小菜蛾高致病力球孢白僵菌株系筛选及其感染后的抗氧化反应研究

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单位代码10635学号112015327001889硕士学位论文小菜蛾高致病力球孢白僵菌株系筛选及其感染后的抗氧化反应研究论文作者：任忠虎指导教师：刘怀教授学科专业：农业昆虫与害虫防治研究方向：昆虫生态及害虫（螨）综合治理提交论文日期：2018年4月9日论文答辩日期：2018年5月30日学位授予单位：西南大学中国•重庆2018年5月 M.SThesisScreeningofhighlypathogenicBeauveriabassianaandanti-oxidativereactiontoPlutellaxylostellaMajor:AgriculturalEntomologyandPestControlField:InsectEcologyandIntegratedPestManagementSupervisor:Prof.HuaiLiuMastercandidate:Zhong-HuRenSouthwestUniversity,Chongqing,PR.ChinaMay,2018 本研究承蒙重庆市社会事业与民生保障科技创新专项（cstc2015shms-ztzx80011）资助ThisstudywassupportedbyInnovationFundforSocialProgramsandPeople’sLivelihoodGuaranteeofChongqing(cstc2015shms-ztzx80011) 目录目录中文摘要...........................................................................................................................I1潼南地区小菜蛾田间发生动态调查.......................................................................I2高致病力球孢白僵菌株系筛选及其与化学药剂的复配.......................................I3小菜蛾感染球孢白僵菌后的抗氧化反应研究......................................................IIABSTRACT....................................................................................................................III1InvestigationontheoccurrenceofPlutellaxylostellainthefieldofTongnan.......III2ScreeningofthehighlypathogenicBeauveriabassianaandmixingwithchemicalinsecticidesagainstthePlutellaxylostella.................................................IV3AntioxidantresponseofPlutellaxylostellainfectedbyBeauveriabassiana.........IV第1章文献综述............................................................................................................11小菜蛾及其研究概况..............................................................................................11.1小菜蛾的发生与危害......................................................................................11.2小菜蛾抗药性现状..........................................................................................11.2.1阿维菌素.......................................................................................................21.2.2氯虫苯甲酰胺...............................................................................................31.2.3拟除虫菊酯类杀虫剂...................................................................................31.2.4酰基肼类杀虫剂...........................................................................................32球孢白僵菌研究进展..............................................................................................42.1球孢白僵菌分类及致病机理..........................................................................42.2球孢白僵菌与药剂混配作用机理..................................................................53小菜蛾感染球孢白僵菌后抗氧化反应的研究......................................................5技术路线..........................................................................................................................8第2章潼南地区秋冬季小菜蛾田间发生动态调查..................................................101材料与方法............................................................................................................101.1材料及地点....................................................................................................101.2调查方法........................................................................................................101.3数据统计与分析.............................................................................................112结果与分析.............................................................................................................11i 西南大学硕士学位论文2.1小菜蛾的发生规律........................................................................................112.2越冬态调查....................................................................................................123结论与讨论............................................................................................................12第3章高致病力球孢白僵菌和化学药剂的筛选.......................................................141材料与方法............................................................................................................141.1供试菌株........................................................................................................141.2供试昆虫........................................................................................................151.3小菜蛾饲养条件............................................................................................151.4马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的制备................................................151.5孢子悬浮液母液的制备................................................................................152对小菜蛾高毒化学农药筛选及毒力测定.......................................................163化学农药的复配...............................................................................................174球孢白僵菌与化学农药的混配.......................................................................172结果与分析..........................................................................................................182.1对小菜蛾高致病力球孢白僵菌的筛选........................................................182.2对小菜蛾高毒化学农药筛选及毒力测定....................................................202.3球孢白僵菌与化学农药的混配....................................................................212.4扫描电镜观察结果........................................................................................233结论与讨论............................................................................................................25第4章白僵菌侵染对小菜蛾抗氧化反应的研究.......................................................281材料与方法............................................................................................................281.1供试昆虫........................................................................................................281.2主要试剂（盒）与仪器................................................................................281.3白僵菌侵染处理.............................................................................................291.4样品制备........................................................................................................301.5抗氧化酶活性测定.........................................................................................302结果与分析............................................................................................................322.1白僵菌侵染对小菜蛾超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响....................322.2白僵菌侵染对小菜蛾过氧化氢酶（CAT）活性的影响.............................332.3白僵菌侵染对小菜蛾过氧化物酶（POD）活性的影响............................343结论与讨论............................................................................................................34ii 目录第5章结论与展望......................................................................................................361结论........................................................................................................................361.1明确了潼南地区小菜蛾田间种群发生规律................................................361.2评价了球孢白僵菌对小菜蛾的致病力和化学药剂的复配潜力................361.3阐明了小菜蛾感染白僵菌后的抗氧化反应................................................362展望........................................................................................................................37参考文献........................................................................................................................38在校期间发表的论文....................................................................................................48致谢................................................................................................................................50iii 中文摘要中文摘要小菜蛾（Plutellaxylostella）适应力强、传播范围大，是一种危害十分严重的世界性害虫。小菜蛾在我国南北地区发生情况存在明显差异性。随着化学农药的大量、过量使用小菜蛾抗药性水平迅速上升，对其防治带来了极大困难。球孢白僵菌(Beauveriabassiana)是目前生物防治中研究和应用最为广泛的昆虫病原真菌，该菌种具有杀虫范围广、致病力强、应用简便无污染等优点，为小菜蛾的绿色防控及农药减施提供了新的方向。本论文依托重庆市潼南区太安镇罐坝村国家级现代农业科技园开展了该地区小菜蛾发生规律调查和田间种群抗药性监测研究，筛选了对小菜蛾高致病力的球孢白僵菌株系，解析了白僵菌与杀虫剂混配后的毒力与相容性，利用扫描电子显微镜观察白僵菌对小菜蛾体壁的侵染过程，并测定小菜蛾感染球孢白僵菌后体内抗氧化反应水平，从而为利用球孢白僵菌防治小菜蛾提供理论依据与技术指导，主要结果如下：1潼南地区小菜蛾田间发生动态调查研究调查了2016年10月到2017年3月重庆市潼南区太安镇罐坝村国家级现代农业科技园甘蓝田中小菜蛾的发生动态，调查采用五点取样法定点调查。甘蓝于10月11日定植，10月25日小菜蛾幼虫为40头/百株，小菜蛾成虫诱捕量为40头/周，随气温降低小菜蛾幼虫和成虫发生量逐渐降低，小菜蛾幼虫和成虫分别在1月10日和12月20日停止发生，进入越冬期。越冬后幼虫和成虫活动始见期在3月7日前后，幼虫数量达20头/百株，成虫诱捕量为2头/周。小菜蛾幼虫和成虫的发生量随温度降低而减少，随温度回升而增加。入冬后在日均温7°C环境下1月24日和2月7日调查发现仍有幼虫存活。重庆潼南小菜蛾的越冬形态主要为4龄幼虫和蛹，而且蛹的数量显著多于幼虫。在一月份，小菜蛾越冬态蛹的数量达20头/百株，四龄幼虫为8头/百株。2高致病力球孢白僵菌株系筛选及其与化学药剂的复配采用浸液法测定了9种球孢白僵菌不同品系对小菜蛾的致病力，结果表明球孢白僵菌Bb0601、Bb0604、Bb07、Bb014、Bb252和Bb0603品系对小菜蛾的侵染率较高，其致死浓度分别为9.74×106个/ml、1.11×107个/ml、1.44×107个/ml、1.74×107个/ml、1.50×107个/ml和1.48×107个/ml。其中，以Bb0601品系致病力最高，第6天累计校正死亡率为85.19%。化学药剂毒力测定结果表明，阿维菌素、氯虫苯甲酰胺、虫酰肼、高效氯氰菊酯、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐对潼南地区小菜蛾3龄幼虫的LC50分别为250.52mg/L、7.52mg/L、35.18mg/L、335.30mg/L和8.72mg/L。潼南地区小菜蛾种群对阿维菌素抗性倍数达12526倍，对高效氯氰菊酯抗性达到94.45倍，对甲氨基阿维菌素苯甲酸盐抗性达到91.35倍，对氯虫苯甲酰胺抗性达到32.7倍，对虫酰肼无抗性。复配试验结果表明，虫酰肼与氯虫苯甲酰胺这两种I 西南大学硕士学位论文杀虫剂在10:1条件下呈现增效作用，这两种药剂单剂和混剂可作为潼南地区小菜蛾防治推荐使用药剂。在球孢白僵菌Bb0601与5种化学药剂的相容性试验中，萌发率从低到高依次为高效氯氰菊酯（27.02%）、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐（43.86%）、阿维菌素（46.21%）、氯虫苯甲酰胺（61.21%）和虫酰肼（77.38%），以氯虫苯甲酰胺和虫酰肼对球孢白僵菌Bb0601品系的生长抑制作用较小。当球孢白僵菌Bb0601与氯虫苯甲酰胺和虫酰肼混配后，混剂的LC50分别为22.60mg/L、5.20mg/L，与单剂相比LC50分别下降了35.76%和30.85%。使用白僵菌和化学药剂的混剂后，通过扫描电子显微镜观察到球孢白僵菌可以在小菜蛾体表正常附着、萌发和穿透体壁。说明白僵菌也参与了混剂的的致死作用。3小菜蛾感染球孢白僵菌后的抗氧化反应研究以浓度为4.2×106个/ml的白僵菌Bb0601株系孢子悬浮液处理小菜蛾3龄幼虫后，每8h测定其体内CAT、SOD和POD活力水平，以蒸馏水处理为对照组。结果表明，被球孢白僵菌侵染16h内，小菜蛾体内的CAT、SOD和POD活力水平均出现不同程度的上升，说明在被侵染前期，这三种酶一起参与了其体内抗氧化活动。SOD活力水平始终高于对照，说明该酶在小菜蛾抵抗球孢白僵菌的侵染中起到了重要作用。POD活力水平始终低于对照组，CAT活力水平在被侵染24h后迅速下降且低于对照组，说明POD和CAT这两种酶活力被抑制，可能是因为被球孢白僵菌侵染后小菜蛾合成蛋白水平下降，生理平衡被破坏，导致其免疫活力受到抑制。关键词：小菜蛾；球孢白僵菌；发生动态；抗性水平；药剂混配；抗氧化反应II AbstractABSTRACTThePlutellaxylostellaisaworldpestwithastrongadaptabilityastrongadaptabilityandcanspreadfarandwid.TheoccurrencealgebraoftheP.xylostellahasanobviousdifferencebetweenthenorthandsouthofChina.Withtheoveruseofpesticide,theresistanceofthefieldpopulationhasdevelopedrapidly.Beauveriabassianaisanentomopathogenicfungusthathasbeenstudiedandappliedmostwidelythananyotherspecies.Ithastheadvantagesofwideinsecticidalrange,strongpathogenicity,simpleapplicationandnopollution.ItprovidesanewdirectionforthegreenpreventionandcontrolandpesticidereductionoftheP.xylostella.ThispapercarriedouttheinvestigationoftheoccurrenceofP.xylostellainTongnanChongqingNationalModernAgriculturalScienceandTechnologyPark,monitoredthefieldpopulationresistance,screenedthehighlypathogenicB.bassianastrains,analyzedthetoxicityandcompatibilityofB.bassianawiththeinsecticides,scanningelectronmicroscopewasusedtoobservetheinfectionprocessofB.bassianatothebodywallofP.xylostella,andmeasuredtheantioxidationreactionlevelinthebodyofP.xylostellaafterinfectedbyB.bassiana,providingtheoreticalandtechnicalguidanceforthepreventionandcontroloftheP.xylostellausingentomopathogenicfungi.Themainresultswereasfollows:1InvestigationontheoccurrenceofPlutellaxylostellainthefieldofTongnanTheoccurrenceofP.xylostellawasinvestigatedusingfivepointsamplingmethodinTongnanChongqingNationalModernAgriculturalScienceandTechnologyParkfromOctober2016toMarch2017.CabbagewasplantedinOctober11th,andthelarvaeofP.xylostellawas40/100inOctober25th.TheadulttrappingamountofP.xylostellawas40perweek.ThelarvaeandadultenteredtheoverwinteringperiodinJanuary10thandDecember20.Afteroverwintering,thelarvaeandadultactivitiesbegantoappearonMarch7th,thenumberoflarvaereached20/100plants,andtheadulttrappedwas2perweek.TheoccurrenceoflarvaeandadultsofP.xylostelladecreasedwiththedecreaseoftemperature,andincreasedwiththeincreaseoftemperature.Inwinter,surveyfoundthatlarvaeweresurvivingon24JanuaryandFebruary7withthedailyaveragetemperatureis7°C.ThenumberofpupaeintheoverwinteringformofP.xylostellaissignificantlymorethanthatof4instarlarvae.IntheJanuary,thenumberofoverwinteringpupaeofP.xylostellareached20/100plants,andthefourinstarlarvaewere8/100plants.III 西南大学硕士学位论文2ScreeningofthehighlypathogenicBeauveriabassianaandmixingwithchemicalinsecticidesagainstthePlutellaxylostellaThepathogenicityof9differentstrainsofB.bassianaaginsttheP.xylostellawasdeterminedbytheimmersionmethod.TheresultsshowedthattheinfectionrateofBb0601,Bb0604,Bb07,Bb014,Bb252andBb0603strainsaginstP.xylostellawerehigher.Theirlethalconcentrationwas9.74×106/ml,1.11×107/ml,1.44×107/ml,1.74×107/ml,1.50×107/mland12.28×107ml.Amongthem,thebestwasBb0601itsaccumulativecorrectedmortalitywas85.19%inthe6thday.Toxicitiesof5insecticidestodiamondbackmoth,theLC50ofAbamectin,Chlorantraniliprole,Tebufenozide,Betacypermethrin,Emamectinbenzoatewere250.52mg/L,7.52mg/L,35.18mg/L,335.30mg/Land8.72mg/L.InTongnanarea,theresistanceindexofP.xylostellatoAbamectin,Cypermethrin,EmamectinBenzoateandChlorantraniliprolewere12562,94.45,91.35,32.7,noresistancetoTebufenozide.CompatibilitytestbetweenB.bassiana(Bb0601)and5insecticidesdeclarethatthesporegerminationrateintheseinsecticidesfromlowtohighwereBetacypermethrin(27.02%),Emamectinbenzoate(43.86%),Abamectin(46.21%)andChlorantraniliprole(61.21%),Tebufenozide(77.38%).TheresultindicatedthatinhibitingeffectofChlorantraniliproleandTebufenozidewerelowest.ToxicityofmixingofChlorantraniliproleandB.bassiana(Bb0601),TebufenozideandB.bassiana(Bb0601)were22.60mg/Land5.20mg/L.Comparedwiththetwoinsecticides,theLC50decreasedby35.76%and30.85%respectively.Thatthesporescouldattach,germinateandpenetrateonthebodywallwasobservedbyscanningelectronmicroscopyafterusingthemixtureofB.bassianaandinsecticides.TheresultsshowedthatthegerminationandgrowthofthesporeswereinvolvedintheearlylethaleffectofthemixtureaginstP.xylostella.3AntioxidantresponseofPlutellaxylostellainfectedbyBeauveriabassianaTheantioxidantlevelofP.xylostella3instarlarvaeafterbeinginfectedbyB.bassiana(Bb0601)withconcentrationwas4.2×106/ml,andcontrolgroupreplacedwithdistilledwater.TheresultsshowedthattheactivityofCAT,SODandPODofP.xylostellaincreasedinvaryingdegreeswithin16h,indicatingthatthethreeenzymeswereinvolvedintheantioxidantactivityintheearlystageoftheinfection.TheactivitylevelofSODwashigherthanthatofcontrolgroupallthetime,indicatingthattheenzymeplayedanimportantroleintheresistanceofP.xylostellatoB.bassiana.TheactivitylevelofPODwaslowerthanthatofthecontrolgroupallthetime.TheactivityofCATdecreasedrapidlyandlowerthanthatofthecontrolgroupafterbeinginfectedfor24hours.ItIV AbstractindicatesthattheactivityofPODandCATwasinhibited,probablybecauseofthedecreaseinthelevelofthesyntheticproteinofP.xylostellainfectedbyB.bassiana,maybeitwasrelatedtothedeclineofthesyntheticproteinlevelandbreakofitsphysiologicalbalanceofP.xylostellainfectedbyB.bassiana.Keywords:Plutellaxylostella;Beauveriabassiana;occurrencedynamic;levelofresistance;mixingofinsecticides;antioxidantresponseV 第1章文献综述第1章文献综述1小菜蛾及其研究概况1.1小菜蛾的发生与危害小菜蛾（PlutellaxylostellaL.）属鳞翅目（Lepidoptera）菜蛾科（Plutella），俗称“吊丝虫”，是一种世界性害虫，主要危害十字花科蔬菜，如甘蓝、结球甘蓝、芥菜等。小菜蛾的危害不仅会降低作物的产量和质量，发生严重时甚至引起绝产，在缺乏适宜的食物时，小菜蛾会以十字花科杂草作为替代食物（吴伟坚,1993）。小菜蛾主要危害植物叶片，初孵幼虫会潜入叶片取食叶肉留下叶的角质层形成透明斑块，俗称“开天窗”。3龄幼虫进入“暴食期”，严重时会将整张叶片啃食只剩叶脉部分。有报道称小菜蛾起源于地中海地区（Hardy,1938），其发育温度为10~35°C。温度超过30°C会降低雌成蛾的产卵量甚至引起不孕，高于35°C会大大降低卵的孵化率。小菜蛾在我国的发生情况有明显的南北差异，在北方大部分地区发生高峰为5~6月份和9~10月份，南方地区为2~5月。北方地区一年发生4~5代，亚热带地区可发生8~12代，而在热带地区可达20代，而且在田间世代重叠严重（李云瑞等,2002;刘绍友等,1990;马春森等,1995）。小菜蛾具有很强的迁飞能力，迁移距离可超过3000km（Marsh,1917;TaIekarandShelton,1993）。这种远距离迁移的能力使得小菜蛾在世界范围内广泛传播，并且可与世界其它地区的种群随机交配（Endersbyetal.,2006;）。我国不同地区小菜蛾种群遗传分化程度低，存在着基因交流现象。在温带地区小菜蛾发生严重的年份，造成严重危害的小菜蛾种群多是由其他地区迁移而来的（FrenchandWhite,1960）。在对小菜蛾种群发生“突增”或“突减”的现象进行分析后，确定了我国部分地区小菜蛾的迁飞路线为南京至大连，安阳至沈阳，故城至公主岭（邢鲲等,2016）。小菜蛾在我国的越冬北限为武汉至驻马店地区，并且小菜蛾有迁入和迁出的现象（邢鲲等,2013）。防治小菜蛾的费用每年都在上涨，上世纪90年代约为十亿美元，而到2012年该数值达到40~50亿美元（Zaluckietal.,2012）。潼南县是重庆市蔬菜产业发展的重点县，十字花科蔬菜深受人们喜爱，并且经济效益良好，是秋冬季主要的配套蔬菜。如今人们仍习惯用化学药剂来防治害虫，农药乱用、滥用现象突出，不仅给环境保护带来了前所未有的压力也促使害虫的抗药水平迅速提升。加上种植过程中连作问题严重，由小菜蛾造成的损失也越来越大。因此，研究小菜蛾在该地区的发生规律及越冬习性，对小菜蛾的防治具有重要的指导意义。1.2小菜蛾抗药性现状我国目前害虫防治仍以化学防治为主，广谱杀虫剂的大量使用是造成小菜蛾抗性迅速升高、大规模爆发的外在因素（但建国等,1995;沈长朋,1997）。自1953年有学者报道了在印1 西南大学硕士学位论文度尼西亚地区小菜蛾对有机氯杀虫剂DDT产生了抗性以来（Ankersmit,1953），世界其他国家和地区也有学者相继报道了关于小菜蛾抗药性的研究结果。如在东南亚地区小菜蛾对定虫隆和伏虫隆的抗性最高达到了三千多倍。随着我国蔬菜种植面积扩大，加上农药不合理使用，小菜蛾已经对大多数的杀虫剂产生了抗性，有的药剂抗性倍数高达数千倍，甚至连新型的生物农药Bt和昆虫生长调节剂也出现了抗性问题（帅应垣等,1998;冯夏等,2001;江腾辉等,2003,向延平等,2001;郭世俭等,2003）。小菜蛾在华南、西南和华东的十字花科蔬菜主产区抗性水平较高，其中以海南儋州地区最高（冯夏等,2011）。小菜蛾抗药性的发展与其生存地区的气候、用药频率和种群数量有关，不同地方的的小菜蛾抗药性水平存在明显差异，而且寄主植物的不同也会影响小菜蛾对药剂的敏感性和解毒酶活性（尹飞,2013）。杀虫剂除了能直接杀死昆虫外，还会对非靶标生物产生亚致死效应，这会导致昆虫表观和生理状况发生改变（DesneuxNetal.,2004;CutlerGCetal,2006）。小菜蛾抗性的产生往往伴随着其生物适合度的下降，不同的抗性种群的在适合度上的表现不尽相同。抗氯虫苯甲酰胺种群雌成虫产卵量下降、雄成虫寿命缩短，而且其幼虫生长历期变长，幼虫的存活率和蛹的羽化率都会下降，进而导致种群的净增殖率和内禀增长率下降（牛芳等,2011）；抗丁烯氟虫腈种群的产卵率增加，但其适合度仍低于敏感品系（牛洪涛等,2007）。潼南地区作为重庆市着力打造的“西部绿色菜都”，如何安全使用农药，延长高抗性水平农药的使用寿命，减缓害虫抗性增长速度，降低农药使用量，对于当地农业发展具有至关重要的作用。1.2.1阿维菌素阿维菌素由灰色链霉菌（Streptomycesavermitilis）菌株发酵产生，属于抗生素类杀虫剂。抗生素类杀虫剂主要由微生物或者其代谢产物，该类杀虫剂杀虫活性强，对环境安全，对人畜低毒（Yoonetal.,2004）。在天然阿维菌素中，杀虫效果最强的组分是B1a和B1b（Pitternaetal.,2009）。而且阿维菌素的衍生物如伊维菌素（Ivermectin）、甲基阿维菌素苯甲酸盐（Evermectinbenzoate）、埃玛菌素（Emamecrin）等同样具有良好的杀虫活力。阿维菌素兼具胃毒和触杀功效，进入虫体后引发神经细胞释放γ-氨基丁酸（GABA），特异性破坏谷氨酸控制的氯离子通道，大量的氯离子释放导致神经细胞膜超极化，电位传导受阻，损伤神经系统（Pongetal.,1980）。关于小菜蛾对抗生素类杀虫剂的报道屡见不鲜。上世纪九十年代年在马来西亚地区小菜蛾对阿维菌素产生了近两百倍抗性，在北美地区其抗性也达到了两百多倍。二十世纪末期小菜蛾对该类农药抗性还比较低，随着我国该类药剂的大量使用，小菜蛾对其抗药性提高十分迅速（周立娟等,2011）。在陕西部分地区、华中地区、江西等地小菜蛾对阿维菌素均产生了高水平抗性（殷劭鑫等,2016;夏耀民等,2013;陈洁琼等,2014）。在云南其抗性更是达到了5000倍，在经过室内连续汰选22代后，其抗性达到了23670倍（Pu,2010）。以上研究结果2 第1章文献综述说明小菜蛾对该类农药的抗性风险有继续上升的可能，应加强对该类农药的监管力度。1.2.2氯虫苯甲酰胺氯虫苯甲酰胺登记名为“康宽”，主要靶标生物为鳞翅目昆虫，该农药残留低，对人畜低毒，是一种环境友好型产品。其作用机理是特异结合鱼尼丁受体（RyRs），继而破坏内的钙离子平衡环境，导致取食该种药剂的昆虫肌肉瘫痪、进食停止，最终死亡（Ebbinghaus-Kintscheretal.,2006;王靖等,1997）。有研究发现氯虫苯甲酰胺会对影响苹果蠹蛾的正常交配，还会影响其雄蛾的行走和展翅（Knightetal.,2007）。相对于拟除虫菊酯类和氨基甲酸酯类等药物，取食含有氯虫苯甲酰胺的食物后会使小菜蛾更快停止进食（Hanning,2009）。小菜蛾对氯虫苯甲酰胺的抗药性发展非常迅速，该药剂2008年登记使用，短短几年间国内外均发现了高抗的种群。泰国地区小菜蛾抗性已达两百多倍（TroczkaBetal.,2012）。2011年广东、广西监测地区的小菜蛾抗性对氯虫苯甲酰胺为敏感水平，然而到2013年其抗性水平最高达到了506倍，华南地区其抗性也达到了两千倍（EdralinODetal.,2011;尹飞等,2014）。有研究表明氯虫苯甲酰胺抗性的形成中羧酸酯酶和多功能氧化酶的表达起到了重要作用（邢静等,2013）。1.2.3拟除虫菊酯类杀虫剂在自然界植物中存在着大量除虫菊酯，但昆虫的进化过程中对其抗性发展十分缓慢，所以有学者认为昆虫对该类物质不会产生过高抗性，其防治害虫前景宽广（姜家良等,1984）。人们利用天然除虫菊酯研制出拟除虫菊酯类杀虫剂来替代抗药性问题突出的有机磷农药，拟除虫菊酯类杀虫剂因其良好的杀虫效果和低毒、低残留的表现迅速被人们接受。但随着该类药剂使用的不断扩大，害虫不仅产生了抗药性，而且发展速度甚至超过了有机磷类药物（刘维德,1990）。拟除虫菊酯类药剂交互抗性问题也十分突出，对相同和不同类型药剂都会产生不同程度抗性（张文吉等,1992）。小菜蛾对拟除虫菊酯类药剂产生的抗药性更稳定，在停止使用后害虫对该类药剂抗性无法恢复至敏感水平（兰亦全,2004,Liuetal.,1981;Chou&Cheng,1983;Chen&Sun,1986）。山东和浙江地区小菜蛾对该种药剂抗性分别达到63.9倍和52.5倍的高抗水平。江苏地区对该类药剂产生了78~324倍抗性（顾中言等,2001）。南京地区其抗性超过130倍（王建军等,2000）。长沙地区小菜蛾对氰戊菊酯产生了300.6~723.6倍的抗性（周程爱等,2000）。室内汰选小菜蛾对溴氰菊酯的抗性品系，60代后抗性达1163倍（陈之浩等,1994）。说明小菜蛾对该类药剂的抗性风险处于较高水平。1.2.4酰基肼类杀虫剂酰基肼类化合物属于非甾醇类化合物，主要靶标生物是鳞翅目、鞘翅目及双翅目昆虫。其作用机制类似于蜕皮激素，可作用于在昆虫生长发育的各阶段。甲氧酰肼（RH-2485,3 西南大学硕士学位论文methoxyfenozide）和环氧酰肼（RH-0345,halofenozide）是该类产品衍生物，其保留了该类产品的优点的同时还具有更高的活性。我国珠三角地区小菜蛾对虫酰肼抗性倍数在3.05~86.38之间（周丽娟,2011）。南京地区小菜蛾对虫酰肼抗性水平较低，处于敏感水平（吴敏,2005）。贾变桃对江苏和河南6个地区的不同小菜蛾种群进行监测，发现其对虫酰肼抗性倍数较低，仅为6.9~11.7倍（贾变桃等,2007）。有报道，美国亚利桑那州的甜菜叶蛾对该类药剂产生5.2倍抗性，在进行不连续三代汰选后，甜菜叶蛾的1龄和3龄幼虫的抗性分别达到了45~68倍和150~1500倍（Moultonetal.,2002）。可见昆虫对该类药剂有产生更高抗性的风险。2球孢白僵菌研究进展“3R”问题即抗性（Resistance）、残留（Residue）、再猖獗（Resurgence）。随着“3R”问题日益严重，人们对无污染无残留的生物防治手段越来越重视。自然界中，昆虫存在许多真菌、细菌、病毒、线虫等病原微生物天敌。昆虫病原真菌是其中最大的类群，昆虫病原真菌是指能够直接侵染、增殖和迅速杀死处于正常生理条件下寄主的真菌类群。昆虫病原真菌种类多、寄主范围宽，往往一种菌剂能侵染许多不同目的昆虫。昆虫病原真菌自然资源十分丰富，在自然界中对调节虫口密度有着至关中的作用（刘青娥等,2005）。2.1球孢白僵菌分类及致病机理球孢白僵菌（Beauveriabassiana）属于半知菌亚门（Deuteromycotina），丝孢纲（Hyphomycetes），丛梗孢目（Moniliales），丛梗孢科（Moniliaceae），白僵菌属（Beauveria）。白僵菌寄主范围广泛，可寄生鞘翅目、半翅目、鳞翅目等共计15目、149科、521属、707种昆虫，以及蜱螨目的6科、10余种螨和蜱（LiMYetal.,2014;ZhangLWetal.,2011;BidochkaMJ,1990）。人们对白僵菌的研究可追溯到1807年意大利学者对养蚕业中的蚕硬化病的研究（PorterJR，1973）。其分类地位直至1912年才确立为白僵菌属（Beauveria）（VuilleminP,1912）。直到2005年才确定了白僵菌的6个进化分支（RehnerSA,2005）。白僵菌致病力强，自然界中亦有因白僵菌导致大量害虫死亡的现象，一般情况下虫生真菌对寄主或者与原寄主相近种的致病力比较高（曹伟平等,2011;SoaresGGJR,1983）。白僵菌侵染寄主后可继续增殖，为其继续侵染其他寄主提供了良好的条件（张慧等,2016）。而且白僵菌还能抑制一些病害真菌如茎点霉、拟盘多毛孢菌、杨树腐烂病菌的生长（李英等,2018）。球孢白僵菌侵染过程主要包括分生孢子在体表附着附着、菌丝生长和分泌胞外水解酶等过程，此外还能进入寄主的呼吸系统和消化系统侵染（clarkson,1996;宋入梅等,2006）。在体壁上的侵染包括分生孢子的附着、萌发、侵入体壁、菌丝在血腔内生长等几个过程（VegaFEetal.,2012）。如果寄主体壁有伤口会更利于其侵染，一般昆虫体壁都有厚厚的角质层保护，球孢白僵菌孢子必须分泌出几丁质酶、蛋白酶和脂肪酶等水解酶溶解体壁的角质层后在菌丝的机械压力下才能穿透体壁，进入虫体内的菌丝进一步侵入寄主血腔吸收寄主身体的营养物质4 第1章文献综述（Ortiz-UrquizaA,2016;ZhangYetal.,2008;FangWetal.,2009）。白僵菌侵染昆虫后还可以分泌毒素攻击昆虫脂肪体、中肠和马氏管细胞，降低器官功能，破坏免疫系统获得免疫逃逸，破坏生理活动正常运行最终导致昆虫死亡（薛皎亮等,2006;王树昌等,2017）。不同株系的白僵菌耐受度和致病力存在差异，菌株的生长环境对其产孢量和致病效果也存在很大的影响。有研究表明白僵菌生的适宜长pH为4~10，而且pH偏酸性能提高进白僵菌产孢量和孢子活力（孙明等,2011;刘天美等,2009）。温暖潮湿的环境有利于白僵菌的繁殖与传播，所以白僵菌在我国长江中下游地区更利于应用（张龙娃等,2016）。2.2球孢白僵菌与药剂混配作用机理在实际生产应用中，害虫往往混合发生，单一种类的药剂无法将害虫控制在经济阈值之下，多种药剂混合使用是一种方便快捷的措施，但也带来了严重的环境污染问题。昆虫病原真菌与化学药剂联合防控害虫具有重要的意义，这样不仅解决生物防治杀虫速度慢的问题，又可减轻化学药剂过度使用的问题（彭家昌等,2016）。并且菌药混配在上世纪80年代起就有了一定的研究基础（AndersonTEetal.,1983）。由于化学杀虫剂或多或少会影响生物制剂本身的致病效果，混配后的菌药合剂有可能会出现拮抗作用、相加作用或增效作用。所以在混配前筛选出与昆虫病原真菌相容性高的化学制剂在实际应用中有着重要的生物学意义（QuintelaEDetal.,1997）。化学杀菌剂普遍对球孢白僵菌的产孢量、孢子萌发、菌丝生长抑制作用明显，不适合与白僵菌混合使用。与化学杀菌剂相比，化学杀虫剂对白僵菌的抑制作用更低，更适合与其混配。杀虫剂氧化乐果、氯氰菊酯、吡虫啉等与白僵菌的相容性较好，而阿维菌素对球孢白僵菌孢子萌发，菌丝生长抑制力较强（徐艳聆,2009）。3小菜蛾感染球孢白僵菌后抗氧化反应的研究昆虫正常的体内代谢过程中会产生活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS），其中包括超氧阴离子（Superoxideanion,O2˙‾）、过氧化物（Hydrogenperoxide,H2O2）和羟自由基（Hydroxylradicals,HO˙‾）等物质（Lopez-Martinezetal.,2008;王爱国等,1998）。这些自由基会损伤细胞DNA、改变蛋白质结构和构象，大量的活性氧存在还会氧化细胞膜，从而毒害细胞（GreenandReed,1998）。但昆虫体内有一套完整的活性氧的产生与清除系统，通常昆虫体内的活性氧的产生与清除处于一种动态平衡中。外界环境发生改变时，会刺激昆虫做出应激反应，体内原有的平衡系统可能会被打破，比如细胞内ROS浓度增加。当增加的ROS的浓度超过了其自身的调节范围就会对机体造成损伤甚至导致昆虫死亡（Wangetal.,2001）。超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase,SOD）广泛存在生物体中，是生物体清除活性氧的第一道防线，在生物体抗胁迫的作用中扮演着重要角色（KimoxideBMetal.,2011）。超氧化物歧化酶是一种含有金属元素活性中心的酶，主要有Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD以及Ni-SOD4种类型。它们在不同种类生物的类型和位置有一定差异（ZeinaliFetal.,2015;Youn5 西南大学硕士学位论文HDetal.,1996）。Cu/Zn-SOD主要存在真核生物中。Mn-SOD在原核生物中位于细胞质，在真核生物多位于线粒体基质。Fe-SOD存在于许多种类的细菌、藻类、高等植物的叶绿体中和一些生物的细胞核中。Ni-SOD主要存在于藻类和链霉菌中（袁牧等,2016;MillerAFetal.,2012;RubioMCetal.,2009;Takanoetal.,2013）。昆虫体内代谢会产生超氧离子O2˙‾，该物质氧化性强对机体破坏性大。超氧离子在过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的催化下生成H2O2来降低对机体的伤害（Zhangetal.,2015）。过氧化氢酶(Catalase,CAT)是一种以铁卟啉环为辅基的末端氧化酶，其生物学功能是催化细胞内过氧化氢分解成水使细胞免受毒害（刘昌玲等,1990）。根据其来源可以分为真核CAT和原核CAT。真核生物中CAT主要存在于细胞器内，不同组织中的含量高低差别很大，哺乳动物肝脏中CAT含量最高。原核CAT存在于大多数需氧微生物中（刘冰等,2005）。POD按其序列差异可以分为两个超家族，一类来源于动物，一类来源于细菌、真菌和植物（WelinderKGetal.,1992），其主要作用是催化各种氧化反应（DunfordHBetal.,1976）。在对小菜蛾施用不同化学药剂时其体内的抗氧化酶系也会出现不同程度变化。小菜蛾对阿维菌素的抗性品系和敏感品系的保护酶活力有差异，但这种变化随着虫龄的增长而逐渐减小（吴青君等,2011）。小菜蛾保护酶系统具有能量保守性，对小菜蛾施用虱螨脲、亚精胺后其体内抗氧化酶活力均出现了不同程度上升（王楠等,2009;贾变桃等,2016）。小菜蛾在感染昆虫病原真菌时体内抗氧化酶活力水平会产生不同反应来应对外源物质入侵。小菜蛾在感染玫烟色棒束孢后体内抗氧化酶活力水平先上调高于对照组后下调低于对照组（王宏民等,2013）。顶孢霉侵染后小菜蛾体内抗氧化酶活力水平也出现了下降（王焱等,2010）。钩麦蛾幼虫被四脊裸胞壳Dh菌株侵染后体内保护酶活力水平总体上呈上升趋势，过氧化物酶（POD）活性和过氧化氢酶（CAT）活性先下降后上升，超氧化物歧化酶（SOD）活性缓慢上升（朱建兰等,2008）。而小菜蛾感染球孢白僵菌后体内抗氧化酶的变化及机制目前研究还比较少。综上所述，本论文围绕如何对小菜蛾进行绿色防控的问题开展了一系列研究。球孢白僵菌作为生物防治中研究和应用最为广泛的昆虫病原真菌，其与化学药剂混配又为小菜蛾的绿色防控及农药减施提供了新的方向。生物防治绿色环保和和化学杀虫剂防治作用效果快的特点相结合，不仅能大大提高防治效果，还能减轻环境污染压力。6 第1章文献综述7 西南大学硕士学位论文技术路线小菜蛾发生动态及越冬态调查小菜蛾种群建立感染白僵菌后抗球孢白僵菌筛选研究化学药剂筛选研究氧化反应研究与SODCATPOD高优侵化对化与致良染学小学白病株过药活活活菜药僵力系程剂性性性蛾剂菌株毒观混水水水毒混的系力察配平平平力配相筛测研研研研研测研容选定究究究究究定究性球孢白僵菌防效研究抗氧化反应研究化学药剂防效研究对小菜蛾的绿色防控技术研究8 技术路线9 西南大学硕士学位论文第2章潼南地区秋冬季小菜蛾田间发生动态调查重庆属亚热带季风性湿润气候，年均温度在18℃左右，冬季低温平均在6~8℃，极少发生严寒天气，适宜蔬菜种植。蔬菜产业是重庆经济支柱产业之一。潼南县作为传统农业大县，2007年被评为重庆市蔬菜产业发展重点县。潼南地区有温暖的气候和优良的土壤条件，适宜蔬菜种植耕地面积达70万亩，该地区秋冬季主要配套种植蔬菜为十字花科作物。这些都为小菜蛾的生长发育、越冬提供了有利的条件。了解该地区小菜蛾的发生动态及越冬情况，可以为了解重庆地区小菜蛾的发生规律提供重要的参考依据，对于蔬菜安全生产和害虫可持续防控防治有重要的指导意义。本论文从2016年10月到2017年3月依托重庆市潼南区太安镇罐坝村国家级现代农业科技园对小菜蛾发生动态及越冬情况展开了系统调查。1材料与方法1.1材料及地点1.1.1材料小菜蛾诱芯（北京中捷四方生物科技股份有限公司）、黄板、船型诱捕器、斜面插地标签、甘蓝1.1.2地点重庆市潼南区太安镇罐坝村国家级现代农业科技园1.2调查方法1.2.1调查时间与频率从2016年10月至2017年3月。自定植日起，每7天调查一次，连续监测。1.2.2调查方法选取一块固定甘蓝田作为调查地点，面积约667m2，调查期间不使用任何化学农药。采用五点取样法，每点取10株甘蓝作为调查对象，以斜面地插做标记，取样共计50株。调查统计整株植物上小菜蛾卵、幼虫和蛹的数量。1.2.3成虫调查方法使用船型诱捕器，每7d调查1次诱蛾量，计数后清除黄板上死蛾。每个诱芯使用不超过30d。10 第2章潼南地区秋冬季小菜蛾田间发生规律调查1.2.4越冬态调查五点取样法同1.2.2。于1月份调查甘蓝上累计出现的小菜蛾幼虫和蛹，并统计数量。1.3数据统计与分析数据统计与分析采用Excel和SPSS19.0软件，Origin9.1作图。2结果与分析2.1小菜蛾的发生规律图2.1小菜蛾幼虫与成虫季节发生动态Figure2.1TheseasonaldynamicsofPlutellaxylostellalarvaeandadults在秋冬季甘蓝定植初期，10月25日小菜蛾幼虫为40头/百株，小菜蛾成虫诱捕量为40头/周（图2.1）。随时间推移日均气温降低，发生数量减少，进入越冬前在1月3日下降到5头/百株。但在冬季气温很低的1月24日和2月7日调查发现仍有幼虫存活。越冬后幼虫和成虫在3月7日前后开始活动，幼虫数量达20头/百株，成虫诱捕量为2头/周。小菜蛾幼虫和成虫的发生量与温度的相关性经Pearson检验，在0.01水平上显著相关。小菜蛾幼虫和成虫的发生量随温度降低而减少，随温度回升而增加。11 西南大学硕士学位论文2.2越冬态调查图2.2小菜蛾幼虫蛰伏在叶片上图2.3小菜蛾蛹Figure2.2LarvaeofPlutellaxylostellaisdormantontheleafFigure2.3PupaofPlutellaxylostella图2.4小菜蛾越冬虫态调查Figure2.4InvestigationontheoverwinteringinsectstateofPlutellaxylostella经调查发现，在潼南地区小菜蛾主要以4龄幼虫和蛹的形式进行越冬（图2.2，图2.3）。小菜蛾越冬形态中蛹的数量明显多于幼虫。在1月份，小菜蛾越冬态蛹的数量达20头/百株，4龄幼虫为8头/百株，未发现卵和成虫（图2.4）。3结论与讨论调查结果表明，发生初期10月25日小菜蛾幼虫为40头/百株，成虫诱捕量为40头/周。12 第2章潼南地区秋冬季小菜蛾田间发生规律调查越冬后，小菜蛾幼虫和成虫活动始见期在3月7日前后，幼虫数量达20头/百株，成虫日均诱捕量为2头/周，幼虫发生程度为2级。根据我国《十字花科蔬菜病虫害测报技术规范》该地区小菜蛾发生程度为2级，且小菜蛾可以以蛹和4龄幼虫的形态在潼南地区安全越冬。小菜蛾幼虫和成虫的发生量与温度显著相关，其发生量都随温度降低而逐渐减少，随温度回升而增加。有研究表明小菜蛾无法在长时间温度低于0°C的地区越冬，但因各地环境和小气候不同，同纬度地区也会出现差异。在陕西太白地区越冬幼虫约有13%的存活率。在陕西延安地区小菜蛾无法越冬（苗鑫,2018;尹园园,2014）。在我国驻马店以南地区小菜蛾可以通过4龄幼虫、蛹与成虫安全越冬（邢鲲等,2013），本试验调查结果与其基本相符。13 西南大学硕士学位论文第3章高致病力球孢白僵菌和化学药剂的筛选小菜蛾已成为一种世界性害虫，并且在20世纪60年代后逐渐成为许多国家和地区的主要害虫。小菜蛾能成为重要的害虫主要在于其自身适应能力、生殖力、迁飞能力强。广谱杀虫剂的长时间、高剂量的使用是造成其爆发增长的外在因素。在这种条件下小菜蛾对各种杀虫剂抗药性急剧上升，并且对多种药剂产生了数千倍的抗性，给小菜蛾的长期防治带来了前所未有的压力（但建国等,1995;冯夏等,2011）。昆虫病原微生物作为生物防治中一种极为有效的防治手段，备受关注。随着深入研究，发现白僵菌侵染效果十分稳定，而且虫生真菌无任何环境污染的副作用。但是球孢白僵菌的应用会因野外复杂的寄主生态系统以及多变的气候因子而防治效果不稳定。结合生物防治绿色环保和和化学杀防治作用效果快的特点，防治时将两种手段配合使用能大大提高防治效果，并且能减轻环境污染压力。本研究测定了9种球孢白僵菌株系和5种化学杀虫剂对潼南地区小菜蛾3龄幼虫的毒力，筛选出对小菜蛾毒力较强的白僵菌株系和杀虫剂。利用筛选出的高效白僵菌株系和化学杀虫剂进行相容性试验，确保二者能够复配混用，将二者按照不同比例混配，分别计算共毒系数并求出最优配比。利用扫描电镜观察白僵菌和化学药剂联合致死作用中的白僵菌萌发情况。1材料与方法1.1供试菌株供试球孢白僵菌菌株由西南大学生物技术中心张永军研究员提供。其来源见表3.1。表3.1球孢白僵菌株系信息Table3.1Beauveriabassianafungiinformation名称种名采集地宿主IsolatesspeciesLocationHostBb0601Beauveriabassiana贵州象甲CHLBeauveriabassiana不详不详Bb014Beauveriabassiana不详不详Bb07Beauveriabassiana不详桃蚜Bb02Beauveriabassiana不详不详Bb025Beauveriabassiana不详不详Bb252Beauveriabassiana安徽松毛虫Bb0603Beauveriabassiana贵州叶蝉Bb0604Beauveriabassiana西双版纳不详本试验中使用到的白僵菌株系共9种，室内采用PDA培养基进行培养和保存。14 第3章高致病力球孢白僵菌和化学药剂的筛选1.2供试昆虫小菜蛾试验种群采集于重庆市潼南区太安镇灌坝村国家级现代农业科技园，于室内以甘蓝和萝卜苗连代饲养多代。小菜蛾敏感种群由南京农业大学吴益东教授提供。1.3小菜蛾饲养条件小菜蛾饲养采用甘蓝萝卜苗法。甘蓝（京圆1号）甘蓝长出6片叶时便可用于小菜蛾接卵饲养。萝卜（爱罗小萝卜）出苗四天长出两片叶便可用于小菜蛾接卵饲养。用于饲养的人工气候室（25±1°C，RH=65±5%，L:D=8:16）要求保温、通风且光照充足。1.4马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基的制备每升水中加入马铃薯200克、葡萄糖20克、琼脂20克，自然pH。马铃薯洗净去皮，切成小块煮30分钟，取4层纱布过滤液，再入葡萄糖、琼脂，加热搅拌混匀，加热水补足1升。分装到锥形瓶中，封口后115°C灭菌20分钟，冷却后贮存备用。1.5孢子悬浮液母液的制备刮取PDA培养基中生长12d的球孢白僵菌孢子，溶解于0.05%吐温-80无菌水中，涡旋振荡器上振荡均匀后用无菌纱布过滤。用血球计数板计数，用0.05%吐温-80无菌水将孢子悬浮液释至1×108个/mL备用。1.6对小菜蛾高毒的球孢白僵菌筛选本试验共涉及9个白僵菌株系。先将每个株系配制成浓度1×107个/mL的悬浮液，甘蓝叶片用9cm打孔器切成圆片备用。再将小菜蛾4龄幼虫浸入孢子悬浮液中5s后将幼虫转移至新鲜甘蓝叶片上，置于9cm培养皿中，底部用滤纸保湿。培养皿用保鲜膜封口后均匀扎孔，置于人工气候箱中培养（27±1°C，RH=65±5%，L:D=8:16）。每个处理3个重复，每个重复15头。对照组叶片用蒸馏水处理，相同条件下培养。24h、48h、72h、96h、120h后取出，记录死、活虫数，用毛笔轻触无反应则认为幼虫死亡。空白对照的死亡率在20%以上，试验需重做。处理虫口减退率−对照虫口减退率校正死亡率(%)=×100%1−对照虫口减退率1.7球孢白僵菌株系致病力测定将配制好的孢子悬浮母液用无菌水稀释成1×107个/mL、7.5×106个/mL、5.0×106个/mL、2.5×106个/mL、5.0×105个/mL5个浓度梯度。选取健康的小菜蛾3龄幼虫进行试验，方法同本章1.6。15 西南大学硕士学位论文1.8数据处理数据处理采用Excel和SPSS19.0软件，Origin9.1作图。1.9对小菜蛾高毒化学农药筛选及毒力测定1.9.1供试药剂（1）98%阿维菌素原药（郑州腾达化工原料有限公司）（2）20%氯虫苯甲酰胺悬浮剂（美国杜邦公司）（3）20%虫酰肼悬浮剂（河北神华药业有限公司）（4）95%高效氯氰菊酯原药（湖北远成赛创科技有限公司）（5）70%甲氨基阿维菌素苯甲酸盐原药（浙江升华拜克公司）1.9.2供试昆虫同本章1.2。1.9.3试验方法（1）配制药剂浓度。以预试验结果将致死率在20%~90%的浓度配置成5个浓度梯度。阿维菌素和高效氯氰菊酯、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐和高效氯氰菊酯原药用丙酮溶解，用0.1％曲拉通配成1000mg/L母液备用。将阿维菌素配制成5种浓度：225mg/L、250mg/L、275mg/L、300mg/L、325mg/L；高效氯氰菊酯配制成100mg/L、200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L；甲氨基阿维菌素苯甲酸盐配制成8mg/L、9mg/L、10mg/L、11mg/L、12mg/L。氯虫苯甲酰胺和虫酰肼为悬浮剂，用0.1％的曲拉通溶解。氯虫苯甲酰胺配制成：1mg/L、4mg/L、7mg/L、10mg/L、13mg/L;1000mg/L；虫酰肼配制成：10mg/L、30mg/L、50mg/L、70mg/L、90mg/L。每种药剂的每个浓度设置了3个重复，每个重复15头3龄幼虫，以0.1％曲拉通为对照。（2）直径为9cm培养皿，底部用滤纸保湿。（3）用打孔器将新鲜未接触过化学农药的甘蓝叶片切成略小于培养皿的圆片备用。叶片分别浸入到上述的浓度和对照溶液中10s，取出自然晾干。（4）挑选健康、大小一致的3龄小菜蛾幼虫。在每个培养皿的叶片上接入15头。用保鲜膜封口后均匀打孔，置于人工气候箱中培养（27±1°C，RH=65±5%，L:D=8:16）。（5）试验后24、48、72h分别观察死亡情况，记录死、活虫数。1.9.4数据处理方法数据处理采用Spss19.0软件，计算出毒力回归方程、LC50值、95%的置信限、抗性倍数（RR）。小菜蛾的抗药性分级标准参照行业标准NY/T2360-2013：抗性倍数（RR）＜10为16 第3章高致病力球孢白僵菌和化学药剂的筛选低水平抗性，10≤RR＜100为中等水平抗性，RR≥100为高水平抗性。1.10化学农药的复配1.10.1供试昆虫同本章1.2。1.10.2试验方法同本章1.3。根据1.3得到的试验结果，选出两种高效杀虫剂虫酰肼和氯虫苯甲酰胺进行混配，进行毒力测定。1.10.3数据处理根据孙云沛的共毒系数公式求出各混剂的共毒系数（SunYP,1960）。供试药剂毒力指数(TI)=标准药剂LC50值×100供试药剂LC50值混剂的实际毒力指数(ATI)=标准药剂LC50值×100混剂LC50值混剂的理论毒力指数(TTI)=TI(a)×a占混剂的质量分数+TI(b)×b占混剂的质量分数共毒系数(CTC)=混剂的实际毒力指数ATI/混剂的理论毒力指数TTI×100所得共毒系数进行比较，复配剂的共毒系数CTC≥120表现为增效作用；CTC≤80表现为拮抗作用；80