践中，全病毒灭活疫苗表现出了一些缺点，比如灭活苗注射的病毒量与活疫苗相比可以多出好几倍；制备过程中须添加佐剂和大量的鸡胚，成本很高。如今，很多研究的对象是混合乳化法[39]制备的联苗。1.6.2减毒活疫苗减毒活疫苗又称弱毒疫苗，是在25℃左右的温度条件下，将野毒株感染鸡胚后，连12 新疆农业大学硕士学位论文续复制传代获取减毒毒株，即冷适应株，再利用该弱毒株免疫诱导机体产生特异性免疫。此疫苗对群体免疫的效果会比较好，主要是因为它能够保护表面抗原发生转移的流行株病毒。接种减毒活疫苗后，能够在机体内生长繁殖，促使机体产生像硬性感染或轻度感染的反应，但不会表现临床症状。1.6.3基因工程亚单位疫苗亚单位疫苗是利用化学分解或有控制性的蛋白质水解方法导致天然蛋白质分离，从而提取或合成细菌、病毒的特殊结构蛋白质结构，挑选出具有免疫活性的片段制成的疫苗。这类疫苗不是完整的病毒，只有几种主要的蛋白质，因此能够出清很多无关抗原反应产生的抗体，降低了疫苗的不良反应以及减少由疫苗诱发的一些疾病。该疫苗产生的抗体维持时间较短,但安全性高,可以引发机体产生相应的免疫力，不过成本较高。但这种疫苗免疫原性不高，和佐剂合用后才能产生较好的免疫效果。1.6.4基因重组活载体疫苗Thomasm等利用基因工程技术将A/Ty/Irel1370/83（H5N6）株形成的HA基因插入含有痘苗病毒WR株TK基因的质粒pSCLL中，通过同源重组提取Vac-H5重组病毒。用该重组病毒接种1日龄和5日龄的雏鸡，结果能够对不同H5亚型的强毒株攻击产生的保护率几[40]乎达100%。与此同时，我国哈尔滨的乔传林等在2003年建立了NA基因的重组禽痘病（fowlpoxvirus，FPV）毒重组疫苗，它能够同时表达H5N1亚型，HA基因和NA基因，[41]攻毒效果显示此疫苗的免疫保护性较好。它是第一代传统疫苗之后的第二代疫苗，安全有效，方便联合免疫。1.6.5核酸疫苗核酸疫苗（DNA疫苗），是通过重组DNA技术将含有编码蛋白基因序列的质粒载体，经过肌肉注射等方法直接导入宿主细胞，经由宿主内源性表达抗原蛋白，诱导宿主细胞产生的产物被提呈给免疫系统，诱导机体产生对该抗原蛋白的高水平免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的。1996年世界卫生组织将其统一命名为核酸疫苗。比较其他疫苗，DNA疫苗免疫效果要好很多，即使免疫已有免疫力的个体仍然可发挥作用，诱导长期甚13 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用至是终生免疫。这种疫苗虽有很多优点如构建简便，方法单一，价格便宜，用量也少，贮藏、运输及使用都很便捷，但也急切需要解决很多的关键性问题。另外，核酸疫苗体[42]内表达效率较低，免疫保护力较弱，从而影响了核酸疫苗的免疫效果。1.6.6转基因植物疫苗转基因植物疫苗是用新型分子材料转基因植物作为生物反应器来表达外源蛋白，如[43]抗体、疫苗等。该疫苗已成为国际上植物基因工作的一个新的研究热点和发展趋势。转基因植物疫苗是利用植物基因工程技术结合机体免疫原理，生产出能诱导机体获得特异性抗病能力的疫苗。该疫苗较传统疫苗制备简易，使用便捷，能够直接使用；生产成本不高，适合大规模生产，储存和运输也很方便；安全性也不错。另外，该疫苗还能在通过有效的翻译后进行加工，并依然保持自然状态下的免疫原性；易于刺激产生很强的粘膜免疫反应；直接口服的给药方式接种机体也是跟安全有效，同时还可以诱导粘膜和全身产生免疫应答。宋长征等利用转基因马铃薯表达AIV的HA蛋白，结果证明，用转[44]基因马铃薯生产口服AIV疫苗具有很广阔的前景。1.7禽流感的防治禽流感病毒自1878年发现以来，医学科学发展和进步的脚步较快，但是还是无法掌握能够完全治疗和预防AIV的方法，当前仅仅只能通过消毒，隔离和大量扑杀病畜禽来防止病毒的扩散，因此，高致病性禽流感暴发的地区，经济损失也相应巨大常会比较严[45]重。1.7.1禽间禽流感防制1.7.1.1生物安全措施[46]生物安全是预防禽流感病毒的第一道防线。加强消毒措施，养鸡场门外应设有消毒池和紫外线消毒室，对一切进出入养殖场的车辆进行喷水消毒，人员进行紫外线消毒，将传染源与鸡舍隔离开。倡导科学化养殖，改变传统养殖观念，大力倡导规模化现代化养殖，养殖场的环境应保证干燥、通风、卫生、规范，适合鸡体健康成长发育。严格实14 新疆农业大学硕士学位论文行的免疫制度，确定科学合理的免疫方案，强化免疫，保证鸡群免疫率达100%。1.7.1.2免疫预防近些年来，在禽流感疫苗领域上研发了很多新型的疫苗，但就为适应目前我国国情而言，禽流感的免疫仍然主要是使用灭活疫苗。很多的研究和防控实践证明，有效地免疫禽流感疫苗能够增强家禽的抵御疾病的能力，隔断病毒的传播蔓延，免疫家禽被强度入侵感染后，病毒排出量也能够有大幅度的降低，病毒发生自燃突变的机率也相应降低，[47]传播的可能性也会减少很多，从而减小了疫病向禽群和人传播的风险。目前，我国已研制出的禽流感疫苗有H5、H7、H9亚型，其中常用的单价灭活苗是H5N1亚型高致病性禽流感疫苗，双价灭活疫苗是H5+H9灭活疫苗。因禽流感疫病我国列为一类疫病，所以应在当地动物卫生管理部门指导下强制执行疫苗接种，并定期按照国家规定进行血清学监测，从而确保疫苗的免疫预防效果真实可靠。1.7.1.3消毒用得当的消毒措施，也可以杀死环境中的病毒，这主要是因为禽流感病毒在外界环境中存活能力较差，且对消毒剂敏感，从而能够达到预防的效果。平时，可根据流感病毒的稳定性对不同消毒对象选择不同的消毒方式。因流感病毒对热比较敏感，因此可以定期对圈舍进行阳光沐浴，医疗器械可加热消毒或可在紫外线下消毒。再根据流感病毒对消毒剂敏感的特点，平时要定期注重对圈舍、栏舍、道路、鸡群进行喷水/雾消毒，一般实际养殖中普遍会用醛类和酚类消毒液、含氯消毒剂、氧化剂及碱类等消毒剂。此外，对饲料、饮水、用具及空气也要进行定期消毒，切断所有可能的传染源。1.7.2人间禽流感的防制目前，由于禽流感的防治还没有特别的好方法，为此控制禽流感在禽类间的传播显得尤为重要，所以预防人间禽流感普遍采用消灭传染源为主的综合性防制措施。要重视流感监测，特别是重视人间和禽类之间禽流感疫情的监测，密切跟踪AIV的变化。要管理好传染源，对已感染病毒要及时处置，疑似家禽应当及时做好隔离、加强免疫及补免等工作；要切断传播途径，尽量避免与禽类接触，做好自身卫生消毒，加强动物检疫，严防疫情传入；要保护好易感人群，不仅要做好自我保护，还应加强疫苗免疫；要做好15 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用药物预防，尤其是对与病毒有近距离接触的人员都需要进行药物预防，如口服金刚烷胺；要提高机体免疫力，平时注重进行一定的锻炼，保证能适当休息，不宜过度劳累，始终保持较好的免疫力，也可以摄入维生素C，增强机体的抵抗力；最后还要加强教育宣传，充分利用媒体等多种方式开展广泛宣传预防禽流感相关知识，增强自我保健意识，促进良好卫生习惯的养成。1.8研究的目的意义当前库尔勒地区蛋鸡存栏量比较大，多以农村小规模饲养为主，条件较差，造成病毒扩散风险加大；同时国家疫病扑杀、补偿措施不完善，经济损失大，给人的生命财产带来威胁。要坚持科学免疫，规范饲养，强化监督，才能够有效防治禽流感。目前，在生产上使用的疫苗主要是重组禽流感（H5N1Re-6）灭活疫苗、禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗和禽流感-新城疫重组二联活疫苗，但在实际免疫过程中，大部分养殖者尤其是养殖场偏爱单价灭活疫苗，不愿选择双价灭活疫苗和禽流感-新城疫二联活疫苗，甚至对这两种疫苗拒绝免疫，免疫程序混乱不科学，使禽流感的防控工作遇到很多的难题。为能解决这一问题，确保本地禽流感预防工作有效开展，优化最佳的禽流感免疫程序显得尤为重要。本研究拟通过使用哈药集团生物疫苗有限公司生产的重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）、乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂生产的禽流感二价灭活疫苗（H5N1Re-6株+H9N2Re-2株）和哈尔滨维科生物技术开发公司生产的禽流感-新城疫重组二联活疫苗（Rlh5-6），对库尔勒市某养鸡场的部分蛋鸡以不同时间免疫接种，进行抗体效价的跟踪监测，筛选最佳首免时间和免疫疫苗种类，优化适合本地蛋鸡H5及H9禽流感疫苗的免疫程序，并在本市六个乡镇进行推广应用。16 新疆农业大学硕士学位论文第2章高致病性禽流感疫苗免疫程序的优化目前，库尔勒市预防禽流感免疫接种的疫苗主要是重组禽流感H5N1灭活疫苗、禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗和禽流感-新城疫重组二联活疫苗，但由于防疫程序混乱不科学，造成人力、物力成本较高，使得禽流感的防控上存在很多问题。本试验通过对库尔勒地区某养鸡场的部分蛋鸡以不同时间免疫接种这三种疫苗，并进行抗体效价跟踪监测，比较其免疫效果，优化最佳的免疫程序。2.1材料和方法2.1.1疫苗（1）重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型，Re-6株）：生产批号：2012027，由哈药集团生物疫苗有限公司；（2）禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗（H5N1Re-6株+H9N2Re-2株）：生产批号：2013095，由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂生产；（3）禽流感-新城疫重组二联活疫苗：生产批号：2014057，由哈尔滨维科生物技术开发公司。2.1.2抗原和阳性血清（1）禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验检测抗原及阳性血清：生产批号：2014001、2014003，由哈尔滨维科生物技术开发公司生产；（2）禽流感病毒H9亚型血凝抑制试验检测抗原及阳性血清：生产批号：2014001、2014003，由哈尔滨维科生物技术开发公司生产；（3）新城疫血凝抑制试验检测抗原及阳性血清：生产批号：2014003、201301，由中国兽医药品监察所生产。2.1.3试验仪器17 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用表2-1试验仪器清单Table2-1Instrumentlist名称规格用途离心机用于离心红细胞和离心血清冰箱用于存放抗原和血清振荡器用于振荡96孔V型板离心管用于离心血清V型板96孔用于稀释血清移液器单道、八道用于加样、稀释血清枪头用于加样、稀释血清集液槽用于盛PBS液及配制4单位抗原温箱用于保持实验环境温度2.1.4试验鸡群来自于库尔勒市某养鸡场的1000只一日龄未注射疫苗的健康蛋雏鸡，从库尔勒市某种鸡孵化场购进。此养鸡场的种鸡，通过检测血清中禽流感和新城疫抗体，挑选之前接种过H5、H9亚型禽流感和IV系新城疫疫苗，并在免疫有效保护期的鸡群所产种蛋孵出的雏鸡为试验用。2.2方法2.2.1鸡群分组及免疫程序试验鸡群随机分4个组，对照组100只，第1组为重组禽流感病毒（H5N1）灭活苗免疫组300只，第2组为禽流感（H5+H9）二价灭活苗免疫组300只，第3组为禽流感-新城疫重组二联活苗免疫组300只，第1、2、3组根据首免时间又各分为3个小组，100只/组。免疫时，其他疾病疫苗按照养鸡场常规进行。试验鸡群单独一圈，每一小组单独一笼，隔离饲养，统一饲喂泰昆蛋鸡饲料。整个试验场所配有固定的饲养管理者封闭管理，严格执行定期消毒制度，禁止其他无关人员出入。具体免疫程序见表2-2。18 新疆农业大学硕士学位论文表2-2十组试验鸡群的免疫程序Table2-2Immunizationprogramsofchickensfortengroups首免二免组别AI疫苗日龄免疫方法日龄免疫方法(d)（d）对照APBS组B重组AI(H5N1)灭活疫苗14颈部皮下注射0.3ml/只28肌肉注射0.5ml/只1C重组AI(H5N1)灭活疫苗21颈部皮下注射0.3ml/只35肌肉注射0.5ml/只D重组AI(H5N1)灭活疫苗28颈部皮下注射0.3ml/只42肌肉注射0.5ml/只EAI(H5+H9)二价灭活疫苗14颈部皮下注射0.3ml/只28肌肉注射0.5ml/只2FAI(H5+H9)二价灭活疫苗21颈部皮下注射0.3ml/只35肌肉注射0.5ml/只GAI(H5+H9)二价灭活疫苗28颈部皮下注射0.3ml/只42肌肉注射0.5ml/只H禽-新重组二联活疫苗14点眼滴鼻2羽份/只28肌肉注射2羽份/只3I禽-新重组二联活疫苗21点眼滴鼻2羽份/只35肌肉注射2羽份/只J禽-新重组二联活疫苗28点眼滴鼻2羽份/只42肌肉注射2羽份/只2.2.2采血时间试验对照组和九个疫苗免疫小组分别在鸡群1日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、56日、63日、70日、77日、84日、126日龄定期采血检测抗体。从翅静脉采血，分离血清检测抗体。抽检率：30%。2.2.3血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验按照国家质量监督检验检疫总局发布的《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T18936-2003）进行。2.2.4试验结果判定HA试验：将反应板倾斜60度，观察红细胞是否能够出现泪滴状流滴，完全无泪滴状流淌的抗原或病毒最高稀释倍数为血凝效价。HI试验：以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价。试验成立需满足以下条件，当阳性对照孔血清的HI效价与已知效价误差小于1个滴度，阴性对照孔血清的HI滴度小于2（log2）。结果判定的原则为，被检血清HI效价小于或等于319 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用（log2）判为阴性；等于4（log2）判为可疑（可疑样品应重检，重检效价大于或等于4（log2）判为阳性，小于或等于3（log2）判为阴性）；大于或等于5（log2）判为阳性。2.2.5高致病性禽流感最佳初免日龄的确定用三种禽流感灭活疫苗免疫鸡群，分别在1日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、56日、63日、70日、77日、84日、126日龄定期采血监测禽流感H5、H9和新城疫抗体水平。对于每种疫苗不同首免时间免疫的三个试验组的抗体水平结果进行统计学显著性分析，确定高致病性禽流感最佳初免日龄。2.2.6高致病性禽流感最佳疫苗的选定用三种AI灭活疫苗在最佳初免日龄免疫，分别在1日、7日、14日、21日、28日、35日、42日、49日、56日、63日、70日、77日、84日、126日龄定期监测禽流感H5、H9和新城疫抗体水平。研究所使用的三种禽流感疫苗免疫鸡的免疫抗体水平和免疫抗体的持续时间，分析不同剂型禽流感疫苗的免疫保护水平和持续保护期，确定最佳疫苗免疫,制定适合本地的蛋鸡高致病性禽流感免疫程序。2.2.7免疫程序的应用选择库尔勒市英下乡、兰干乡、哈拉玉宫乡、阿瓦提乡、塔什店镇、西尼尔镇六个乡镇的某蛋鸡场作为试验场，对优化的免疫程序进行推广应用。2.2.8数据处理实验结果以`X±SD表示，实验数据采用统计软件SPSS18.0对检测的数据进行t检验分析三种疫苗免疫鸡群各个时期HI抗体效价的统计学差异。（参见表2-4至2-9）。20 新疆农业大学硕士学位论文2.3试验结果与分析2.3.1母源抗体水平由表2-3和图2-1中可以看出，在1日龄时，空白对照组鸡群母源抗体水平比较低，抗体滴度均数为4.07±1.51（log2），7日龄时达到高峰期，峰值平均效价为6.97±1.56（log2），与1日龄母源抗体水平相差近3个滴度。14日龄时，母源抗体效价下降至5.17±1.56（log2），21日龄时降为3.8±1.37（log2），28日龄时降至最低0.2±0.48（log2），基本上不具有免疫保护力。表2-3不同日龄雏鸡母源抗体监测结果（n=30,`X±SD）Table2-3Theresultofmaternalantibodiesindifferentday-oldchicks组别生长周期（d）171421283542495663707786126A4.07±1.516.97±1.565.17±1.563.8±1.370.2±0.480000000008765对照组4）log2321抗体效价（0171421283542495663707786126生长周期（d）图2-1不同日龄雏鸡母源抗体水平曲线图Fig2-1Thegraphofmaternalantibodylevelsindifferentday-oldchicks2.3.2不同日龄鸡免疫重组AI(H5N1)灭活疫苗H5抗体水平的检测由表2-4和图2-2可以看出,14日龄首免重组AI（H5N1）灭活疫苗后H5抗体滴度呈下降趋势，21日龄时最低，抗体滴度分别为2.13±1.36（log2），后开始上升，21 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用28日龄时H5抗体水平可达4（log2）以上，56日龄时（即二次免疫28日后）H5抗体滴度达到了最高峰8.1±1.12（log2），随后逐渐下降。21日龄首免重组AI（H5N1）灭活疫苗7日后，H5抗体滴度较低在1.3（log2）左右，35日龄时可监测出H5抗体，63日龄时（即二免28日后），H5抗体滴度可高达到8（log2）以上，之后开始降低。28日龄首免重组AI（H5N1）灭活疫苗时H5抗体滴度最低，为0.2±0.48（log2），之后逐渐上升，70日龄时（即二免28日后），H5抗体滴度达到了较高水平，为8.17±1.18（log2），然后开始下降。根据统计学t检验，分别在14日龄、21日龄、28日龄免疫重组AI（H5N1）灭活疫苗，14日龄首免的H5抗体水平结果在28日龄时分别与21日、28日龄首免的抗体水平结果差异显著（P<0.05）。从本次实验结果分析，禽流感重组AI（H5N1）灭活疫苗的最佳首免时间以14日龄为宜。图2-2不同日龄免疫重组AI(H5N1)灭活疫苗H5抗体水平曲线图Fig2-2ThegraphofH5antibodylevelsforinactivatedvaccineAI(H5N1)indifferentday-oldchicks22 新疆农业大学硕士学位论文表2-4不同日龄免疫重组AI（H5N1）灭活疫苗H5抗体效价监测结果（n=30,`X±SD）Table2-4TheresultsofH5antibodylevelsforinactivatedvaccineAI(H5N1)indifferentday-oldchicks生长周期（d）组别171421283542495663707786126B4.13±1.666.93±1.764.97±1.632.13±1.364.47±1.225.77±1.437.1±1.697.7±1.48.1±1.127.73±1.287.37±1.437±1.746.8±1.455.23±1.55b1C4±1.556.97±1.774.97±1.593.83±1.391.2±1.134.17±1.156.03±1.167.2±1.797.5±1.338.03±1.167.87±1.227.7±1.247.67±1.276.37±1.38abD4.07±1.786.97±1.735.13±1.483.87±1.330.2±0.484.13±4.575.83±1.65.43±1.526.83±1.467.3±1.348.17±1.187.87±1.117.5±1.336.83±1.37注：同列数据标有不同字母表明差异显著（P﹤0.05）。B、C、D分别为第14日、21日、28日龄首免重组AI（H5N1）灭活疫苗组。23 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用2.3.2不同日龄免疫AI(H5+H9)二价灭活疫苗免疫抗体水平选择14日龄、21日龄、28日龄分别首免AI（H5+H9）二价灭活疫苗，按照2-2免疫程序对鸡群进行第二次免疫，免疫H5抗体检测结果见表2-5和图2-3,H9抗体检测结果见表2-6和图2-4。由表2-5和图2-3可以看出，分别在14日龄、21日龄、28日龄三个不同日龄首免AI（H5+H9）二价灭活疫苗后，首免时H5抗体滴度均在逐渐下降，首免7日后降到最低均为2（log2）左右，后开始上升，二次免疫28日后，抗体滴度上升至最高点，均为8（log2）左右，之后又开始下降。根据统计学t检验，分别在14日龄、21日龄、28日龄首免AI（H5+H9）二价灭活疫苗，14日龄首免的H5抗体水平结果在28日龄时分别与21日、28日龄首免的抗体水平结果差异显著（P<0.05）。图2-3不同日龄免疫AI(H5+H9)二价灭活疫苗H5抗体水平曲线图Fig2-3ThegraphofH5antibodylevelsforbivalentvaccine(H5+H9)indifferentday-oldchicks24 新疆农业大学硕士学位论文表2-5不同日龄免疫AI(H5+H9)二价灭活疫苗H5抗体检测结果（n=30,`X±SD）Table2-5TheresultsofH5antibodylevelsforbivalentvaccine(H5+H9)indifferentday-oldchicks生长周期（d）组别171421283542495663707786126E4.17±1.77.07±1.665.07±1.312.17±1.514.43±1.35.8±1.567.13±1.727.73±1.418.03±1.357.83±1.497.33±1.457.07±1.746.6±1.225.43±1.5d2F3.97±1.636.83±1.215.1±1.423.87±1.591.3±1.214.23±1.526.1±1.277.27±1.867.23±1.38.07±1.267.9±1.37.77±1.197.2±1.456.3±1.64cdG4.17±1.497±1.555.07±1.483.77±1.630.3±0.654.17±1.565.67±1.596.5±1.615.33±1.377.27±1.398.23±1.147.9±1.187.53±1.386.73±1.68注：同列数据标有不同字母表明差异显著（P﹤0.05）。E、F、G分别为第14日、21日、28日龄首免AI(H5+H9)二价灭活疫苗组。25 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用由表2-6和图2-4可以看出，在免疫接种AI（H5+H9）二价灭活疫苗前，能够检测出H9抗体，在14、21、28日龄首免一周后，抗体效果有所下降，后又成上升状态，二次免疫后，各组H9抗体均在6（log2）左右，之后上升较快，二次免疫35日后可达高峰9（log2）以上，而且维持时间较长，126日龄时仍在8（log2）以上。通过本实验分析，既要避免母源抗体的高峰期，又不能使免疫抗体迟于低于保护的临界值，14日龄时首免AI（H5+H9）二价灭活疫苗为最佳初免日龄。图2-4不同日龄免疫AI（H5+H9）二价灭活疫苗H9抗体水平曲线图Fig2-4ThegraphofH9antibodylevelsforbivalentvaccine(H9)indifferentday-oldchicks26 新疆农业大学硕士学位论文表2-6不同日龄免疫AI（H5+H9）二价灭活疫苗H9抗体监测结果（n=30,`X±SD）Table2-6TheresultsofH9antibodylevelsforbivalentvaccine(H9)indifferentday-oldchicks生长周期（d）组别171421283542495663707786126E2.8±1.581.13±0.960.37±0.140.48±0.223.21±1.936.83±2.527.71±1.649.13±1.388.97±1.438.76±1.128.62±1.038.37±0.868.21±0.688.12±0.472F3.23±0.822.03±0.70.73±0.050.23±0.130.15±0.113.24±1.885.58±1.116.48±1.729.02±0.678.77±1.298.53±1.168.34±0.738.11±1.738.09±0.73G2.83±1.872.17±1.20.47±0.190.16±0.120.09±0.020.19±0.673.27±2.215.91±2.697.52±2.089.13±1.658.23±1.218.15±0.878.02±0.697.97±0.37注：E、F、G分别为第14日、21日、28日龄首免AI(H5+H9)二价灭活疫苗组。27 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用2.3.3不同日龄首免禽流感-新城疫重组二联活疫苗免疫抗体水平选择14日龄、21日龄、28日龄分别首免禽流感-新城疫重组二联活疫苗，按照2-2免疫程序对鸡群进行第二次免疫，免疫H5抗体检测结果见表2-7和图2-5,ND抗体检测结果见表2-8和图2-6。从表2-7和图2-5可以看出，在14日龄、21日龄、28日龄以滴鼻点眼2头份禽流感-新城疫重组二联活疫苗后，28日后H5抗体效价快速上升4个滴度，可高达9（log2）以上，但只在短时间上升后，就快速下降，三周左右下降至6（log2），二次免疫50日龄后基本降为临界保护值5（log2）以下。图2-5不同首免时间免疫禽流感-新城疫二联活疫苗H5抗体水平曲线图Fig2-5ThegraphofH5antibodylevelsforbivalentvaccine(AIVandNDV)indifferentday-oldchicks28 新疆农业大学硕士学位论文表2-7不同首免时间免疫禽流感-新城疫二联活疫苗H5抗体监测结果（n=30,`X±SD）Table2-7TheresultsofH5antibodylevelsforbivalentvaccine(AIVandNDV)indifferentday-oldchicks生长周期（d）组别171421283542495663707786126H4.16±1.487.02±1.364.98±1.422.8±1.465.16±1.387.02±1.467.13±1.548.88±1.389.12±1.426.14±1.555.08±1.343.12±1.480.2±1.360f3I4.08±1.526.97±1.684.96±1.48±3.16±1.562.02±1.466.08±1.387.34±1.688.68±1.429.16±1.559.66±1.346.36±1.485.14±1.562.8±1.480efJ3.99±1.666.86±1.485.02±1.343.64±1.372.32±1.680.3±1.554.86±1.426.28±1.328.18±1.348.68±1.589.12±1.3646.18±1.634.82±1.520注：同列数据标有不同字母表示差异显著（P﹤0.05）。H、I、J分别为第14日、21日、28日龄首免禽流感-新城疫重组二联活疫苗组。29 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用由表2-8和图2-6可以看出在免疫接种禽流感-新城疫重组二联活疫苗前，能够检测出ND抗体，在14日龄时下降接近至0。在14、21、28日龄首免，免疫后7～14日ND抗体快速升高，抗体效价由免后7日的1.8（log2）左右升至14日5.7（log2），但未达到高峰；二次免疫一周后，各组ND抗体均在6（log2）左右，之后上升较快，二次免疫四周后可达高峰9（log2）以上，但持续时间短，至二免后五周抗体水平开始降低至临界水平，平均值为5.2（log2）；免疫42日HI抗体下降至4（log2）以下。图2-6不同首免时间免疫禽流感-新城疫二联活疫苗ND抗体水平曲线图Fig2-6ThegraphofNDantibodylevelsforbivalentvaccine(AIVandNDV)indifferentday-oldchicks30 新疆农业大学硕士学位论文表2-8不同首免时间免疫禽流感-新城疫二联活疫苗ND抗体监测结果（n=30,`X±SD）Table2-8TheresultsofNDantibodylevelsforbivalentvaccine(AIVandNDV)indifferentday-oldchicks生长周期（d）组别171421283542495663707786126H7.8±1.344.7±1.361.2±1.281.8±1.465.7±1.326.02±0.367.13±1.548.96±1.389.12±1.425.14±1.553.88±1.343.12±1.480.8±1.3603I7.6±1.464.6±1.281.2±1.340.26±1.551.82±1.465.68±1.46.34±1.558.68±1.429.16±1.559.16±1.345.36±1.484.14±1.552.8±1.480J7.8±1.464.6±1.441.1±1.560.24±1.3702.3±1.555.86±1.426.28±1.358.18±1.349.1±1.349.12±1.365.18±1.634.18±1.520注:H、I、J分别为第2、3、4周龄首免禽流感-新城疫二联活疫苗组。31 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用2.3.3高致病性禽流感最佳疫苗选择选择14日龄首免重组AI（H5N1）灭活疫苗、AI（H5+H9）二价灭活疫苗、禽流感-新城疫重组二联活疫苗，按照2-2免疫程序进行加强免疫，免疫抗体检测结果见表2-9和图2-7。由表2-9和图2-7可以看出，14日龄首免重组AI（H5N1）灭活疫苗和AI（H5+H9）二价灭活疫苗后，21日龄时最低，后开始上升，28日龄时H5抗体水平可达4（log2）以上，56日龄时（即二免28日后）H5抗体滴度达到了最高峰，分别为8.1±1.12（log2）和8.03±1.35（log2），随后逐渐下降。21日龄首免两种灭活疫苗7日后，H5抗体滴度较低均在1.3（log2）左右，35日龄时可监测出H5抗体，63日龄时（即二免28日后），H5抗体滴度可高达到8（log2）以上，之后开始降低。28日龄首免两种灭活疫苗时H5抗体滴度最低，分别为0.2±0.48（log2）和0.3±0.65（log2），之后逐渐上升，70日龄时（即二免28日后），H5抗体滴度达到了较高水平，分别为8.17±1.18（log2）和8.23±1.14（log2），然后开始下降。根据统计学t检验，在14日龄首免两种疫苗，14日后二次免疫的H5抗体水平结果差异不显著（P﹥0.05），两种疫苗抗体水平变化不大。而在14日龄首次接种禽-新重组二联活疫苗后，28日后H5抗体效价快速上升4个滴度，可高达9（log2）以上，但只在短时间上升后，便快速下降，三周后下降至6（log2），二次免疫50日龄后基本降为临界保护值5（log2）以下，抗体效价维持时间较短。从以上实验结果分析，两种灭活疫苗的免疫抗体效价结果差异不大，禽流感-新城疫重组二联活疫苗免疫抗体效价维持时间较短，根据实际养殖情况，建议使用二价灭活疫苗，成本低且能预防禽流感两种亚型。因此，优化出预防本地区禽流感的最佳免疫程序为：在14日龄对蛋鸡进行首次免疫AI（H5+H9）二价灭活疫苗，颈部皮下注射0.3ml/只，28日龄加强免疫，腿肌注射0.5ml/只，之后每隔四个月加强免疫一次。32 新疆农业大学硕士学位论文表2-9最佳首免时间免疫三种禽流感疫苗H5抗体监测结果（n=30,`X±SD）Table2-9TheresultsofH5antibodyforthreeAIvaccinesinthebestfirstimmunetime生长周期（d）组别1714212835424956637077861261B4.13±1.666.93±1.764.97±1.632.13±1.364.47±1.225.77±1.437.1±1.697.7±1.48.1±1.127.73±1.287.37±1.437±1.746.8±1.455.23±1.552E4.17±1.77.07±1.665.07±1.312.17±1.514.43±1.35.8±1.567.13±1.727.73±1.418.03±1.357.83±1.497.33±1.457.07±1.746.6±1.225.43±1.53H4.16±1.487.02±1.364.98±1.422.8±1.465.16±1.387.02±1.467.13±1.548.88±1.389.12±1.426.14±1.555.08±1.343.12±1.480.2±1.360注：B为第14日龄首免AI（H5N1）单价灭活疫苗组，E为第14日龄首免AI（H5+H9）双价灭活疫苗组，H为第14日龄首免禽流感-新城疫二联活疫苗组。33 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用图2-7最佳首免时间免疫三种禽流感疫苗H5抗体水平曲线图Fig2-7ThegraphofH5antibodyforthreeAIvaccinesinthebestfirstimmunetime2.4讨论2.4.1母源抗体水平对H5抗体水平的影响通过本次试验我们可以看出，蛋鸡1日龄时母源抗体平均水平比较低，7日龄时达到高峰期，比1日龄母源抗体水平高出近3个滴度。说明接种禽流感免疫后的种鸡体内产生的抗体会经过卵黄传至雏鸡，起到了天然被动免疫的作用。雏鸡出壳后，随着生长，对体内卵黄逐渐吸收，获取大量的抗体，使母源抗体效价在雏鸡刚出壳没几天就呈现上升的趋势，在6～7日龄时得到最充分的吸收，当卵黄量逐渐下降时，母源抗体水平也跟着雏鸡日龄的增加而快速下降，至28日龄时母源抗体滴度降到了最低（0.2～0.28log2），基本上不具有什么免疫保护力。从本实验母源抗体的检测结果可以的得知，在1日龄时，空白对照组鸡群母源抗体水平比较低，抗体滴度均数为4.07±1.51（log2），7日龄时达到高峰期，峰值平均效价为6.97±1.56（log2），与1日龄母源抗体水平相差近3个滴度。随着雏鸡日龄的增加H5亚型禽流感母源抗体效价逐渐下降，14日龄时，母源抗体效价下降至5.17±1.56（log2），21日龄后降为4（log2）以下，28日龄时降至最低0.2±0.48（log2），基本上不具有免疫保护力。在雏鸡的不同日龄，其H5亚型禽流感母源抗体对H5亚型疫34 新疆农业大学硕士学位论文苗免疫抗体的干扰作用大小也是不同的。因而，要科学合理地选定禽流感免疫的首免日龄，必须考虑既要避免母源抗体对免疫效果的影响,又不能使机体处于免疫空白期。相关的研究资料表明，禽流感抗体效价最低保护临界值是4～6（log2），且不能低于4（log2）[48]。2.4.2最佳初免日龄的选择蛋鸡免疫日龄的选择与免疫抗体水平的高低紧密相关。因为使用的是油乳剂灭活疫[49]苗，诱发免疫的时间较长可达5～7天，因此，蛋鸡免疫禽流感灭活疫苗7日后，才可刺激机体产生H5抗体。本实验中，14日龄时，蛋鸡体内母源抗体水平较好，当此时接种禽流感灭活疫苗时，母源抗体具有一定的保护力，对疫苗产生的抗体水平会有一定干扰，从而使H5抗体水平在接种疫苗7日后有所降低，随后开始上升。有相关的试验结果证明，母源抗体水平达6（log2）左右时，AI的保护率能够达到100%；达4（log2）时，保护率降为50%；在2（log2）时，免疫保护率仅有20%，母源抗体水平最低保护临[48]界值为4～6（log2）之间，且须>4（log2）。21日龄和28日龄免疫禽流感灭活疫苗时，因受母源抗体的干扰，疫苗诱导免疫抗体还未产生，此时母源抗体水平比最低保护临界值还要低，保护力较弱，容易出现免疫空白期。在14日龄时首免禽流感疫苗与21日龄和28日龄首免的免疫程序相比，不仅避免了母源抗体的高峰期，又使雏鸡母源抗体水平在降至最低保护临界值的过程中不易出现免疫空白期，能够更好的预防禽流感的发生。在实际生产中，我市很多养殖户习惯采取在21日龄或35日龄后进行禽流感疫苗的首免，个别养鸡户选择7日龄首免，这都是不科学的。接种疫苗过早，往往会由于雏鸡免疫器官发育不完善和抗原与母源抗体发生干扰，达不到理想的免疫效果。而接种疫[50]苗太晚，则往往会使机体产生抗体比较缓慢，达不到抗体的保护水平。2.4.3最佳免疫疫苗的选择本试验中，重组AI（H5N1）灭活疫苗和AI（H5+H9）二价灭活疫苗免疫后的H5抗体水平t检验结果没有差异，说明这两种疫苗免疫后产生的抗体消长规律差不多，使用的效果差异不明显。两种疫苗在免疫2周后均可具有一定的保护力，在加强免疫4周后，免疫效果较好，鸡群保护力能达到较好的免疫保护。实验鸡群免疫禽-新重组二联35 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用活疫苗后，能够取得较高的H5抗体滴度，但只在短时间上升后，就快速降低，三周内下降3个滴度，不能像灭活疫苗维持长时间、高水平的抗体效价。免疫接种二价灭活疫苗后H9抗体很高，免疫效果较好。在实际养殖中，建议首选禽流感二价灭活疫苗，既方便又经济。有许多实验研究表明，AI（H5+H9）二价灭活疫苗的各项指标都与重组AI（H5N1）灭活疫苗和重组H9N2灭活疫苗基本一致，接种二价灭活疫苗诱导机体产生的抗体和免疫持续期均比已经获得生产文号的自然株H5N2和H9N2灭活疫苗高。使用该疫苗，能够同时预防我国当前主要流行的2种亚型的禽流感，不仅能够使养禽业者的劳动量降低，还能使养禽业的生产成本减少，是养禽业预防禽流感疫病的一种急需理想疫苗。2.4.4H5抗体在鸡体内维持时间的分析通过本次试验结果可以看出，不论是重组AI（H5N1）灭活疫苗还是AI（H5+H9）二价灭活疫苗，在第一次免疫后抗体水平具有明显提高，但是抗体滴度还达不到具有很好的保护力水平，为此需要进行第二次加强免疫后才会具有较高的保护力。根据两种疫苗免疫后产生的H5抗体水平曲线图可以看出，14日龄首免、28日龄加强免疫四周后（即第56日龄）H5抗体水平能够达到最高峰值8（log2）左右，而到126日龄时开始抗体水平开始下降，抗体滴度平均在5.23～5.43（log2），说明疫苗的保护力只能维持3～4个月，远远达不到疫苗厂家所说的5个月和6个月。只有在多次免疫[51]后，受免疫回忆反应的影响，抗体水平的上升速度比初次免疫快，且持续时间较长。根据蛋鸡的生长周期长的特点，建议14日龄首次免疫禽流感病毒疫苗，两周后加强免疫一次，之后每间隔3～4个月再进行加强免疫。2.4.5ND抗体在鸡体内维持时间的分析本实验检测的母源抗体水平，在1～7日龄期间高于4（log2）。一般认为，HI抗体滴度在4（log2）以上时对新城疫野毒入侵能起到一定的保护作用；小于4（log2）时，免疫保护力也会随之降低。通过该试验在不同阶段,对14日龄前没有免疫过任何疫苗也未进行任何药物治疗的雏鸡的母源抗体消长规律进行研究，结果发现雏鸡在14日龄前母源抗体都可以检测到，并在7日龄前具有免疫保护作用。但14日龄后，母源抗36 新疆农业大学硕士学位论文体逐渐降低，抗体效价在0.24～1.2（log2）范围内维持时间较短，此时,母源抗体不具有免疫保护作用了。因此，14日龄应为雏鸡的母源抗体有效保护期。故，14日龄为雏鸡的新城疫最佳首免日龄。当母源抗体水平较高时进行过早的首次免疫，疫苗与母源抗体会相互中和从而影响免疫效果和机体的免疫力，甚至有可能造成免疫无效,因此,一般情况下,14日龄前不建议过早免疫疫苗；然而在母源抗体水平过低或已消失时再进行首次免疫，又会造成抗体产生抗体较缓，使机体不能得到有效保护，还有可能感染强毒,因此,也不建议太晚免疫。2.5结论1.蛋鸡14日龄时首免免疫接种禽流感疫苗可以不仅避免了母源抗体的高峰期，又使雏鸡母源抗体水平在降至最低保护临界值的过程中不易出现免疫空白期，能够更好的预防禽流感的发生。2.蛋鸡接种AI（H5+H9）二价灭活疫苗免疫后能够取得较高的H5和H9抗体滴度，同时预防我国当前主要流行的2种亚型的禽流感，不仅能够使养禽业者的劳动量降低，还能使养禽业的生产成本减少，既简便又经济。3.优化本地蛋鸡较为理想的免疫方案是：14日龄时首免AI（H5+H9）二价灭活疫苗，颈部皮下注射0.3ml/只，28日龄加强免疫，肌肉注射0.5ml/只，之后每隔四个月加强免疫一次。37 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用第3章高致病性禽流感H5及H9免疫程序对库尔勒六乡镇的推广应用为进一步全面评估第2章优化免疫程序的可行性和科学性，本章重点选择库尔勒市英下乡、兰干乡、哈拉玉宫乡、阿瓦提乡、塔什店镇和西尼尔镇六个乡镇的某蛋鸡场作为试验场，使用AI（H5+H9）二价灭活疫苗接种蛋鸡，14日龄时首免，颈部皮下注射0.3ml/只，28日龄二次免疫，肌肉注射0.5ml/只，之后每隔四个月加强免疫一次的新免疫程序，进行推广应用及检测H5抗体水平。3.1材料与方法3.1.1材料3.1.1.1试验鸡群本市英下乡、兰干乡、哈拉玉宫乡、阿瓦提乡、塔什店镇和西尼尔镇六个乡镇的某蛋鸡场提供的接种过IV系新城疫疫苗的蛋鸡。3.1.1.2疫苗禽流感（H5+H9）二价灭活疫苗（H5N1Re-6株+H9N2Re-2株）：生产批号：2014027，生产厂家：乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂。3.1.1.3抗原和阳性血清禽流感病毒H5亚型血凝抑制试验检测抗原及阳性血清：生产批号：2014001、2014003，生产厂家：哈尔滨维科生物技术开发公司。3.1.1.4实验仪器见第二章2.1.3相关内容。3.1.2方法3.1.2.1样品采集在六个试验场地分别选择没有接种禽流感疫苗的14日龄蛋鸡，免疫AI(H5+H9)二价灭活疫苗，颈部皮下注射0.3ml/只，28日龄二次免疫，肌肉注射0.5ml/只，接种前38 新疆农业大学硕士学位论文以及接种后第四周,各乡镇畜牧兽医站组织人员随机采血，送至市畜牧兽医站疫情监测站实验室，进行禽流感抗体检测。3.1.2.2样品处理将各乡镇送检的试验场血液样本进行逐个编号，离心，留取上清液血清，保存至-20℃冰箱中待检。3.1.3试验方法及结果判定同第二章2.2.3和2.2.4相关内容内容3.1.4数据处理与分析实验数据采用SPSS18.0软件统计，不同乡镇禽流感抗体的差异用单因素方差（One-wayANOVA）进行显著性分析（参见表3-1、3-2）。3.2结果与分析3.2.12014年六个乡镇试验场的免疫情况对库尔勒市英下乡等六个乡镇2014年禽流感抗体情况进行分析，结果见表3-1。表3-12014年英下乡等六个乡镇禽流感免疫情况Table3-1Theresultofavianinfluenzaimmunizationforsixvillagesin2014免疫抗体效价抗体检出率免疫抗体合格乡镇检测样品数合格样品数（X±SD）（log2）（%）率（%）英下乡3002707.62±1.2995.090兰干乡2802607.24±1.4596.492.8哈拉玉宫乡2962607.11±1.2196.387.8阿瓦提乡2602557.85±1.3210098塔什店镇2782708.1±1.1510097.1西尼尔镇2702347.43±1.679786.6由表3-1可知，英下乡等六个乡镇试验场的禽流感免疫抗体检出率均能达到90%以上,差异不显著（P>0.05）。哈拉玉宫乡试验场的AI免疫抗体合格率最低（70%以上），39 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用其他乡镇试验场的禽流感免疫抗体合格率均能达到80%以上，达到了国家免疫方案中大[52]于70%的免疫合格标准。3.2.22015年六个乡镇试验场的免疫情况对库尔勒市英下乡等六个乡镇2015年禽流感抗体情况进行分析，结果见表3-2。表3-22015年英下乡等六个乡镇禽流感免疫情况Table3-2Theresultofavianinfluenzaimmunizationforsixvillagesin2015免疫抗体效价抗体检出率免疫抗体合格乡镇检测样品数合格样品数（X±SD）（log2）（%）率（%）英下乡2802568.02±1.5492.291.4兰干乡2962667.23±1.1687.789.9哈拉玉宫乡3002807.86±1.3596.193.2阿瓦提乡2682548.27±1.1410094.7塔什店镇2752618.31±1.3810094.9西尼尔镇2852647.69±1.4710092.7由表3-2可知，六个乡镇试验场的禽流感免疫抗体效价差别不大（P>0.05），平均值7.9（log2）；阿瓦提乡、塔什店镇和西尼尔镇试验场的AI抗体检出率均达100%，其他乡镇试验场的抗体检出率也可达90%以上；英下乡、哈拉玉宫乡和西尼尔镇试验场的免疫抗体可达90%以上，其他乡镇试验场的免疫抗体合格率平均可达88%以上，可以达[53]到统计学整体免疫抗体保护要求的80%以上的免疫保护水平。3.2.3推广前后六个乡镇试验场的禽流感免疫H5抗体水平比较第二章实验制定的蛋鸡高致病性禽流感免疫程序，于2014～2015年在本市英下乡等六个乡镇试验场推广应用，禽流感免疫情况评估结果和推广应用前2012～213年比较见表3-3。40 新疆农业大学硕士学位论文3-32012-2015年禽流感H5抗体水平评估结果（2012-2013年数据由库尔勒市畜牧兽医站化验室提供）Table3-3TheresultofH5antibodyforsixvillagesin2014(Thedataof2013to2015wasfromKORLAanimalhusbandryandveterinarystation)禽流感H5抗体水平（%）时间（年）英下乡兰干乡哈拉玉宫乡阿瓦提乡塔什店镇西尼尔镇201282.880.676.883.584.781.1201381.479.973.285.687.882.720149092.887.89897.186.6201591.489.993.294.794.992.7由表3-3可知，从六个试验场整体免疫H5抗体评估情况看，2014～2015年，英下乡等六个整体免疫H5抗体水平较2012～2013年度都有所增长，其中哈拉玉宫乡增长幅度较大，增长率可达20%以上，不仅远远超过了国家免疫方案中大于70%的免疫合格标[53]准，更达到统计学整体免疫抗体保护要求的80%以上的免疫保护水平，为本市防止禽流感疫情发生提供了有力的基础保障。3.3讨论3.3.1从推广应用检测结果可以看出，2014～2015年期间，使用本课题实验制定的免疫程序进行免疫后,免疫效果一致，不仅抗体合格率高于常规免疫的结果,而且试验场的H5亚型禽流感免疫抗体水平都在逐渐提升。而高水平的H5亚型禽流感免疫抗体是防御[54]H5亚型禽流感疫情发生的基本保障，这说明试验场预防和控制禽流感疫病的能力在增强，也说明该课题的研究成果对基层防疫工作具有一定的实践指导意义。3.3.2在这次推广应用的实验监测中，发现有的乡镇试验场如阿瓦提乡和塔什店镇试验场监测的H5亚型禽流感免疫抗体合格率增长幅度较慢，说明这两个试验场的免疫工作还有很大的提升空间。六个乡镇试验场免疫合格率增长幅度，与各试验场的各项防疫措施有一定的关系。试验中所选择的六个试验场都是规模养殖户，他们大部分是有经验的养殖户，个别是新进入养殖的养殖户，由于他们的饲养规模较大，很重视对动物的防疫很重视工作，能够积极进行防疫，有一定防疫措施，因此这六个试验场的养殖的蛋鸡抗体水平较高。41 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用3.3.3由于据试验前调查，我市大部分规模养殖户偏爱重组AI（H5N1）灭活疫苗，不愿使用AI（H5+H9）二价灭活疫苗，因此本次推广应用实验仅仅选用了规模养殖户，没有选择散养户。实际上，散养户大部分还是传统的养殖模式，养殖环境较差，防疫意识较淡薄，甚至会拒免高致病性禽流感疫苗。因此，想要体现第二章免疫程序在全市的整体免疫水平，也因考虑散养家禽的免疫效果。3.4库尔勒市蛋鸡群禽流感防控的建议疫苗免疫只是禽流感预防控制的最后一道防线，预防禽流感发生还应采用综合防控措施。根据本试验研究的结果和实际生产过程中的现状，提出了针对库尔勒市蛋鸡群禽流感防治的建议：3.4.1.养殖者应转变由传统散养模式向现代规模化饲养的观念转变，推行“自繁自养和全进全出”的饲养制度，不要将不同品种的家禽或畜禽混养。3.4.2.对圈舍严格执行定期消毒制度，养殖场出入口需设立消毒池和紫外线室，对外来人员和车辆进行必要消毒，生产中输运饲养和畜禽的车辆不得混用。免疫后的废弃物处理要按照无害化处理，不可乱丢，同时注意保护自身安全。3.4.3.当饲养家禽同批出笼后，禽舍应空置最少不低于3周时间。在空舍期间，严格按照禽舍清洁消毒程序清理禽舍；应使用两种以上消毒剂，彻底清除禽舍原残留，避免病原感染下一批家禽。3.4.4.对淘汰的患病鸡和死亡鸡坚持无害化处理，购置焚尸炉、高压灭菌器等设备，冷链设备保证疫苗质量。3.4.5.使用AI（H5+H9）二价灭活疫苗接种蛋鸡，14日龄时首免，颈部皮下注射0.3ml/只，28日龄二次免疫，肌肉注射0.5ml/只，之后每隔四个月加强免疫一次的免疫程序。3.4.6.进一步完善应急预案，加强高致病性禽流感监测和预警预报。加强活禽经营市场管理，规范活禽经营行为。加强防疫知识宣传，提高全社会防范意识。42 新疆农业大学硕士学位论文3.5小结本实验选择本市六个乡镇某蛋鸡场作为试验场，推广应用14日龄时首免AI（H5+H9）二价灭活疫苗，颈部皮下注射0.3ml/只，28日龄加强免疫，肌肉注射0.5ml/只，之后每隔四个月加强免疫一次的免疫程序。通过2014～2015年试验场禽流感整体免疫H5抗体水平评估，试验场整体免疫H5抗体水平较2012～2013年推广前有了大幅度增长，可以达到统计学整体免疫抗体保护要求的80%以上的免疫保护水平，进一步证实了本实验筛选出的禽流感免疫程序符合本地生产实际，可以在实际生产过程中大力推广应用。43 库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用第4章全文结论1．本实验制定的适合本地蛋鸡理想的免疫方案是：14日龄时首免AI（H5+H9）二价灭活疫苗，颈部皮下注射0.3ml/只，28日龄加强免疫，肌肉注射0.5ml/只，之后每隔四个月加强免疫一次，整个产蛋周期内都免疫效果都比较好。2．本实验对全市六个乡镇某蛋鸡场推广应用14日龄时首免AI（H5+H9）二价灭活疫苗，颈部皮下注射0.3ml/只，28日龄加强免疫，肌肉注射0.5ml/只，之后每隔四个月加强免疫一次的免疫程序。通过2014～2015年试验场禽流感整体免疫H5抗体水平评估，较2012～2013年推广前有了大幅度增长，可以达到统计学整体免疫抗体保护要求的80%以上的免疫保护水平，进一步证实了本实验筛选出的禽流感免疫程序符合本地生产实际，可以在实际生产中推广应用。44 新疆农业大学硕士学位论文附录AA.1pH值7.20.01mol/LPBS液配制（1）配制25倍PB称量2.74gNa2HPO4和0.79gNaH2PO4·H2O,加蒸馏水至100ml；（2）配制1倍PBS量取40ml25倍PB，加入8.5gNaCl,加蒸馏水至100ml；（3）用NaOH或HCl调pH值至7.2；（4）69Kpa15min高压灭菌或用微孔滤膜过滤除菌。（5）PBS一经使用，于2～8℃保存不超过3周。A.2阿氏（Alsevers）液称葡萄糖2.05g、柠檬酸钠0.8g、柠檬酸0.055g、氯化钠0.42g，加蒸馏水至100ml，加热溶解后调pH值至6.1,69Kpa15min高压灭菌，2～8℃保存备用。A.3制备非免疫鸡1%红细胞悬液采集至少3只无禽流感和新城疫等抗体的甲亢公鸡的血液与等体积PBS液混合，将混合液10ml装入带刻度离心管，配平后放入离心机中，经2000r/min，离心4min，用吸管吸去上清液与白细胞、弃去，将沉淀的红细胞加生理盐水洗涤，如此反复离心三次，第四次离心时2500r/min，离心5min，将最后一次离心后的红细胞泥，按1%的稀释度加入PBS液中稀释，2～8℃保存备用。A.4抗原配制冻干的抗原和标准阳性血清均按瓶签上规格标注的量，用PBS溶解。45 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库尔勒蛋鸡高致病性禽流感最佳免疫程序的研究及应用个人简历柳玲，女，汉族，1982年10月出生，中共党员，籍贯甘肃。毕业于新疆农业大学动物医学学院，在职兽医硕士。教育经历：2001—2005年毕业于新疆农业大学动物医学学院生物制品专业，本科，农学学士。工作经历：2006.3—2008.3月在库尔勒市畜牧兽医监督站从事动物防疫工作，助理兽医师。2008.4—2010.3月在库尔勒市动物卫生监督所从事行政执法工作，助理兽医师。2010.4—2010.11月在库尔勒市畜牧兽医局从事兽医监督工作，科员。2010.12—2011.10月在库尔勒市“热爱伟大祖国·建设美好家园”主题教育暨创先争优活动领导小组办公室从事信息宣传工作，科员。2013.11—至今在库尔勒市党的群众路线教育实践活动领导小组办公室、库尔勒市“访民情惠民生聚民心”活动领导小组办公室从事文件办理等综合性事务，科员。攻读硕士学位期间发表的论文：发表论文《库尔勒地区蛋鸡高致病性禽流感疫苗最佳免疫程序的研究及应用》到《新疆畜牧业》2016年第1期。52
