无选择标记抗晚疫病转基因马铃薯的获得

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分类号：Q37密级：公开UDC：学校代码：10127硕士学位论文论文题目：无选择标记抗晚疫病转基因马铃薯的获得英文题目：ObtainingofMarker-freeTransgenicPotatoResistanttoLateBlight学位类别：理学硕士研究生姓名：肖欢欢学号：201202213学科(领域)名称：遗传学指导教师：辛翠花职称：副教授协助指导教师：郭江波职称：教授2015年6月6日 内蒙古科技大学硕士学位论文摘要马铃薯是全球第三大重要农作物，仅次于小麦和玉米。由致病疫霉菌（Phytophthorainfestans）引起的晚疫病，是导致马铃薯减产最严重的病害之一，在世界上绝大多数马铃薯的栽培地区广泛传播。采用传统育种、化学农药等方法来防治马铃薯晚疫病虽然早有研究，但至今收效甚微。转基因技术的兴起为晚疫病的防治提供了新的锲机。本实验采用生物安全的转基因方法，将抗晚疫病基因R1、RB、R3a转化马铃薯栽培品种Desiree，获得生物安全的抗晚疫病转基因马铃薯。研究内容如下：1)无标记载体pMF-LIC构建。以引物OXN037/OXN038对质粒pJG100进行PCR扩增，获得LIC序列的片段，胶回收后与质粒pMF-GUS分别进行XbaⅠ/SacⅠ双酶切，回收片段用T4DNA连接酶连接，热激法转化大肠杆菌DB3.1，经菌落PCR、质粒PCR和质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切鉴定，成功构建了无标记植物表达载体pMF-LIC。2)抗晚疫病基因克隆到无标记载体上。分别用引物OXN045/OXN046、OXN051/OXN052、0XN093/OXN096从质粒pBINPLUS-R3a、pCLD04541-R1、pCLD04541-RB上PCR扩增出抗晚疫病基因R3a、R1、RB，同时用ApaI酶切载体pMF-LIC。用不依赖于连接反应的克隆（LIC）方法将抗晚疫病基因R3a、R1、RB分别克隆到无标记植物表达载体pMF-LIC上，热激法转化大肠杆菌TOP10，经菌落PCR、质粒PCR、质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切验证重组载体pMF-R1/RB/R3a构建成功。3)抗晚疫病基因工程农杆菌获得。通过三亲融合，在帮助菌HB101的帮助下将重组载体pMF-R1/RB/R3a转入农杆菌AGL0中，经过菌落PCR、质粒PCR、质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切鉴定，成功构建工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a。4)无选择标记抗晚疫病转基因马铃薯的获得。克隆的抗晚疫病基因R1、RB、R3a通过农杆菌介导的遗传转化方法分别转入马铃薯栽培品种Desiree中，经PCR初步检测出抗晚疫病转基因马铃薯植株。现已获得4株转R3a的阳性转基因马铃薯植株，R1和RB的转基因马铃薯植株正在进一步验证中。II 内蒙古科技大学硕士学位论文本实验获得的转基因马铃薯植株，为后续田间构建马铃薯抗晚疫病近等混合系提供了基础，为马铃薯晚疫病的持久防治提供了理论和实践基础。关键词：马铃薯；晚疫病；无标记；转基因III 内蒙古科技大学硕士学位论文AbstractPotatoistheworld’sthirdmostimportantfoodcrop,afterthewheatandrice.PotatolateblightcausedbyPhytophthorainfestansisoneofthemostseriousdiseasestodecreasethepotatoproduction,whichspreadwidelyinthevastmajorityofpotatocultivationareaintheworld.P.infestansisstilldifficulttocontrolbygeneticbreedingandchemicalmethodstoday.Transgenictechnologyprovidesanewchanceforthecontrolofthepotatocultication.Inthisresearch,R1,RBandR3awereseparatelytransferredintopotatocv.Desireebymarker-freetransgenicassay,andtheaimofthisresearchistoobtaintransgenicpotatoeswithbiologicalsafety.Themainresultsweredisplayedasfollows:1)Constructionofmarker-freevectorpMF-LIC.LICfragmentofplasmidpJG100amplifiedbyPCRwithprimersOXN037/OXN038wasdigestedwithXbaI/SacIandwasligatedtotheplasmidpMF-GUSdigestedwiththesameenzymes.ThentheligationproductsweretransformedintoE.coliDB3.1byheatshock.Thepositivemarker-freevectorpMF-LICwereverifiedbyPCRandenzymedigestions.2)Cloningofresistancegenesintomarker-freevector.Theresistancegenes(R3a,R1andRB)tolateblightwereamplifiedfromplasmidpBINPLUS-R3a,pCLD04541-R1andpCLD04541-RBwithprimersOXN045/OXN046,OXN051/OXN052and0XN093/OXN096respectively.ThelateblightresistancegenesR3a,R1andRBwereclonedintopMF-LICdigestedwithApaIthroughligationindependentcloning(LIC)technique,andthenweretransformedintoE.coliTOP10byheatshock.TherecombinantvectorpMF-R1/RB/R3awereverifiedbyPCRandenzymedigestions.Thismethodsverfiedthattheresistancegeneswrersuccessfullyclonedintovectormaker.3)ObtainingoftheengineeringAgrobacteriumtolateblight.TherecombinantplasmidpMF-R1,pMF-RBandpMF-R3aweretransformedintoAgrobacteriumAGL0withthehelpofstrainHB101.TheengineeringAgrobacteriumAGL0-pMF-R1,AGL0-pMF-RBandAGL0-pMF-R3awereconstructedsuccessfullyverfiedthroughPCRandenzymedigestion.IV 内蒙古科技大学硕士学位论文4)Developmentofthemarker-freetransgenicpotatoresistanttolateblight.ThegenesR3a,R1andRBresistanttolateblightweretransformedintopotatocv.DesireemediatedbyAgrobacteriumtumefaciens,and4plantletsofR3apositivetransgenicpotatoeswereobtainedandverifiedbyPCR.ThepositiveR1andRBtransgenicpotatoesarebeingfurthercharacterizedandverfied.ThetransgenicpotatoeswillbenefittheoreticalresearchandfieldpracticeforthepotatolateblightcontrolbyRgenepolycultureinthefieldinthefuture.KeyWords：Potato；Lateblight；Marker-free；TransgeneV 内蒙古科技大学硕士学位论文目录摘要................................................................................................................................IAbstract................................................................................................................................III引言...............................................................................................................................11文献综述...........................................................................................................................21.1马铃薯晚疫病概述.................................................................................................21.1.1马铃薯晚疫病的危害...................................................................................21.1.2马铃薯晚疫病的防治...................................................................................21.1.3转基因马铃薯的晚疫病抗性研究现状.......................................................31.1.4田间创建抗病基因近等混合系的基础.......................................................51.2不依赖连接的克隆方式.........................................................................................51.2.1LIC技术的基本原理.....................................................................................51.2.2LIC技术的优势.............................................................................................71.2.3三亲本融合...................................................................................................71.3农杆菌介导的植物转化.........................................................................................81.3.1农杆菌...........................................................................................................81.3.2Ti质粒............................................................................................................81.3.3农杆菌转化植物的过程...............................................................................91.3.4转基因植物中外源基因的检测.................................................................101.4转基因马铃薯的生物安全性评价和展望...........................................................111.5研究的目的及意义...............................................................................................121.5.1主要研究内容.............................................................................................121.5.2主要技术路线.............................................................................................122无标记载体pMF-LIC构建............................................................................................142.1实验材料...............................................................................................................142.1.1工具酶及主要抗生素和激素.....................................................................14 内蒙古科技大学硕士学位论文2.1.2菌株及质粒.................................................................................................142.1.3引物.............................................................................................................142.1.4培养基配置.................................................................................................152.1.5溶液配制.....................................................................................................152.2实验方法...............................................................................................................152.2.1目的片段LIC序列的扩增.........................................................................152.2.2目的片段PCR产物凝胶回收....................................................................162.2.3质粒pMF-GUS的提取..............................................................................172.2.4质粒pMF-GUS的纯化..............................................................................182.2.5LIC回收产物和质粒pMF-GUS的双酶切................................................192.2.6双酶切产物回收后的连接.........................................................................192.2.7连接产物转化感受态细胞DB3.1..............................................................202.2.8阳性克隆子的筛选.....................................................................................202.3结果与分析...........................................................................................................202.3.1目的片段LIC序列的扩增.........................................................................202.3.2目的片段LIC的回收产物和质粒pMF-GUS的双酶切..........................212.3.3连接产物转化大肠杆菌DB3.1..................................................................212.3.4阳性克隆子的菌落PCR鉴定....................................................................222.3.5阳性克隆子质粒PCR及酶切鉴定............................................................222.4讨论.......................................................................................................................232.5小结.......................................................................................................................243抗晚疫病工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a的获得................................................253.1实验材料...............................................................................................................253.1.1工具酶及主要抗生素.................................................................................253.1.2菌株及质粒.................................................................................................253.1.3引物.............................................................................................................253.1.4培养基配置.................................................................................................26 内蒙古科技大学硕士学位论文3.2实验方法...............................................................................................................263.2.1抗晚疫病基因R1、RB、R3a的获得.......................................................263.2.2无标记载体pMF-LIC酶切........................................................................273.2.3抗晚疫病基因与无标记载体pMF-LIC的LIC连接...............................273.2.4重组载体阳性克隆子的筛选.....................................................................283.2.5工程农杆菌的三亲本融合及筛选鉴定.....................................................283.3结果与分析...........................................................................................................293.3.1抗晚疫病基因R1、RB、R3a的获得.......................................................293.3.2无标记载体pMF-LIC酶切........................................................................303.3.3LIC连接产物转化大肠杆菌TOP10的阳性克隆筛选.............................303.3.4工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a的筛选鉴定....................................323.4讨论.......................................................................................................................333.5小结.......................................................................................................................334无选择标记抗晚疫病转基因马铃薯植株的获得..........................................................354.1实验材料...............................................................................................................354.1.1植物激素及抗生素.....................................................................................354.1.2培养基配置.................................................................................................354.2实验方法...............................................................................................................354.2.1马铃薯品种Desiree的转化与再生...........................................................354.2.2抗晚疫病转基因马铃薯的PCR检测........................................................364.3结果与分析...........................................................................................................374.3.1马铃薯的遗传转化.....................................................................................374.3.2转基因植株的PCR鉴定............................................................................394.4讨论.......................................................................................................................404.5小结.......................................................................................................................40结论.............................................................................................................................41参考文献.............................................................................................................................42 内蒙古科技大学硕士学位论文在学研究成果.....................................................................................................................46致谢.............................................................................................................................47 内蒙古科技大学硕士学位论文引言马铃薯（Solanumtuberosum）属于茄科（Solanaceae）植物，是全球第三大重要的粮食作物，仅次于玉米和小麦，在全球冷凉地区都有大面积栽培。目前，中国已[1]成为世界上马铃薯生产的第一大国，其产量和种植面积均占世界第一位。由疫霉菌（P.infestans）引起的晚疫病病害，已成为马铃薯生产中最严重的病害之一，在世界各生产区广泛传播。1996年，据国际马铃薯中心（InternationalPotatoCenter，CIP）估计，因为晚疫病的大范围爆发导致马铃薯产量骤减，全世界[2]损失约170亿美元。我国的马铃薯生产从开始一直受到晚疫病的危害，西北、东北[3]和华北都发生过几次晚疫病的大流行，使马铃薯产量损失过半。因此，对马铃薯晚疫病的防治已逐渐成为全球马铃薯育种和生产中的重中之重。最早从十九世纪中叶开始进行马铃薯抗晚疫病育种工作，是通过遗传改良来防治的，普通栽培种是同源四倍体（2n=4x=48），使其回交育种变得困难，且难以持久抗性，至今收效甚微。目前，对马铃薯晚疫病流行的控制主要措施是化学农药。采用化学农药虽然见效快，但容易污染环境和在薯块中残留农药，同时容易使病原菌产生抗药性小种，并且对于发展中国家的农民来说也是一个经济负担。因此必需寻求一种新的策略来持久防治马铃薯晚疫病。转基因技术的兴起为晚疫病的防治提供了新的锲机。近年来国内外已有很多马铃薯转化成功的范例，但都是单一抗性小种，易被病原菌克服，不具备持久抗性。在单一抗性容易克服丧失、水平抗性难以推广应用的情况下，为了保持抗病基因的持久抗性，多个抗病基因同时释放，利用人为方法提高抗病基因在田间的多态性是目前有效途径之一。因此，通过转基因技术创建抗病基因近等混合系是防治马铃薯晚疫病的可行方法之一。大量的马铃薯抗晚疫病基因被克隆，例如：从野生种S.demissum中克隆的抗晚疫病基因R3a和R1以及从S.bulbocastanum中克隆的Rpi-[4~7][8,9][10]blb2和RB，定位了一些新的抗晚疫病基因、马铃薯基因组的测序和建立新[11]的抗晚疫病基因数据库等为抗晚疫病的转基因研究提供了基础。本实验通过不依赖于连接反应的克隆（LIC）方式，将抗晚疫病基因R1、RB和R3a分别克隆到构建的无标记植物表达载体pMF-LIC上。用三亲本融合法将构建的重组载体转入农杆菌AGL0中，采用农杆菌介导侵染马铃薯栽培品种Desiree，获得无标记抗晚疫病转基因马铃薯植株。本研究为探索马铃薯晚疫病的持久防治提供了基础。-1- 内蒙古科技大学硕士学位论文1文献综述1.1马铃薯晚疫病概述1.1.1马铃薯晚疫病的危害由致病疫霉菌（P.infestans）引起的晚疫病病害，是导致马铃薯减产最严重的病害之一。最早于1830年在德国生产区出现了马铃薯晚疫病，但并没有引起人们的足够重视。1845年，对晚疫病发生的首次报道出现在比利时，紧随其后晚疫病在欧洲各生产区如：法国、丹麦、英国、荷兰、爱尔兰等国家迅速传播开。最严重的是1847年在爱尔兰爆发的晚疫病所引起的饥荒，使死亡的爱尔兰人达到100多万，逃[12]亡海外的有200多万，史称“爱尔兰大饥荒”（TheGreatIrishFamine）。马铃薯晚疫病的大规模爆发主要与品种抗性、栽培模式、病原菌基数、气候因素等密切相[13]关。据1996年国际马铃薯中心（CIP）估计，因为晚疫病的大范围爆发导致马铃[2]薯产量大大量减少，使全世界的损失约170亿美元。中国已有30多年马铃薯栽培史，晚疫病何时传人已无从查考。但晚疫病一直危害马铃薯的种植，特别在50年代到60年代初，西北、东北和华北都发生过几次大的晚疫病流行，使马铃薯产量损失[3]过半。随后几年，很多省区不断有严重流行的报道。80年代以来，我国各马铃薯主产区一直爆发晚疫病，且危害越来越严重，据一些专家人士统计，每年平均损失[2]在10亿美元左右。因此，对马铃薯晚疫病的防治已逐渐成为全球马铃薯育种和生产中的当务之急。1.1.2马铃薯晚疫病的防治[14~16]马铃薯晚疫病的发生易受种薯品种、气候条件、田间管理等因素的影响。针对其生产方式和发病特点，现在主要采用：化学农药、农业技术和使用抗病品种等防治技术。采用不同的播种期、加强田间管理及种薯处理等农业技术，减轻了晚疫病的危害，在一定程度上对晚疫病的防治确实有作用，但效果并不理想。且这些只是预防措施，“治标不治本”，不能根除马铃薯晚疫病，同时加大了工作量大，有时没有一点效果，徒作无用功。目前对晚疫病流行的防治措施主要依靠化学防治。由于致病疫霉菌的小种分化极快，单纯靠杀虫剂、除草剂、铜制剂等化学药剂来防治晚疫[6]病，会使病菌很快产生抗药性，导致晚疫病害再度流行，同时在薯块中残留药-2- 内蒙古科技大学硕士学位论文害。采用各种化学药剂组合在一起的方法来防治晚疫病，也取得了一些成效，但各个生产区的生理小种之间存在着抗药性和致病力的差异，会加大选择药剂组合的广度和难度，一旦晚疫病病菌对其产生了抗药性，以前的工作就白白浪费。此外，化[17]学农药易污染环境，成本也较贵，故其应用推广受到了限制。因此，采用抗病品种来防治马铃薯晚疫病备受欢迎。现有的马铃薯存在两种抗[18]性类型：垂直抗性和水平抗性。垂直抗性是由显性主效基因控制的小种专化性，而水平抗性是由微效多基因控制的非小种专化性。育种学家最初是从马铃薯野生抗晚疫病种源中探寻抗晚疫病基因，已从马铃薯野生抗晚疫病品种（S.demissum）中成功鉴定并分离出了主效抗晚疫病基因11个（R1，R2，R3…R11），并采用农杆菌[19]介导等方法已将大部分分离的抗性基因转入合适的栽培品种中。但晚疫病原菌具有高的基因流和混合的交配方式，属于风险最大、进化潜力最高、最易克服单一抗[20]病性的病原菌之一，使得R基因控制的小种专一抗性的作用非常短暂。而单独的水平抗性不能有效防止晚疫病原菌的侵染，且水平抗性与环境条件和马铃薯熟性等因素息息相关，因而大大阻碍了水平抗性的大范围推广。因此，为了解决马铃薯育种和生产上的马铃薯抗病品种的退化问题，应该开发和利用新的马铃薯抗晚疫病基因，从根本上防治马铃薯晚疫病。近年来，随着转基因技术的发展，从野生的抗晚疫病品种中分离出各种抗晚疫病基因，并利用各种方式将其转入到目前普遍种植的栽培品种中，创造了更多的优良材料，同时加快马铃薯抗晚疫病育种进程。1.1.3转基因马铃薯的晚疫病抗性研究现状近年来，大量的马铃薯抗晚疫病基因被克隆，例如：从野生种S.demissum中克隆的抗晚疫病基因R3a和R1以及从S.bulbocastanum中克隆的Rpi-blb2和[4~7][8,9][10]RB，定位一些新的抗晚疫病基因、对马铃薯基因组的测序和建立新的抗晚[11]疫病基因数据库等为抗晚疫病的转基因研究提供了基础。[21~33]转基因马铃薯的晚疫病抗性研究近年来也取得了一些成效（见表1.1）。-3- 内蒙古科技大学硕士学位论文表1.1转基因马铃薯的晚疫病抗性研究进展目的基因马铃薯的品种转化方法文献Osmotin蛋白基因Commersonii农杆菌介导法BaolongZhu（1996）Osmotin蛋白基因LineV，R2农杆菌介导法李汝刚等（1999）Harpin基因LineV，R2农杆菌介导法李汝刚等（1999）Harpin基因Atlantic农杆菌介导法李先平等（2002）GO基因台湾红皮农杆菌介导法甄伟等（2000）GO基因Burbank农杆菌介导法GusuiWu等（1995）GO基因Atlantic，Shepody农杆菌介导法张立平等（2000）TLP&bar基因津引薯8号农杆菌介导法金红等（2001）AtMYB12基因Desiree农杆菌介导法马连杰等（2011）Hrap基因Burbank农杆菌介导法黄先群等（2011）StPK1基因鄂马铃薯3号农杆菌介导法吴田（2009）avrD和Elicitin基因克新1、2、4号，Desiree农杆菌介导法杨希才等（2001）这些方法获得的抗性苗都是单一抗性小种，虽然能在一定程度上对晚疫病有防治效果，但易被病原菌克服，不具备持久抗性，而再度爆发晚疫病病害。在单一抗性容易克服丧失、水平抗性难以推广应用的情况下，为了保持抗病基因的持久抗性，多个抗病基因同时释放，利用人为方法提高抗病基因在田间的多态性是目前有效途径之一。提高抗病基因在田间的多态性大多使用混合品种法或者近等混合系法[34]来达成。但混合品种法不但在抗性基因方面不同，且马铃薯的可能熟性和薯块的商品性状方面也不一样，大大限制了混合品种法在各生产区的推广。因此通过近等混合系法来提高抗病基因在田间的多态性成为持久防治马铃薯晚疫病的有效新策略。但马铃薯的普通栽培种是同源四倍体，自交衰退现象严重，不能经过回交育种的方法来实现抗病基因近等混合系。因此，通过转基因技术创建抗病基因近等混合[17]系是防治马铃薯晚疫病的可行方法之一。为了提高抗晚疫病基因在田间的多态性从而使近等混合系法能持久防治晚疫病，应克隆更多的抗晚疫病基因。-4- 内蒙古科技大学硕士学位论文1.1.4田间创建抗病基因近等混合系的基础抗病基因近等混合系（Rgenepolyculture）是解决单一作物种植抗病性易丧失的[35]一种替代策略。但马铃薯的普通栽培种是同源四倍体，基因组高度杂合，自交衰退现象严重，不能经过回交育种的方法来实现抗病基因近等混合系。因此，转基因[17]技术是目前可行的构建只在抗病基因上有差别的近等混合系的可行方法之一。[36]Huang等通过连锁不平衡的方法在马铃薯基因组中发现了一个抗晚疫病基因等位多态性非常高的位点，命名为抗晚疫病的主效位点MLB（majorlateblightresistancecomplex），从野生种S.demissum导入的11个主效基因中有8个（R3，R5~R11）均来自于该位点。马铃薯的MLB位于第11号染色体长臂的末端，该位点是复合抗病基因位点，因此，R3、R5~R11被称为MLB的单倍型（haplotypes），而不是经典意义上的等位基因（alleles）。运用比较基因组学分析发现MLB的R3单倍型有3个抗病基因簇，其中2个基因簇中有功能性的抗病基因，分别是R3a和[37]R3b。而这3个抗病基因簇中的约40~60个抗病基因类似物都是番茄I2基因的同[36]源基因，并通过比较基因组学的方式从中克隆了R3a抗病基因。运用比较基因组学的方法来研究MLB，从中克隆越来越多的抗晚疫病基因，为转基因技术创建马铃薯抗晚疫病基因近等混合系，实现抗晚疫病基因在田间的多态性提供原材料，从而实现对马铃薯晚疫病的持久抗性。1.2不依赖连接的克隆方式传统的依赖连接酶的克隆方法受到基因序列中原有的酶切位点的限制，在应用中受到一定的局限，目前不依赖连接反应的克隆（Ligation-independentcloning，LIC）方法利用独特新颖的思路解决了这一问题。LIC-PCR无须将PCR产物连接到载体上，不依赖于限制位点，并且避免了由于热稳定聚合酶在PCR产物3＇端添加[38]碱基而造成的问题。1.2.1LIC技术的基本原理PCR片段和载体在T4DNA聚合酶的3＇~5＇外切酶活性和一种特定的dNTP[39]存在的条件下反应，在其末端生成10~15个碱基的粘性末端。因此，处理过的PCR片段和载体可依靠生成的粘性末端重组，在这个过程中没有用到连接酶。使用这种克隆方法免去了对插入片段序列的考虑，在载体上可以克隆任何需要的基因。-5- 内蒙古科技大学硕士学位论文而且整个连接过程都不需要使用限制性内切酶和连接酶，PCR片段和载体是在体外条件下连接，二者处理后生成的粘性末端退火互补形成双链环状分子，经转化进入[40]大肠杆菌细胞后，细菌的修复系统修复这些突出和缺口而得到正确重组子。图1.1为不依赖于连接的克隆基本原理。图1.1不依赖于连接的克隆方法（LIC）-6- 内蒙古科技大学硕士学位论文1.2.2LIC技术的优势[41]LIC技术的优势在于：①待克隆的PCR片段不需要酶切和连接反应。简化了各种酶切位点在引物设计时的思考麻烦，而且多个基因在实验过程中可以一同操作，同时同样处理所有的样品，省时省力。②效率高且操作简便。该方法不依赖连接酶，很大程度上简化了DNA重组过程，且完全靠粘性末端配对退火，载体自连背景低。另外，也不用考虑载体末端的磷酸化等现状。③费用低。该方法只需T4DNA聚合酶和dATP及dTTP，以及带有额外10~15bp附加碱基的引物，而且克隆过程中省去了连接酶，也没有使用价格不菲的特殊重组酶。1.2.3三亲本融合用于转基因的重组载体本身为双元载体，即大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒，要用其转化植物，需先将质粒转入农杆菌。但农杆菌有自身的一些的特性，常用的转化方[42,43][44][45]法有：冻融法、电激法、钙离子-依赖性感受细胞转化法和三亲本融合法。冻融法和钙离子-依赖性感受细胞转化法操作比较简单，且仪器需求也少，但质粒转入农杆菌的效率相对不高。电激法在转化条件方面要求过于严格，在实际可操作性方面不利于实现，且仪器通常比较昂贵，一些较小分子实验室很难来实现此操作。三亲本融合法则是利用细菌的接合作用将质粒转入农杆菌，与其他方法相比，此方法操作简便，转化效率也更高，构建的农杆菌可以直接用于植物细胞转化。三亲本融合法的基本原理是：供体菌，受体菌和帮助菌活化之后，将其混在一起培养时，帮助菌中的协助质粒首先进入供体菌内，协助质粒上具有移动基因，可以提供转移和游动功能，从而把供体菌中的目的质粒移入受体菌中，从而获得目的[42]工程农杆菌菌株。如图1.2，含有目的质粒的供体菌，在含有转移基因的帮助菌协助下，利用菌毛进行接合，从而将供体菌内的质粒转入受体菌。-7- 内蒙古科技大学硕士学位论文图1.2三亲本融合基本原理1.3农杆菌介导的植物转化1.3.1农杆菌农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，普遍存在于土壤中，它具有自然的趋向性去感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并能诱导感染的植物产生冠瘿瘤。根癌农杆菌的细胞中含有Ti质粒，在其上有一段具有转移功能的T-DNA，根癌农杆菌通过植物上的伤口侵染进入植物细胞后，T-DNA区段就会脱落从而转入到植物的基因组中，并且可以通过减数分裂一代代的稳定遗传下去。人们可以将Ti质粒进行改造，插入需要的目标基因进行DNA重组，然后通过农杆菌侵染将目的基因转入植物的基因组中。所以称农杆菌是天然存在的植物遗传转化体系。1.3.2Ti质粒农杆菌携带具有转基因功能的Ti质粒，天然具有侵染植物的能力。如图1.3所示，Ti质粒上的vir区域和T-DNA区域是其具有侵染植物能力的关键区域。vir区编码的毒性蛋白，是T-DNA区用来剪切、加工、转运、进入植物细胞核所必需的，能使切下的T-DNA整合入宿主植物的基因组中。T-DNA区域两侧的正向重复序列决定其在Ti质粒上的特定位置，便于边界内的T-DNA被替换为外源目的基因。Ti质粒是当前植物基因工程中最常用的载体系统，目的基因与T-DNA区重组，农杆菌-8- 内蒙古科技大学硕士学位论文侵染植物后，Ti质粒的重组T-DNA区段脱离质粒，从而整合到受体植物的染色体上，就有可能将目的基因转入植物细胞中。图1.3Ti质粒1.3.3农杆菌转化植物的过程[46]如图1.4，农杆菌感染植物一般分为如下几个步骤：①农杆菌由于具有较强的趋化性而吸附于植物细胞表面，产生纤维丝；②农杆菌Ti质粒或Ri质粒中的vir表达，T-DNA和vir蛋白从农杆菌中通过细胞壁鞭毛和细胞膜转移到植物细胞中；③vir蛋白和T-DNA复合体在植物细胞质中转运，T-DNA遭受植物防御系统的攻击；④vir蛋白和T-DNA复合体经过核孔进入到植物细胞核中；⑤T-DNA复合体靶向植物染色体区域并与之结合；⑥vir蛋白从T-DNA复合体上解离；⑦T-DNA整合到宿主细胞基因组中；⑧T-DNA上携带的外源基因表达。在这个复杂的农杆菌侵染、T-DNA在细胞间和细胞内转运及向染色体整合的过程中，很多植物蛋白以分子伴侣的方式发挥了重要作用。-9- 内蒙古科技大学硕士学位论文图1.4农杆菌转化植物的过程1.3.4转基因植物中外源基因的检测随着转基因产品的增加和舆论对转基因的质疑，转基因一直备受关注。各国政府都采取了一系列的安全措施，强制性要求对转基因产品进行标识，维护消费者的知情权和选择权。建立高效、准确、简便的检测技术是对转基因产品安全管理的第一步。①转基因植物的PCR检测[47]PCR技术能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，在PCR体系中加入模板、引物、四种dNTP和核酸聚合酶，经过预变性，变性、退火和延伸步骤反复进行来完成模板DNA的复制。目前，在各种转基因植物的检测普遍采用PCR技-10- 内蒙古科技大学硕士学位论文术。PCR检测对于模板DNA的需求量少，在纯度方面要求也不高，但其灵敏度高，在操作方面较安全，是当今转基因检测不可或缺的方法。利用PCR技术检测转基因植物的时侯，转入目的基因的植物基因组可PCR扩增出目的片段，没有转化成功的植物不能扩增出目的片段，从而可以确定目的基因的是否成功转入受体植物。②Southern杂交[47]Southern杂交技术是将DNA酶切后转移到杂交膜上与探针杂交的技术，被认为是筛选阳性转基因植株最为可靠、稳定的方法。该方法可消除转化质粒残留愈伤胞间引起的假阳性信号和操作过程中的污染，且准确度较高。但该技术操作复杂，成本较高，并且对实验人员在技术方面要求也较高，使其应用受到了限制。③原位杂交技术原位杂交技术是利用标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，从而显[48]示出互补链在细胞中的位置的检测技术。该技术可以清晰显示待检的目的基因在细胞中染色体上的确切位置。原位杂交技术是最近兴起的一项检测新技术，从其诞生就在转基因植物检测相关研究领域受到重视，但该技术程序较复杂，成本较高，目前没有大范围采用。1.4转基因马铃薯的生物安全性评价和展望目前，人们关注的转基因植物的安全性评价主要有两个方面：一个是环境安全性，另一个是食品安全性。环境安全性评价的核心问题是转移的基因是否会在田间种植是转移到野生植物中，或者是否会打破原有生物种群的动态平衡，而且是否会破坏自然生态环境。这些环境生物安全问题均反映了转基因作物的大规模释放和商[49]品化生产以后可能出现的问题。食品安全性是转基因植物安全性评价的另一重要方面。经合组织1993年提出了食品安全性评价的实质等同性原则：如果转基因植物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。若转基因植物生产的产品与传统产品不存在实质[50]等同性，则应进行严格的安全性评价。马铃薯作为重要的粮食作物，其安全十分重要。转基因作物的生物安全性问题包括工作人员的安全、基因漂移、性状效应、病原遗传物质表达、改变遗传和表型、杂草化，尤以杂草化最受重视。关于转基因马铃薯的安全性存在很大的争议和担忧，因此全世界政府都谨慎对待转基因马铃薯的商业化。-11- 内蒙古科技大学硕士学位论文转基因技术在提供优良的畜禽饲料原料、缓解粮食危机方面所起的作用是不容忽视的，但基因工程的不确定性和复杂性，使得人们仍然无法预测转基因食品怎样影响人类的身体健康。因此应对转基因植物安全性加大研究和投入力度，制定出相关的法律法规，以保证转基因食品的安全性。1.5研究的目的及意义本课题拟通过转基因技术，将目前已经克隆的抗晚疫病基因R1、RB和R3a分别连接到构建的无标记载体pMF-LIC上，利用三亲本融合转入农杆菌AGL0中，通过农杆菌介导转入马铃薯栽培品种Desiree中，通过PCR筛选出抗晚疫病的转基因马铃薯植株，为马铃薯大田构建抗晚疫病基因近等混合系来探索持久防治马铃薯晚疫病提供理论和实践基础。1.5.1主要研究内容1、构建生物安全的无标记转化载体pMF-LIC；2、将抗晚疫病基因R1、RB、R3a克隆到无标记载体pMF-LIC上；3、重组载体pMF-R1/RB/R3a转入大肠杆菌TOP10，三亲融合转入农杆菌AGL0，构建工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a；4、通过农杆菌介导的方法将抗病基因转入马铃薯栽培品种Desiree中，经过PCR检测筛选出抗晚疫病的转基因马铃薯植株。1.5.2主要技术路线本实验的主要技术路线如图1.5所示：-12- 内蒙古科技大学硕士学位论文pMF-GUSpJG100pCLD04541-R1pCLD04541-RBpBINPLUS-R3a双酶切、回收PCR、双酶切线性化pMFLIC序列PCR酶连无标记载体pMF-LICR1、RB、R3a基因LIC连接pMF-R1、pMF-RB、pMF-R3a热激法菌落PCR，质粒酶切及转入大肠杆菌TOP10PCR三亲融合菌落PCR，质粒酶切及转入农杆菌AGL0PCR农杆菌介导、组织培养导入马铃薯品种Desiree中PCR获得抗晚疫病转基因马铃薯图1.5实验技术路线-13- 内蒙古科技大学硕士学位论文2无标记载体pMF-LIC构建2.1实验材料2.1.1工具酶及主要抗生素和激素限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ、T4DNALigase购自Fermentas公司，PfuDNA聚合酶、dNTPMix、核酸分子量标记、大量DNA产物纯化试剂盒、大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京TIANGENE科技有限公司，卡那霉素购自Sigma公司。2.1.2菌株及质粒大肠杆菌（E.coli）DB3.1；质粒pJG100、pMF-GUS由内蒙古科技大学生物工程与技术研究所保存并提供。pMF-GUS质粒图谱pJG100质粒图谱2.1.3引物引物OXN037/OXN038：由上海捷瑞生物工程有限公司合成引物序列OXN0375＇GACTCTAGAGGTACCTTCGACGACAAGACCGG3＇OXN0385＇TGGGAGCTCGAGGAGAAGAGCCGGGCCCCTAC3＇-14- 内蒙古科技大学硕士学位论文2.1.4培养基配置-1-1-1LB液体培养基：NaCl10g·L，酵母提取物5g·L，胰蛋白胨10g·L，高温高压灭菌-1-1-1LB固体培养基：NaCl10g·L，酵母提取物5g·L，胰蛋白胨10g·L，琼脂-115g·L，高温高压灭菌2.1.5溶液配制-11)0.5mol·LEDTA：称取186.1gNa2EDTA·2H2O，置于1L烧杯中。加入约800mL的去离子水，充分搅拌。用NaOH调节pH值至8.0（约20gNaOH）。加去离子水将溶液定容至1L。适量分成小份后，高温高压灭菌。室温保存。-12)1mol·LTris-HCl：称取121.1gTris碱溶于800mL的去离子水，充分搅拌。用浓HCl调节pH值至7.6。加去离子水将溶液定容至1L。适量分成小份后，高温高压灭菌。室温保存。-1-13)TE：1mol·LTris-HCl10mL，0.5mol·LEDTA2mL，加ddH2O至100mL。高压灭菌，4℃保存备用。-14)50×TAE缓冲液：称取242gTris碱，57.1mL冰醋酸，100mL0.5mol·LEDTA（pH8.0），加ddH2O定容至1000mL。-15)卡那霉素/利福平霉素母液（50mg·mL）：称取0.5g卡纳霉素/利福霉素溶于10mLddH2O中，用0.22μm滤器过滤除菌，-20℃保存。6)RNaseA（RNA酶A）：不含DNA酶（DNase-free）的RNaseA10mg溶于10mLTE（pH7.6）中，沸水加热20min，分装后贮存于-20℃。2.2实验方法2.2.1目的片段LIC序列的扩增以质粒pJG100为模板，利用引物OXN037/OXN038进行PCR扩增，扩增体系如表2.1。-15- 内蒙古科技大学硕士学位论文表2.1PCR扩增体系试剂体积10×PCRbuffer2.00µLdNTP1.60µLOXN0371.00µLOXN0381.00µLPfu酶0.15µLpJG1002.00µLddH2Oupto20µL扩增程序如下：94℃5min94℃20s55℃20s35个循环72℃2min72℃10min4℃forever反应结束后取5µL的PCR反应产物在0.8％的琼脂糖上电泳检测。2.2.2目的片段PCR产物凝胶回收使用TIANGEN公司的大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。方法参照说明书：1)柱平衡：将吸附柱CA3放入收集管中，向其中加入平衡液BL500µL，12000rpm离心1min，将废液从收集管中移除，吸附柱CA3重新放入收集管中。2)从琼脂糖凝胶上切下单一的目的DNA条带，切成小块，放入干净的1.5mLEppendorf离心管中，计算胶块重量。3)若胶块重为0.1g，其体积可视为100µL，加入等体积溶胶溶液PN，50℃水浴使胶块融化，其间温和地翻转离心管几次，以使胶块充分溶解。-16- 内蒙古科技大学硕士学位论文注意：对于回收<300bp的小片段可在加入溶胶溶液PN完全溶胶后再加入1/2胶块体积的异丙醇以提高回收率；胶块完全溶解后最好待溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在室温时结合DNA的能力较强。4)将所得溶液转入吸附柱CA3中，静置2min，12000rpm离心30s，移除收集管中的废液，将吸附柱CA3重新放入收集管中。注意：吸附柱CA3的容积为800µL，若样品体积大于800µL可分批加入。5)向吸附柱CA3中加入漂洗液PW600µL，12000rpm离心30s，移除收集管中的废液，将吸附柱CA3放入收集管中。注意：如果回收的DNA是用于盐敏感的实验，漂洗液PW加入后静置2~5min再离心。6)重复操作步骤5。7)将吸附柱CA3放回收集管中，12000rpm开盖空甩2min，尽量除尽漂洗液。室温放置吸附柱CA3几分钟，彻底除尽漂洗液。8)另找一干净离心管，将吸附柱CA3放入其中，悬空滴加30µL洗脱液EB于吸附膜中间位置，静置1min，12000rpm离心2min收集DNA溶液（若量少，重复步骤8）。2.2.3质粒pMF-GUS的提取-1-1溶液Ⅰ：1mol·LTris-HCl（pH8.0）12.5mL，0.5mol·LEDTA（pH8.0）10mL，葡萄糖4.95g，加ddH2O至500mL。高压灭菌15min，贮存于4℃。-1溶液Ⅱ：0.4mol·LNaOH，2%SDS，等体积混合。使用前临时配置。-1溶液Ⅲ：5mol·L醋酸钾300mL，冰醋酸57.5mL，加ddH2O至500mL。4℃保存备用。提取方法：-11)挑取LB固体培养皿上的单菌落，移至10mLLB（含50mg·LKan）培养液中，37℃，180rpm培养过夜。2)取1.5mL培养液移至Eppendorf管内，于4℃，12000rpm离心1min，弃上清液。3)将细菌沉淀悬浮于100µL预冷的溶液Ⅰ中，强烈振荡使之充分混匀。-17- 内蒙古科技大学硕士学位论文4)加入200µL新鲜配置的溶液Ⅱ，盖严管盖轻轻颠倒数次以混匀内容物，置冰上5~10min。5)加入150µL溶液Ⅲ，轻轻颠倒数次，使溶液充分混匀，冰上放置3~5min。6)12000rpm，4℃下离心10min，将上清液转移至另一离心管中。7)加等体积的酚/氯仿，振荡混匀，12000rpm，4℃下离心2min，将上清转移至另一离心管中。8)加两倍体积预冷无水乙醇沉淀双链DNA，充分混匀，-20℃静置10min。9)4℃，12000rpm离心10min。10)弃上清液，加1mL75﹪乙醇洗涤双链DNA沉淀，12000rmp，4℃下离心2min，反复三次，倒尽乙醇，吸干管口残留乙醇，室温放置数分钟。-111)加含40μg·mLRNase的10mMTris-HCL缓冲液溶DNA，储存于-20℃备用。2.2.4质粒pMF-GUS的纯化使用TIANGEN公司的大量DNA产物纯化试剂盒纯化质粒pMF-GUS。方法参照说明书：1)柱平衡：吸附柱CB3放入收集管中，向其中加入平衡液BL500µL，12000rpm离心1min，除去收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2)估计质粒的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。3)将所得溶液加入吸附柱CB3中，静置2min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。注意：吸附柱CB3容积为800µL，若样品体积大于800µL可分批加入。4)向吸附柱CB3中加入漂洗液PW600µL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3重新放入收集管中。注意：如果纯化的DNA是用于盐敏感的实验，加入PW后静置2~5min再离心。5)重复操作步骤4。6)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm开盖离心2min，尽量除去漂洗液。室温放置吸附柱置几分钟，彻底除尽漂洗液，以防止其对下一步的实验影响。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。-18- 内蒙古科技大学硕士学位论文7)取一个干净的离心管，将吸附柱CB3放入，然后悬空滴加50µL洗脱液EB于吸附膜中间位置，静置2min。12000rpm离心2min，收集纯化质粒。2.2.5LIC回收产物和质粒pMF-GUS的双酶切用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ分别双酶切目的片段LIC的回收产物和质粒pMF-GUS，酶切体系如表2.2。表2.2双酶切体系试剂体积（µL）PCR回收产物（pMF-GUS）X（＜1ug）TM10×BufferTango2.0SacⅠ1.0XbaⅠ1.0ddH2OUpto20.0轻轻混匀，置于37℃酶切4h，酶切完后用0.8％的琼脂糖电泳检测。检测酶切完全的产物用TIANGEN公司的大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收双酶切的LIC产物和质粒pMF-GUS双酶切的大片段约10kb，回收方法参照2.2.2。2.2.6双酶切产物回收后的连接使用T4DNALigase酶，将回收的目的片段和酶切载体按5:1加入连接体系，于16℃连接4h。连接体系如表2.3。表2.3连接体系试剂体积（µL）10×T4DNALigaseBuffer1.0目的片段X（~100ng）酶切载体X（~20ng）T4DNALigase1.0ddH2OUpto10.0-19- 内蒙古科技大学硕士学位论文轻轻混匀，16℃连接4h，连接产物热激法转化大肠杆菌DB3.1。2.2.7连接产物转化感受态细胞DB3.1上述的连接产物用热激法转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞：(1)从-80℃冰箱取一管大肠杆菌DB3.1感受态细胞，在冰上使其融化；(2)加入10µL连接产物，轻轻混匀，冰上放置30min；(3)42℃水浴热激90s；(4)转至冰浴中静置2min，加入600µLLB液体培养基，37℃，90rpm复苏培养50min；(5)吸取100µL转化液涂布于含Kan抗生素的LB固体培养基上；(6)37℃倒置培养12~16h，观察菌落生长情况。2.2.8阳性克隆子的筛选挑取LB平板上的单菌落为模板，以引物OXN037/OXN038进行菌落PCR筛选出阳性克隆子，方法参照2.2.1。经菌落PCR筛选出的阳性克隆子经培养后提取质粒，方法参照2.2.3。进行质粒PCR检测，方法与引物参照2.2.1。同时进行质粒的XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切检测，酶切方法参照2.2.5。经菌落PCR、质粒PCR及质粒单、双酶切验证确认重组载体是否构建成功。2.3结果与分析2.3.1目的片段LIC序列的扩增以质粒pJG100为模板，利用引物OXN037/OXN038进行PCR扩增LIC序列，产物进行琼脂糖凝胶电泳，扩增得到1.8kb片段与目的片段大小一致。结果如图2.1所示。-20- 内蒙古科技大学硕士学位论文1M12M10kb1.8kb2kb1.8kb图2.1LIC序列PCR扩增结果图2.2LIC回收产物和pMF-GUS双酶切1：LIC扩增；M：1kbDNAMaker1：LIC回收产物；2：pMF-GUS；M：1kbplusDNAMaker2.3.2目的片段LIC的回收产物和质粒pMF-GUS的双酶切目的片段LIC的回收产物和质粒pMF-GUS用限制性内切酶XbaⅠ和SacⅠ进行双酶切，置于37℃酶切4h，酶切完后经琼脂糖电泳检测。结果如图2.2所示，从电泳图片可以看出目的片段和质粒已经酶切完全，质粒pMF-GUS双酶切出大片段约10kb及小片段约2kb，用TIANGEN公司的大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收双酶切的LIC产物和质粒pMF-GUS双酶切的大片段10kb。2.3.3连接产物转化大肠杆菌DB3.1上述胶回收的两个双酶切片段用T4DNALigase于16℃连接4h，连接产物热激法转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞后，涂布于Kan抗性的平板上，37℃倒置培养12~16h获得单菌落，菌落生长情况如图2.3所示。-21- 内蒙古科技大学硕士学位论文ABC图2.3连接产物转化DB3.1菌落生长情况A：涂布DB3.1菌的平板；B：连接产物转化平板；C：空的Kan平板2.3.4阳性克隆子的菌落PCR鉴定连接产物转化大肠杆菌DB3.1感受态细胞后经培养获得单菌落，挑取单菌落进行PCR鉴定，电泳结果（图2.4）显示出泳道1~5为1.8kb片段与目的片段大小一致，初步鉴定为阳性克隆子（编号pMF-LIC（1~5））。2.3.5阳性克隆子质粒PCR及酶切鉴定将上步初步确定为阳性克隆子的单菌落pMF-LIC（1~5）培养后提取质粒，进一步进行质粒PCR和质粒的XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切鉴定，经电泳显示pMF-LIC（1~4）质粒PCR结果为1.8kb，与目的条带一致；质粒经XbaⅠ/SacⅠ双酶切下约1.8kb条带，与连接上的条带符合，同时与SacⅠ单酶切的结果条带分明均符合目的片段，则pMF-LIC（1~4）为成功构建的无标记植物表达载体pMF-LIC。结果如图2.5所示。-22- 内蒙古科技大学硕士学位论文12345678910M2kb1.8kb1.6kb1kb图2.4pMF-LIC阳性克隆菌落PCR鉴定图1-6：转化克隆单菌落；7-8：pJG100菌落；9：pJG100质粒；10：水；M：1kbplusDNAMaker1234567891011121314151617M10kb2kb1.8kb1.6kb1kb图2.5阳性克隆子的质粒PCR和单、双酶切图1-5：阳性克隆；6：pJG100质粒；7：水；8-17：依次为1~5阳性克隆子双酶切、单酶切M：1kbplusDNAMaker2.4讨论聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是一种快速体外核酸扩增技术，具有特异、敏感、产率高、速度快等突出优点，广泛应用于目的片段扩增、基因检测、转化细胞的检测等方面。PCR反应过程中普通的TaqDNA聚合酶碱基配对出错几率大，本实验采用高保真的PfuDNA聚合酶，保证扩增过程中碱基的正确配对。谈到转基因技术，不得不提生物安全行的问题。当今，消费者和环境学家对转基因生物的安全性非常关注。到目前为止，科学家虽已获得了一些无标记基因的转化植株或转化系统。但只是将筛选标记基因失火，但还会保留一些多余细菌序列，甚至没有切去的筛选标记基因或者启动子、终止子序列，会随外源目的基因转入受体植物，可能对受体植物、生物安全造成一些不良影响。本实验在以前构建的无标记植物表达载体的基础上，通过PCR、LIC连接构建了无标记植物表达载体pMF-LIC，可以提高大众对-23- 内蒙古科技大学硕士学位论文转基因植物的接收度，同时可用于其它的植物转基因研究中，且为后续获得无标记抗晚疫病马铃薯植株提供了可能。2.5小结本研究以引物OXN037/OXN038对质粒pJG100进行PCR扩增，获得带LIC序列的片段，胶回收后与质粒pMF-GUS一起进行XbaⅠ/SacⅠ双酶切，回收片段用T4DNA连接酶连接，热激法转化大肠杆菌DB3.1，经菌落PCR、质粒PCR和质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切鉴定，成功构建了无标记植物表达载体pMF-LIC，利用该载体可以一步到位获得只导入目的基因、不含任何多余细菌序列的无标记转基因植物，可以提高大众对转基因植物的接收度，为后续获得无标记抗晚疫病马铃薯植株提供了可能。-24- 内蒙古科技大学硕士学位论文3抗晚疫病工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a的获得3.1实验材料3.1.1工具酶及主要抗生素限制性内切酶ApaⅠ、T4DNAPolymerase购自Fermentas公司，PrimeSTAR®HSDNAPolymerase购自TaKaRa公司，TaqDNA聚合酶、dNTPMix、核酸分子量标记、DNA纯化试剂盒、大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京TIANGENE科技有限公司，卡那霉素、利福平霉素、四环素购自Sigma公司。3.1.2菌株及质粒大肠杆菌（E.coli）：TOP10，HB101；农杆菌：AGL0；r质粒：pBINPLUS-R3a（Kan，携带抗晚疫病基因R3a）；pCLD04541-R1rr（Tet，携带抗晚疫病基因R1）；pCLD04541-RB（Tet，携带抗晚疫病基因RB），由中国农科院蔬菜花卉研究所提供。3.1.3引物引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。引物序列OXN0455＇CGACGACAAGACCGTACCATGGAGATTGGCTTAGCAGTTGGTGGTG3＇OXN0465＇GAGGAGAAGAGCCGTCACATGCATTCCCTATCGATCTTTATGG3＇OXN0475＇ATGAATTTCAACAATGAATTGTCTGATCTG3＇OXN0515＇CGACGACAAGACCGTACCATGAATTTCAACAATGAATTGTCTGATC3＇OXN0525＇GAGGAGAAGAGCCGTCTATCTTATTTCTGCAAGAATATTTTTTAC3＇OXN0635＇GAAGGTTGGCCATTTGATCACTCAAACCAACC3＇OXN0935＇CGACGACAAGACCGTACCATGGCTGAAGCTTTCATTCAAGTTCTGCTAGAC3＇OXN0965＇GAGGAGAAGAGCCGTTAAATATATATATTCACATTAGGAATGTGAGAAATTTTGTGCC3＇OXC0035＇ATCGTTGTCATGCTATGAGATTGTT3＇OXC0045＇CTTCAAGGTAGTGGGCAGTATGCTT3＇OXC0055＇CACGAGTGCCCTTTTCTGAC3＇OXC0065＇ACAATTGAATTTTTAGACTT3＇-25- 内蒙古科技大学硕士学位论文3.1.4培养基配置-1-1-1LB液体培养基：NaCl10g·L，酵母提取物5g·L，胰蛋白胨10g·L，高温高压灭菌-1-1-1LB固体培养基：NaCl10g·L，酵母提取物5g·L，胰蛋白胨10g·L，琼脂-115g·L，高温高压灭菌3.2实验方法3.2.1抗晚疫病基因R1、RB、R3a的获得分别以携带抗晚疫病基因的质粒pBINPLUS-R3a、pCLD04541-R1、pCLD04541-RB为模板，以引物对OXN045/OXN046、OXN051/OXN052、0XN093/OXN096进行PCR扩增抗晚疫病基因R3a、R1、RB。扩增体系如表3.1。表3.1抗晚疫病基因（R1/RB/R3a）扩增体系试剂体积2×PrimeSTARGCbuffer10.00µLdNTPMixture(2.5mMeach)1.60µLOXN045/51/931.00µLOXN046/52/961.00µLPrimeSTARHSDNAPolymerase0.15µLTemplate2.00µLddH2Oupto20µL扩增程序如下：94℃5min94℃20s60℃20s35个循环72℃4min72℃10min4℃forever-26- 内蒙古科技大学硕士学位论文反应结束后取5µL的PCR反应产物在0.8％的琼脂糖上电泳检测。其PCR产物使用TIANGEN公司的大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。方法参照2.2.2。3.2.2无标记载体pMF-LIC酶切用限制性内切酶ApaⅠ将上述构建的无标记载体pMF-LIC进行酶切，酶切体系如表3.2。表3.2pMF-LIC酶切体系试剂体积（µL）质粒pMF-LICX（＜1µg）10×LBuffer2.0ApaⅠ1.0ddH2OUpto20.0轻轻混匀，置于37℃酶切4h，酶切完后用0.8％的琼脂糖电泳检测。酶切大片段使用TIANGEN公司的大量琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收。方法参照2.2.2。3.2.3抗晚疫病基因与无标记载体pMF-LIC的LIC连接用T4DNA聚合酶预处理抗晚疫病基因R1、RB、R3a，体系如表3.3：表3.3T4DNA聚合酶预处理抗晚疫病基因（R1/RB/R3a）体系试剂体积（µL）抗晚疫病基因R1/RB/R3aX（~50ng）5×Buffer1.00100mMdATP0.25T4DNA聚合酶0.10ddH2OUpto5.00用T4DNA聚合酶预处理无标记载体pMF-LIC，体系如表3.4：-27- 内蒙古科技大学硕士学位论文表3.4T4DNA聚合酶预处理酶切载体pMF-LIC体系试剂体积（µL）载体pMF-LICX（~10ng）5×Buffer1.00100mMdTTP0.25T4DNA聚合酶0.10ddH2OUpto5.00体系分别加配完后进行LIC连接，运行程序如下：37℃40min75℃5minpause（混匀上述两种溶液）75℃10min15℃1h~forever结束后，取5µLLIC连接产物用热激法转化大肠杆菌TOP10感受态细胞中，方法参照2.2.8。37℃倒置过夜培养，查看菌落生长情况。3.2.4重组载体阳性克隆子的筛选挑取LIC连接产物转化的LB平板上的单菌落进行菌落PCR初步筛选出阳性克隆子，pMF-R1用引物OXN047/OXN063；pMF-RB用引物OXC005/OXC006；pMF-R3a用引物OXC003/OXC004，方法参照2.2.1。经菌落PCR筛选的阳性克隆子经培养后提取质粒，方法参照2.2.3。提取的质粒进行质粒PCR检测，引物与方法同上。并对质粒进行XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切检测，方法参照2.2.5。经菌落PCR、质粒PCR及质粒单、双酶切验证确定重组载体pMF-R1/RB/R3a是否构建成功。3.2.5工程农杆菌的三亲本融合及筛选鉴定本实验采用三亲本融合的方法，将携带抗晚疫病基因R1、RB、R3a的重组载体转入农杆菌AGL0中，从而构建工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a。含有重组载体-28- 内蒙古科技大学硕士学位论文的供体菌TOP10-pMF-R1/RB/R3a，在帮助菌HB101的作用下，通过菌毛的结合作用，将重组载体转入农杆菌AGL0中。具体步骤如下：1）活化：-1①农杆菌AGL0划线培养：提前2天在附加有Rif（50mg·L）的LB平板上划线培养农杆菌AGL0，28℃倒置培养；-1②供体菌TOP10-pMF-R1/RB/R3a划线培养：提前1天在加Kan（50mg·L）的LB平板上划线培养供体菌TOP10-pMF-R1/RB/R3a，37℃倒置培养；-1③帮助菌HB101划线培养：提前1天在附加有Kan（50mg·L）的LB平板上划线培养帮助菌HB101，37℃倒置培养。2）融合：在超净工作台中分别挑取上述活化的三种菌的单菌落，将其溶于无抗生素的LB液体培养基中，置于28℃培养24~48h。-13）筛选鉴定：将上述融合的LB培养基涂布于含Rif（50mg·L）和Kan（50-1mg·L）的平板上，28℃倒置培养48h，观察菌落生长情况。挑取平板上的单菌落进行菌落PCR初步筛选出阳性克隆子，方法与引物参照3.2.4。经菌落PCR筛选出的阳性克隆子经培养后提取质粒，方法参照2.2.3。将提取的质粒进行质粒PCR，方法与引物同上。同时对质粒进行XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切检测，酶切方法参照2.2.5。经菌落PCR、质粒PCR及质粒单、双酶切验证可以确认工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a是否构建成功。3.3结果与分析3.3.1抗晚疫病基因R1、RB、R3a的获得分别以引物对OXN045/OXN046、OXN051/OXN052、0XN093/OXN096从模板pBINPLUS-R3a、pCLD04541-R1、pCLD04541-RB上PCR扩增抗晚疫病基因R3a、R1、RB。经琼脂糖凝胶电泳检测：R1：3882bp；RB：3593bp；R3a：3849bp与预期目的片段大小一致，为抗晚疫病基因R3a、R1、RB。结果如图3.1、图3.2所示。-29- 内蒙古科技大学硕士学位论文1M12M3882bp4kb3kb3849bp4kb3593bp3kb图3.1抗晚疫病基因R1的PCR扩增图3.2抗晚疫病基因RB和R3a的PCR扩增1：R1；M：1kbDNAMaker1：R3a；2：RB；M：1kbDNAMaker3.3.2无标记载体pMF-LIC酶切无标记载体pMF-LIC经限制性内切酶ApaⅠ酶切后，经琼脂糖凝胶电泳结果如图3.3，可知：无标记载体pMF-LIC被内切酶ApaⅠ切出大片段约10kb左右，切下约1.8kb片段，载体酶切完全，经胶回收大片段约10kb后可用作下步LIC连接。M1210kb2kb1.8kb1kb图3.3载体pMF-LIC酶切图1：pMF-LIC质粒；2：ApaⅠ酶切质粒；M：1kbDNAMaker3.3.3LIC连接产物转化大肠杆菌TOP10的阳性克隆筛选抗晚疫病基因R1、RB、R3a和ApaⅠ酶切的无标记载体pMF-LIC经LIC连接后热激法转化大肠杆菌TOP10，挑取单菌落进行PCR验证：pMF-R1：950bp；pMF-RB：200bp；pMF-R3a：1000bp，符合预期大小，初步鉴定为阳性克隆子。结果如图3.4、图3.5、图3.6所示。-30- 内蒙古科技大学硕士学位论文M1234M1234M1234950bp1000bp200bp图3.4pMF-R1菌落PCR图3.5pMF-RB菌落PCR图3.6pMF-R3a菌落PCR1：pMF-R1；2：R1质粒1：pMF-RB；2：RB质粒1：pMF-R3a；2：R3a质粒3：TOP10；4：水3：TOP10；4：水3：TOP10；4：水M：100bpDNAMakerM：100bpDNAMakerM：100bpDNAMaker上述鉴定的阳性克隆摇菌提取质粒，进行质粒PCR和质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切检测，进一步验证阳性克隆。引物与PCR程序同上，扩增产物与预期大小一致，如图3.7、图3.8、图3.9所示。重组载体质粒经XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切结果条带分明，双酶切均切下目的条带，且与单酶切和提取的质粒分别符合预期大小。结果如图3.10、图3.11、图3.12所示。123M123M123M950bp1000bp200bp图3.7pMF-R1质粒PCR图3.8pMF-RB质粒PCR图3.9pMF-R3a质粒PCR1：pMF-R1质粒；1：pMF-RB质粒；1：pMF-R3a提取质粒；2：R1质粒；3：水2：RB质粒；3：水2：R3a质粒；3：水M：100bpDNAMakerM：100bpDNAMakerM：100bpDNAMakerM123123MM12310kb10kb3880bp4kb3850bp图3.10pMF-R1质粒单、双酶切图3.11pMF-RB质粒单、双酶切图3.12pMF-R3a质粒单、双酶切1：pMF-R1质粒；2：单酶切1：pMF-RB质粒；2：双酶切1：pMF-R3a质粒；2：双酶切3：双酶切；M：1kbDNAMaker3：单酶切；M：1kbDNAMaker3：单酶切；M：1kbDNAMaker-31- 内蒙古科技大学硕士学位论文经过菌落PCR、质粒PCR和质粒单、双酶切的鉴定，可以证明重组载体pMF-R1/RB/R3a构建成功。3.3.4工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a的筛选鉴定含有重组载体的供体菌TOP10-pMF-R1/RB/R3a，在帮助菌HB101的帮助下，将重组载体转入农杆菌AGL0中，从而获得工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a，挑取单菌落进行菌落PCR验证，产物电泳结果符合预期条带，为阳性克隆子。结果如图3.13所示。1234M5678M91011121000bp950bp200bp图3.13三亲融合后菌落PCR鉴定1：AGL0-pMF-R1；2：R1质粒；3、7、11：AGL0菌；4、8、12：水；5：AGL0-pMF-RB；6：RB质粒；9：AGL0-pMF-R3a；10：R3a质粒M：100bpDNAMaker上述鉴定的阳性克隆子培养后提取质粒，进行质粒PCR和质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切检测，进一步确定转化克隆。PCR扩增产物电泳结果（图3.14）与预期大小一致。重组载体的质粒经XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切结果条带分明，双酶切与单酶切电泳结果（图3.15）符合预期大小。挑取的工程农杆菌单克隆为阳性克隆，可用于后期遗传转化实验。123M456M7891000bp950bp200bp图3.14质粒PCR验证1：AGL0-pMF-R1；2：R1质粒；3、6、9：水；4：AGL0-pMF-RB；5：RB质粒7：AGL0-pMF-R3a；8：R3a质粒；M：100bpDNAMaker-32- 内蒙古科技大学硕士学位论文123M456M789图3.15质粒单、双酶切验证1：R1双酶切；2：R1单酶切；3：R1质粒；4：RB双酶切；5：RB单酶切6：RB质粒；7：R3a质粒；8：R3a单酶切；9：R3a双酶；M：1kbDNAMaker3.4讨论传统的依赖连接酶的克隆方法受到基因序列中原有酶切位点的限制，且需限制性内切酶，在应用中有一定的局限性。本实验采用不依赖连接反应的克隆（LIC），抗晚疫病基因PCR片段和酶切载体pMF-LIC在T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性和特定的dNTP存在的条件下反应，在其末端分别生成10~15个碱基的粘性末端，二者互补配对，可通过粘性末端重组完成连接。在这个过程中不需要酶切和连接酶，不用考虑插入片段序列，操作简便、效率高、费用低。用于转基因马铃薯的重组载体需先将其转入农杆菌。由于农杆菌有自身的一些的特性，有多种常用的转化方法：冻融法和钙离子-依赖性感受细胞转化法操作比较简单，且仪器需求也少，但质粒转入农杆菌的效率相对不高。电激法在转化条件方面要求过于严格，在实际可操作性方面不利于实现，且仪器通常比较昂贵，一些较小分子实验室很难来实现此操作。三亲本融合法则是利用细菌的接合作用将质粒转入农杆菌，与其他方法相比，此方法操作简便，转化效率也更高，构建的农杆菌可以直接用于植物细胞转化。本实验采用三亲本融合法，含有重组载体的供体菌TOP10-pMF-R1/RB/R3a，在帮助菌HB101的帮助下，将重组载体转入农杆菌AGL0中，从而获得工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a，3.5小结分别用引物OXN045/OXN046、OXN051/OXN052、0XN093/OXN096从质粒pBINPLUS-R3a、pCLD04541-R1、pCLD04541-RB上PCR扩增出抗晚疫病基因-33- 内蒙古科技大学硕士学位论文R3a、R1、RB，同时用ApaI酶切载体pMF-LIC。用不依赖于连接反应的克隆（LIC）方法将抗晚疫病基因R3a、R1、RB克隆到无标记植物表达载体pMF-LIC上，热激法转化大肠杆菌TOP10，经菌落PCR、质粒PCR、质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切证明重组载体pMF-R1/RB/R3a构建成功。通过三亲本融合，在帮助菌HB101的帮助下将重组载体pMF-R1/RB/R3a转入农杆菌AGL0中，经过菌落PCR、质粒PCR、质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切鉴定，成功构建出工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a，为后续进行农杆菌介导遗传转化提供了基础。-34- 内蒙古科技大学硕士学位论文4无选择标记抗晚疫病转基因马铃薯植株的获得4.1实验材料4.1.1植物激素及抗生素Trans-Zeatin-riboside（TZ-R）、MurashigeandSkoogBasalMedium（MS）、2,4-D、NAA、6-BA、激动素（KT）、特美汀购自Sigma公司，蔗糖、酪蛋白水解物购自国药集团。4.1.2培养基配置-1-1-1MS20：4.4g·LMS（SigmaM5519）＋20g·L蔗糖＋8.0g·LAgar，pH5.8高温灭菌15min。-1-1-1MS30：4.4g·LMS＋30g·L蔗糖＋8.0g·LAgar，pH5.8高温灭菌15min。-1-1MS30（液体）：4.4g·LMS＋30g·L蔗糖，pH5.8高温灭菌15min。-1-1预培养基：MS30+2.0mg·LNAA+1.0mg·L6-BA-1-1-1PACM：MS30（液体）+30g·L蔗糖+2.0mg·L酪蛋白水解物+1.0mg·L2,4-D-1+0.5mg·LKT-1-1诱导分化培养基：MS20+1.0mg·LTZ-R+200mg·L特美汀-1生根培养基：MS30+200mg·L特美汀4.2实验方法4.2.1马铃薯品种Desiree的转化与再生[51]转化方法主要参照Heilersig等方法。1)预培养将Desiree无菌苗切成不带腋芽的长2~5mm的茎段，置于铺有2层灭菌滤纸的预培养基（加2mL液体培养基PACM）上，并于人工气候箱内22℃，16h光照，8h黑暗培养。2)侵染与共培养-1将工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a划线接种于含Rif（50mg·L）、Kan（50-1-1mg·L）和硫酸庆大霉素（50mg·L）的固体培养基上，28℃静置培养48h，以活-35- 内蒙古科技大学硕士学位论文-1-1化工程农杆菌；挑取单菌落接种于10mL含Rif（50mg·L）、Kan（50mg·L）和-1硫酸庆大霉素（50mg·L）的液体培养基中，28℃，200rpm过夜培养；按照1:50-1-1的比例将菌液接种于50mL含Rif（50mg·L）、Kan（50mg·L）和硫酸庆大霉素-1（50mg·L）的液体培养基，28℃，240rpm培养，期间每30~60min测定一次菌液的OD600值，当OD600≈0.6时，停止培养，20℃，2500rpm离心10min收集菌-1体，同时加入含乙酰丁香酮（终浓度10mg·L）的MS液体培养基，使菌体重新悬浮。马铃薯茎段经预培养后转入一个无菌培养皿，并倒入上述重悬后的农杆菌菌液侵染，期间轻柔晃动使其充分接触，侵染8min。侵染完成后，用无菌滤纸吸干表面多余菌液，继续放于预培养基中，置于人工气候箱内，22℃避光培养2天。3)愈伤组织、芽诱导共培养完毕后将茎段转到诱导分化培养基上，置于人工气候箱内，22℃，16h光照，8h黑暗培养，每十天换一次培养基，直到有芽分化。4)芽的生根培养当芽长到1cm时，用无菌刀将其切下转入生根培养基上诱导其生根，以获得完整植株。4.2.2抗晚疫病转基因马铃薯的PCR检测㈠马铃薯DNA的提取1、在洁净的EP管中加400µLEdwards’提取液，剪取一小块马铃薯叶片放在EP管中研磨成粉末；2、振荡后静置2min，13000rpm离心1min；3、取300µL上清加等体积异丙醇，-20℃静置2min，13000rpm离心5min；4、干燥10~15min，加100µLddH2O；5、吸取1~5µL做PCR模板。-36- 内蒙古科技大学硕士学位论文表4.1Edwards’提取液配方组分终浓度储液（10×，100mL）Tris-Cl（pH7.5）200mM2M，31.52g，adjustpHto7.5NaCl250mM2.5M，14.61gEDTA25mM0.25M，7.31g，adjustpHto8.0SDS0.5%（W/V）㈡转基因植株的PCR检测以提取的马铃薯叶片DNA为模板，pMF-R1用引物OXN047/OXN063；pMF-RB用引物OXC005/OXC006；pMF-R3a用引物OXC003/OXC004进行PCR检测，方法参照2.2.1。经过PCR初步鉴定出抗晚疫病阳性的转基因马铃薯植株。4.3结果与分析4.3.1马铃薯的遗传转化一、马铃薯外植体的预培养从Desiree无菌苗上切下的茎段，预培养1天后如图4.1所示。预培养时间太长会造成茎段脱水，不利于下一步的操作；预培养不足则会造成茎段太弱小，侵染成活率大大降低。图4.1预培养的马铃薯茎段-37- 内蒙古科技大学硕士学位论文二、愈伤组织的诱导与芽的分化共培养完毕后的茎段转到诱导分化培养基上培养，每十天换一次培养基，直到有芽分化。如图4.2所示。ABCD图4.2马铃薯外植体分化情况A：分化培养基上0天；B：10天；C：20天；D：长出芽的外植体三、再生根培养待分化得到的再生芽长到1cm左右切下，转入生根培养基诱导生根，以获得完整植株。如图4.3所示。-38- 内蒙古科技大学硕士学位论文ABC图4.3再生根培养A：pMF-R1转基因马铃薯；B：pMF-RB转基因马铃薯；C：pMF-R3a转基因马铃薯4.3.2转基因植株的PCR鉴定以提取的转基因马铃薯DNA为模板，未转基因马铃薯Desiree的DNA作对照，进行PCR检测，结果如图4.4所示：pMF-R3a扩增出1000bp条带，与预期目的条带一致，表明抗晚疫病基因成功转入马铃薯品种Desiree中。目前共得到4株转R3a基因的阳性转化植株，R1和RB的转基因马铃薯植株正在诱导分化中，有待于进一步的鉴定阳性转化植株。1234567M1000bp图4.4转基因马铃薯pMF-R3a的PCR鉴定1-4：转R3a植株；5：Desiree植株；6：AGL0-pMF-R3a质粒；7：水；M：100bpDNAMaker-39- 内蒙古科技大学硕士学位论文4.4讨论激素对于马铃薯的组织培养至关重要，决定其成败。合理的激素组合能增加其-1愈伤组织率、出芽率、生根率等。本实验用的激素为TZ-R，其用量是1.0mg·L，-1能很好的促进愈伤组织发芽。同时加入200mg·L的特美汀，能很好的抑制农杆菌的生长。外植体对马铃薯组织培养也有影响。茎段虽然是分化程度较高的器官，但可通过脱分化为愈伤组织，再分化为不定芽进而得以再生。微型薯再生受其生理状态的影响大，且材料准备时间较长，来源相对受限。本实验采用茎段做外植体，通过脱分化、再分化、生根过程，使得马铃薯再生，大约需要一个半月左右的时间。4.5小结利用农杆菌介导的方法将抗晚疫病基因R3a、R1、RB转化马铃薯栽培品种Desiree，经组织培养获得再生苗，进行PCR检测抗晚疫病转基因植株。获得4株转R3a阳性转化植株，R1和RB的阳性转化植株正在进一步验证中。本实验为后续探索马铃薯晚疫病的持久防治提供了基础。-40- 内蒙古科技大学硕士学位论文结论(一)构建了无标记载体pMF-LIC。以携带LIC序列的质粒pJG100和携带无标记载体pMF的质粒pMF-GUS为基础，经过PCR、XbaⅠ/SacⅠ双酶切、T4DNA连接、转化大肠杆菌DB3.1及转化后的菌落PCR、质粒PCR和质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切鉴定，成功构建了无标记植物表达载体pMF-LIC。(二)获得了含有抗晚疫病基因的重组载体。用设计的特异引物对OXN051/OXN052、OXN093/OXN096、OXN045/OXN046分别从携带抗晚疫病基因的质粒pCLD04541-R1、pCLD04541-RB、pBINPLUS-R3a上，利用高保真酶PCR扩增出抗晚疫病基因R1、RB、R3a，然后与ApaⅠ酶切的无标记表达载体pMF-LIC经T4DNA聚合酶预处理后进行LIC连接，热激法转化大肠杆菌TOP10，经菌落PCR、质粒PCR、质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切验证成功构建重组载体pMF-R1/RB/R3a。(三)获得了抗晚疫病基因工程农杆菌。通过三亲本融合将重组载体转入农杆菌AGL0中，经过菌落PCR、质粒PCR、质粒XbaⅠ/SacⅠ双酶切及SacⅠ单酶切鉴定出工程农杆菌AGL0-pMF-R1/RB/R3a。(四)获得了无标记的抗晚疫病转基因马铃薯。通过农杆菌介导的方法将抗晚疫病基因R1、RB、R3a转化马铃薯栽培品种Desiree，经过PCR检测，已获得4株转R3a的阳性转基因马铃薯植株，转R1和RB的转基因马铃薯植株正在进一步验证中。本研究为后续田间创建马铃薯抗晚疫病基因近等混合系提供了基础，进而持久防治马铃薯晚疫病提供了基础。-41- 内蒙古科技大学硕士学位论文参考文献[1]谢开云，屈冬玉，金黎平，等．中国马铃薯生产与世界先进国家的比较[M]．哈尔滨，哈尔滨工程大学出版社，2008：1-7．[2]宋伯符，谢开云．CIP的全球晚疫病防治倡议与我国的参与[J]．马铃薯杂志，1997，11（1）：51-55．[3]彭昕琴，刁文一，霍妙娟，等．马铃薯抗晚疫病转基因的研究进展[J]．现代生物医学进展，2007，7（1）：142-145．[4]BallvoraA,ErcolanoMR,WeissJ,etal.TheR1geneforpotatoresistancetolateblight(Phytophthorainfestans)belongstotheleucinezipper/NBS/LRRclassofplantresistancegenes[J].ThePlantJournal,2002,30(3):361-371.[5]SongJQ,JamesMB,NaessSK,etal.GeneRBclonedfromSolanumbulbocastanumconfersbroadspectrumresistancetopotatolateblight[J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(16):9128-9133.[6]HuangSW,vanderVossenEAG,KuangH,etal.ComparativegenomicsenabledtheisolationoftheR3alateblightresistancegeneinpotato[J].ThePlantJournal,2005,42(2):251-261.[7]VanderVossenEAG,GrosJ,SikkemaA,etal.TheRpi-blb2genefromSolanumbulbocastanumisaMi-1genehomologconferringbroad-spectrumlateblightresistanceinpotato[J].ThePlantJournal,2005,44(2):208-222.[8]JoKR,ArensM,KimTY,etal.MappingoftheS.demissumlateblightresistancegeneR8toanewlocusonchromosomeⅨ[J].TheroApplGenet,2011,123(8):1331-1340.[9]SliwkaJ,JakuczunH,ChmielarzM,etal.LateblightresistancegenefromSolanumruiz-ceballosiiislocatedonpotatochromosomeXandlinkedtovioletflowercolour[J].TheorApplGenet,2012,124(2):397-406.[10]XuX,PanS,ChengS,etal.Genomesequenceandanalysisofthetubercroppotato[J].Nature,2011,475(7355):189-195.-42- 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