锌指蛋白A20在Behcet病和Vogt-小柳原田综合征发病机制中作用的研究

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分类号：学号:R773.92014020042重庆医科大学博士学位论文（专业学位）锌指蛋白A20在Behcet病和Vogt-小柳原田综合征论文题目发病机制中作用的研究作者姓名何跃指导教师姓名（职称、单位名称）杨培增教授重庆医科大学附属第一医院专业学位类别名称临床医学专业学位领域名称眼科学论文答辩年月2018年5月 重庆医科大学研宄生学位论文独创性声明本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果＝据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外论文，中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庆医科大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料与我同工作的同志对本研究所做的任何，贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处一，本人承担切相关责任＾学位论文作者签名：仍运夂ｂ期：況崎ｑ如ａ学位论文版权使用授权书本人完全了解重庆医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属重庆医科大学。本人保证毕业离校后发表论文或，使用论文工作成果时署名单位为重庆医科大学？学校有权保留并向国家有关部门或机构培交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），并编入有关数据库进行检索，可以采用影印＇缩印或其他手段保存论文。保密论文在解密后适用本授权书。论文作者签名：０多大、）指导教师签名：曰期：月如 目录英汉缩略语名词对照.......................................................................................................1中文摘要...........................................................................................................................2英文摘要.........................................................................................................................12论文正文：锌指蛋白A20在Behcet病和Vogt-小柳原田综合征发病机制中作用的研究.................................................................................................................................26前言........................................................................................................................26第一部分A20在Behcet病与VKH综合征患者中mRNA表达水平的研究.........301材料及方法..........................................................................................................302结果......................................................................................................................341材料及方法..........................................................................................................362结果......................................................................................................................373讨论......................................................................................................................384总结......................................................................................................................405研究展望..............................................................................................................40第二部分A20在Behcet病患者DCs中mRNA表达水平的研究..........................411材料及方法..........................................................................................................412结果......................................................................................................................443讨论......................................................................................................................454总结......................................................................................................................465研究展望..............................................................................................................46第三部分A20在DCs中的功能研究..........................................................................481材料及方法..........................................................................................................482结果......................................................................................................................513讨论......................................................................................................................534总结......................................................................................................................545研究展望..............................................................................................................541材料及方法..........................................................................................................55 2结果......................................................................................................................563讨论......................................................................................................................574总结......................................................................................................................585研究展望..............................................................................................................581材料及方法..........................................................................................................592结果......................................................................................................................613讨论......................................................................................................................624总结......................................................................................................................635研究展望..............................................................................................................63第四部分A20对共培养体系中CD4+T细胞功能的影响.........................................641材料及方法..........................................................................................................642结果......................................................................................................................673讨论......................................................................................................................684总结......................................................................................................................695研究展望..............................................................................................................69第五部分A20对DCs功能影响的机制......................................................................701材料及方法..........................................................................................................702结果......................................................................................................................713讨论......................................................................................................................734总结......................................................................................................................765研究展望..............................................................................................................77参考文献.........................................................................................................................79文献综述：A20在自身免疫性疾病中作用的研究进展.............................................87致谢.................................................................................................................................97攻读博士期间发表文章.................................................................................................98 重庆医科大学博士研究生学位论文英汉缩略语名词对照英文缩写英文全称中文全称APCAntigenpresentingcells抗原递呈细胞BDBehcet'sdisease白塞氏病DCsDendriticcells树突状细胞EDAectodysplasin外异蛋白ELISAEnzyme-linkedimmunosorbent酶联免疫吸附试验assayERKexrtacellular-signalregulatedprotein细胞外信号调节蛋白激酶kinaseMAPKMitogenActivatedProteinKinase有丝分裂原激活蛋白激酶MLRMixedlymphocytereaction混合淋巴细胞反应MOIMultiplicityofInfection感染复数PBMCsPeripheralbloodmononuclearcells人外周血单核细胞PBSphosphatebuffersaline磷酸缓冲盐溶液PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应SAPKstress-activatedproteinkinnase应激活化蛋白激酶ThhelperTcells辅助性T细胞TLRToll-likereceptorTOLL样受体TNFAIP3TNF-α-inducedprotein3,TNF-α诱导蛋白3TNFRTNFreceptorTNF受体VKHVogt-Koyanagi-HaradadiseaseVogt-小柳原田综合征1 重庆医科大学博士研究生学位论文锌指蛋白A20在Behcet病和Vogt-小柳原田综合征发病机制中作用的研究摘要葡萄膜炎是眼部炎性疾病的一种类型，视力丧失是其最常见的表现。在中国，白塞氏病（Behcetdisease，BD）和Vogt-小柳原田综合征（VogtKoyanagiHarada，VKH）是葡萄膜炎类型中最常见的两种疾病。Behcet病包括了血管炎性病变导致的葡萄膜炎、复发性口腔溃疡和生殖器溃疡、多形性皮肤病变。VKH综合征属于自身免疫性疾病，最典型的特征是双眼肉芽肿性葡萄膜炎，同时还常伴有脑膜刺激征、听力下降、耳鸣、皮肤和毛发异常等。葡萄膜炎的治疗主要是应用皮质类固醇和免疫抑制药物，但是临床中发现使用上述药物具有严重的副作用，因此，阐明葡萄膜炎的发病机制对于开发更特异的药物具有重要的意义。A20是在经TNF-α处理后的脐静脉内皮细胞反应中检测到的一个诱导性表达蛋白，因此也被称为TNF-α诱导蛋白3（TNF-α-inducedprotein3,TNFAIP3）。在我们团队的前期研究中已经发现A20基因中的rs9494885、rs10499194和rs7753873位点的多态性与Behcet病存在相关，其中rs9494885与Behcet病存在强相关；rs9494885位点的多态性与VKH综合征存在密切相关。因此，我们将进一步研究A20在Behcet2 重庆医科大学博士研究生学位论文病和VKH综合征中的发病机制。A20表达于多个免疫器官，包括胸腺、脾脏和肠相关免疫组织等。肿瘤坏死因子受体相关因子6（Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6，TRAF6）是TOLL样受体信号通路中的关键分子，其泛素化调节是NF-κB活化的关键因素，A20则通过对调节TRAF6的去泛素化功能减弱NF-κB信号系统的活性，从而发挥对天然免疫反应的负性调节作用。近年来，越来越多的研究证实A20与树突状细胞（DendriticCells，DCs）的激活、成熟及功能密切相关。因此，A20与免疫性疾病的研究也随之增加。研究表明，缺乏A20的小鼠能够自发性的激活树突状细胞及T淋巴细胞。A20fl/flCd11c-Cre小鼠能自发的形成血清阴性强直性关节炎、淋巴细胞性结肠炎和关节附着点炎。树突状细胞中A20基因的缺乏会增强细胞抗凋亡的能力，导致炎症反应的发生。然而，除了A20基因相关多态性与眼部免疫性疾病有关外，就再无相关报道。因此，我们决定研究这种蛋白在葡萄膜炎患者及正常人血液中的表达水平。由于Behcet病和VKH综合征是临床中最常见和最容易引起失明的两种葡萄膜炎类型，所有我们选择这两种疾病进行研究。为了阐明A20作用的可能机制，我们主要研究A20如何影响树突状细胞的功能情况。3 重庆医科大学博士研究生学位论文第一部分A20在Behcet病与VKH综合征患者中mRNA表达水平的研究目的A20在自身免疫中发挥着重要的作用。在本研究中，我们探讨A20在Behcet病与VKH综合征患者中mRNA的表达水平及与两种疾病活动的相关性。方法选取活动期和静止期Behcet病患者、VKH综合征患者，同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。Behcet病和VKH综合征患者的诊断标准采用的是国际葡萄膜炎会议制定的诊断标准进行诊断。上述患者及健康人采用密度梯度离心分离外周血单核细胞，随后，提取PBMCs中的总RNA，将其反转录为cDNA，最后采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测PBMCs中A20mRNA的表达水平。结果1、活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人，而且活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显降低。2、静止期Behcet病患者及正常人的A20比较则无明显的差异。3、活动期与静止期VKH综合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表达与正常人无明显差异。4 重庆医科大学博士研究生学位论文结论我们的研究表明：活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人，而且活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显降低。静止期Behcet病患者及正常人的A20比较则无明显的差异。以上结果说明A20的降低与Behcet病的发生及发展有密切的关系。活动期与静止期VKH综合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表达与正常人无明显差异。以上结果说明A20的降低与VKH综合征的发生没有联系。5 重庆医科大学博士研究生学位论文第二部分A20在Behcet病患者DCs中mRNA表达水平的研究目的研究A20在Behcet病患者DCs中mRNA的表达水平情况及与疾病活动的相关性。方法选取活动期和静止期Behcet病患者，同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。上述患者及健康人采用密度梯度离心分离外周血单核细胞，通过磁珠分选的方法分离CD14+T单核细胞，在培养基中加入人重组GM-CSF（100ng/ml）和人重组IL-4(50ng/ml)进行DCs诱导。最后，提取DCs总RNA，将其反转录为cDNA，采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测DCs中A20mRNA的表达水平。结果1、活动期Behcet病患者DCs细胞中A20mRNA的表达水平明显低于正常人，统计有差异。2、活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平降低，统计有差异。3、静止期Behcet病患者和正常人相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平无明显差异。6 重庆医科大学博士研究生学位论文结论活动期Behcet病患者DCs细胞中A20mRNA表达水平明显低于正常人。活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平降低，而静止期Behcet病患者和正常人相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平无明显差异。这样的结果与我们前面在PBMCs中的结果是一致的。那我们现在已经明确知道，A20与DCs之间是有着紧密的联系。7 重庆医科大学博士研究生学位论文第三部分A20在DCs中的功能研究目的研究A20对Behcet病患者及健康人DCs成熟度及DCs分泌炎性细胞因子的影响情况。方法选取活动期和静止期Behcet病患者，同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。采用密度梯度离心分离外周血单核细胞，并诱导成DCs。在诱导过程中，使用腺病毒按照不同的病毒感染复数（MultiplicityofInfection，MOI）转染DCs。通过荧光显微镜及流式细胞仪检测转染效率。选取合适的MOI值，使用腺病毒转染DCs，采用流式细胞仪检测DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR，采用ELISA的方法检测DCs细胞分泌炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27的表达情况。结果1、通过带有GFP荧光基团标记的腺病毒转染DCs，使用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果发现，当MOI值为500时，绿色荧光蛋白的表达情况最高。2、当MOI值为500时，流式细胞仪检测转染效率为78.7%。人A20-shRNA腺病毒转染的DCs中A20呈现低表达。3、A20-shRNA腺病毒转染DCs后，对DCs细胞表面的成熟标记8 重庆医科大学博士研究生学位论文分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响。4、通过腺病毒转染的方法低表达A20，DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加，而IL-10和IL-27的水平降低，A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。结论腺病毒能够有效的对DCs进行转染，且转染效率高。我们制备的人A20-shRNA腺病毒能够阻断A20的表达，并进行后续的研究。A20-shRNA腺病毒转染DCs后，对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响。说明A20并不是通过对DCs细胞成熟度的影响来发挥作用。通过腺病毒转染的方法低表达A20，DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加，而IL-10和IL-27的水平降低，A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。说明A20在Behcet病发病机制中可能是通过影响DCs分泌的炎性细胞因子起作用。9 重庆医科大学博士研究生学位论文第四部分A20对共培养体系中CD4+T细胞功能的影响目的研究A20通过DCs对CD4+T细胞的影响。方法选取活动期Behcet病患者，同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。采用密度梯度离心分离外周血单核细胞，并诱导成DCs。在诱导过程中，使用腺病毒转染DCs。LPS(100ng/ml)加入培养基中刺激24小时使其成为成熟的树突状细胞。再分离CD4+T单核细胞，将DCs与CD4+T细胞按照1:4共培养，通过流式细胞技术检测Th17细胞的比例。结果A20-shRNA组共培养的CD4+T细胞中，Th17细胞所占CD4+T细胞中的比例显著升高，有统计学意义。结论A20-shRNA组共培养的CD4+T细胞中，Th17细胞所占CD4+T细胞中的比例显著升高。这样的结果也说明，Th17细胞与Behcet病的发生和发展有密切的关系，A20改变引起DCs活化和功能改变，最终引起Th17细胞改变，导致Behcet病的发生和发展。A20参与Behcet病发病机制的作用通路。10 重庆医科大学博士研究生学位论文第五部分A20对DCs功能影响的机制目的A20是通过何种信号通路来影响DCs的功能还不得而知。本部分研究A20对DCs功能影响的机制。方法选取活动期和静止期Behcet病患者，同时选取性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。采用密度梯度离心分离外周血单核细胞，并诱导成DCs。在DCs培养至第六天时，加入LPS（100ng/ml）刺激30分钟，使用流式细胞技术检测DCs中JNK、ERK1/2、P38的磷酸化水平。结果腺病毒转染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明显升高，具有统计学意义，而ERK1/2的磷酸化水平没有变化。结论腺病毒转染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明显升高，说明JNK及p38信号通路参与了A20对DCs的影响，A20可能通过JNK及p38信号通路影响DCs，导致Behcet病的发生和发展。关键词Behcet病，VKH综合征，A20，树突状细胞，CD4+T细胞11 重庆医科大学博士研究生学位论文THEROLEOFA20INTHEPATHOGENESISOFBEHCET’SDISEASEANDVOGT-KOYANAGI-HARADADISEASEABSTRACTUveitisisanintraocularinflammationthatoftenleadstovisualhandicap.ThemostfrequentuveitisentitiesleadingtoblindnessinChinaareBehcet’sdisease(BD)andVogtKoyanagiHarada(VKH)disease.BDisachronicsystemicinflammatorydiseasethatinvolvesrecurrentuveitis,genitalulcers,oralaphthae,andskinlesions.VKHdiseaseisasystemicautoimmunediseasethataffectstheeyes,skin,andcentralnervoussystem.Thecharacteristicsofthediseaseincludebilateralgranulomatouspanuveitis,poliosis,vitiligo,alopecia,centralnervoussystemsymptoms,andhearingloss.Uveitisisoftentreatedwithcorticosteroidsandimmunosuppressivedrugs,whichhaveserioussideeffectsandelucidatingthemechanismsinvolvedintheinflammatoryresponsemayhopefullyleadtothedevelopmentofmorespecificdrugs.GeneticstudiesfromourgrouprecentlyidentifiedtheassociationofcertaingenevariantsofTNFAIP3withbothVKHandBD,althoughtheexactmechanismswerenotclear.ThestudyreportedherewasthereforedevisedtofurtherexaminetheroleofthisproteininthedevelopmentofbothBDandVKH.TNFAIP3,alsoknownasA20wasdiscoveredasa12 重庆医科大学博士研究生学位论文proteinthatwasreadilyinducedfollowingthestimulationofendothelialcellswithtumornecrosisfactor,althoughlaterstudiesshowedthatitcanalsobeinducedbymanyotherstimuli.A20isexpressedinseveralimmuneorgans,includingthymus,spleenandgutassociatedimmunetissue.A20isnowknownasaproteinthatcanblockNF-κBactivationtherebymarkedlydampeningtheinflammatoryresponse.A20mediatesthiseffectviaadeubiquinationofproteinsinvolvedintheNF-κBsignalingcascadessuchasRIP1.FurtherstudieshavefoundthatA20alsoplaysanimportantroleinrestrictingTLRinducedubiquitinationofTNFreceptor–associatedfactor(TRAF)6.Inrecentyears,A20hasshowntobeinvolvedintheregulationofDCactivation,maturationandfunction,andintenseresearchhasaddresseditsroleinimmunemediateddiseases.StudieshaveshownthatmicelackingA20areabletospontaneouslyactivateDCsandTcellsinvivo.A20fl/flCd11c-Cremicecanspontaneouslydevelopsero-negativeankylosingarthritis,lymphocyte-dependentcolitisandenthesitis.ThelackofA20inDCsincreasestheabilityofthecelltoresistapoptosis,whichmayleadtoanuncontrolledinflammatoryresponse.SincetheroleofA20,exceptforthegeneticstudiesmentionedabove,hasnotbeenstudiedduringintraocularinflammation,wedecidedtoinvestigatethelevelsofthisproteininthebloodofpatientswithuveitis,wherebywechoseBDandVKHbecausethesearetwoofthemostfrequentuveitisentitiesobserved13 重庆医科大学博士研究生学位论文inourclinic.ToelucidatethepossiblemechanismofactionofA20,wefocusedontheroleofthisproteininthefunctioningofDCs.14 重庆医科大学博士研究生学位论文PARTⅠTHEEXPRESSIONOFA20MRNAINPATIENTSWITHBDANDVKHDISEASEPurposeA20hasbeenfoundtoplayasignificantregulatoryroleintheinnateimmuneresponse.ThisstudywassetuptoinvestigatethemRNAexpressionofA20inpatientswithBDandVKHdisease.MethodsVKHdiseasepatientsandBDpatientsandage-matchedandsex-matchedhealthyindividualswereincludedinthepresentstudy.ThediagnosisofBDandVKHdiseasefollowedthecriteriaoftheInternationalStudyGroupandinternationalcommitteeonnomenclature.PBMCsinVKHpatients(includingpatientswithactiveandinactivedisease),BDpatients(includingpatientswithactiveandinactivedisease)andhealthycontrolswereisolatedbyFicoll-Hypaquedensitygradientcentrifugation.TotalRNAofthePBMCswasextractedusingTrizolreagent.AReverseTranscriptionKitwasusedtoreverseRNAintocDNAaccordingtothemanufacturerinstructions.Real-timequantitativePCRwasperformedtodetecttheexpressionofA20inPBMCs.Results1.Quantitativerealtime-PCRshowedthatthemRNAexpressionof15 重庆医科大学博士研究生学位论文A20inPBMCswassignificantlylowerinpatientswithactiveBDascomparedtoinactiveBDpatientsandnormalsubjects.TherelativemRNAlevelofA20inPBMCsfrommanyactiveBDpatientswasverylow,butstilldetectable.2.NodifferencewasobservedbetweeninactiveBDpatientsandnormalsubjects.3.NodifferencewasobservedbetweenactiveVKHpatients,inactiveVKHpatientsorcontrolindividuals.ConclusionswefoundthatthemRNAexpressionofA20inPBMCswassignificantlylowerinpatientswithactiveBDascomparedtoinactiveBDpatientsandnormalsubjects.TherelativemRNAlevelofA20inPBMCsfrommanyactiveBDpatientswasverylow,butstilldetectable.ThereductionofA20iscloselyrelatedtotheoccurrenceanddevelopmentofBD.NodifferencewasobservedbetweenactiveVKHpatients,inactiveVKHpatientsorcontrolindividuals.TheresultsshowedthatthedecreaseofA20wasnotassociatedwiththeoccurrenceofVKHdisease.16 重庆医科大学博士研究生学位论文PARTⅡTHEEXPRESSIONOFA20MRNAINDCSFROMACTIVEBDPATIENTSPURPOSEThisstudywassetuptoinvestigatetheexpressionofA20mRNAinDCsfromactiveBDpatients.MethodsBDpatientsandage-matchedandsex-matchedhealthyindividualswereincludedinthepresentstudy.ThediagnosisofBDfollowedthecriteriaoftheInternationalStudyGroupandinternationalcommitteeonnomenclature.PBMCsinBDpatients(includingpatientswithactiveandinactivedisease)andhealthycontrolswereisolatedbyFicoll-Hypaquedensitygradientcentrifugation.CD14+monocyteswereisolatedusingmagneticcellsorting(MACS),followingthemanufacturer’sinstructions.ImmatureDCs(iDCs)wereculturedinRoswellParkMemorialInstitute1640(RPMI1640)mediumsupplementedwithrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatinghormone(GM-CSF)andrecombinanthumanIL-4for6days.TotalRNAoftheDCswasextractedusingTrizolreagent.AReverseTranscriptionKitwasusedtoreverseRNAintocDNAaccordingtothemanufacturerinstructions.Real-timequantitativePCRwasperformedtodetecttheexpressionofA20inDCs.17 重庆医科大学博士研究生学位论文Results1.TheexpressionofA20inDCsfromactiveBDpatientswassignificantlylowerthanthatseeninpatientswithinactiveBD.2.TheexpressionofA20inDCsfromactiveBDpatientswassignificantlylowerthanthatseeninnormalsubjects.3.NodifferencewasobservedbetweeninactiveBDpatientsandnormalsubjects.ConclusionswefoundthattheexpressionofA20inDCsfromactiveBDpatientswassignificantlylowerthanthatseeninpatientswithinactiveBDornormalsubjects.WehavenowclearlyknownthatthereisacloseconnectionbetweenA20andDCs.18 重庆医科大学博士研究生学位论文PARTⅢTHEEFFECTOFA20ONTHEFUNCTIONOFDCSPurposeInthepresentstudy,weinvestigatedeffectofA20onmaturationofDCsandcytokineexpression.MethodsBDpatientsandage-matchedandsex-matchedhealthyindividualswereincludedinthepresentstudy.ThediagnosisofBDfollowedthecriteriaoftheInternationalStudyGroupandinternationalcommitteeonnomenclature.PBMCsinBDpatients(includingpatientswithactiveandinactivedisease)andhealthycontrolswereisolatedbyFicoll-Hypaquedensitygradientcentrifugation.CD14+monocyteswereisolatedusingmagneticcellsorting(MACS),followingthemanufacturer’sinstructions.ImmatureDCs(iDCs)wereculturedinRoswellParkMemorialInstitute1640(RPMI1640)mediumsupplementedwithrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatinghormone(GM-CSF)andrecombinanthumanIL-4.Onday3ofincubation,iDCsweretransducedwithA20-shRNAat50,100,300,500,or1000multiplicitiesofinfections(MOIs)for72hat37°C.ThetransductionefficiencyofDCswasevaluatedbyobservinggreenfluorescentprotein(GFP)-positivecellsundera19 重庆医科大学博士研究生学位论文fluorescencemicroscopeandFlowCytometry.ThemostsuitableMOIvaluewasselectedaccordingtotheresultoftransductionefficiency.HumanCD83,CD86,CD40,CD80andHLA-DRantibodieswereusedtodetecttheinfluenceofA20onDCssurfacemarkerexpressionusingaFlowCytometer.ELISAdevelopmentkits(R&DSystems,Minneapolis,MN)wereusedtomeasuresupernatantlevelsofIL-1β,IL-6,IL-10,IL-17andIL-27basedonthemanufacturer’sprotocols.Results1.TheexpressionofGFPwasobservedunderthefluorescencemicroscope.MostoftheDCsshowedagreensignalunderthefluorescencemicroscopeatanMOIof500.2.Thetransductionefficiencyofadenoviruswasdetectedbyflowcytometry.Wefoundthatthetransductionefficiencyofadenoviruswasapproximately80%inDCsinvitroatanMOIof500.3.ThedataindicatedthatthetransductionofA20-shRNAhadnoeffectontheexpressionofthecellsurfacemarkersCD40,CD80,CD83,CD86andHLA-DR.4.ThesecretionofIL-1βandIL-6wasincreased,whereastheexpressionofIL-10andIL-27wasdecreasedfollowingsilencingofA20.Collectively,thesedatasuggestthatA20negativelyregulatesinflammatorycytokineexpressioninDCs.Conclusions20 重庆医科大学博士研究生学位论文AdenoviruscaneffectivelytransfectDCs,andthetransfectionefficiencyishigh.Comparedwiththecontrol,theexpressionlevelofA20decreasedsignificantlyat48hoursaftertransductionwithA20-shRNA.TransductionofA20-shRNAhadnoeffectontheexpressionofthecellsurfacemarkersCD40,CD80,CD83,CD86andHLA-DR.ThesecretionofIL-1βandIL-6wasincreased,whereastheexpressionofIL-10andIL-27wasdecreasedfollowingsilencingofA20.Collectively,thesedatasuggestthatA20negativelyregulatesinflammatorycytokineexpressioninDCs.ItissuggestedthatA20mayplayaroleinthepathogenesisofBehcetdiseasebyaffectingtheinflammatorycytokinessecretedbyDCs.21 重庆医科大学博士研究生学位论文PartⅣTheeffectofA20onthefunctionofCD4+TcellPurposeToinvestigatewhethersilencingoftheA20geneinDCsaffectsthepercentageofIL-17expressingCD4+Tcells.MethodsBDpatientsandage-matchedandsex-matchedhealthyindividualswereincludedinthepresentstudy.ThediagnosisofBDfollowedthecriteriaoftheInternationalStudyGroupandinternationalcommitteeonnomenclature.PBMCsinBDpatients(includingpatientswithactiveandinactivedisease)andhealthycontrolswereisolatedbyFicoll-Hypaquedensitygradientcentrifugation.CD14+monocyteswereisolatedusingmagneticcellsorting(MACS),followingthemanufacturer’sinstructions.ImmatureDCs(iDCs)wereculturedinRoswellParkMemorialInstitute1640(RPMI1640)mediumsupplementedwithrecombinanthumangranulocyte-macrophagecolony-stimulatinghormone(GM-CSF)andrecombinanthumanIL-4.Onday3ofincubation,iDCsweretransducedwithA20-shRNAat500multiplicitiesofinfections(MOIs)for72hat37°C.LPS(100ng/ml)wasaddedfor24htostimulatethematurationofDCs.DCsandpurifiedCD4+Tcellsweremixedataratioof1:4andculturedfor7days.Afterfixation,Anti-humanIL-17Awasaddedtothecellstoanalyze22 重庆医科大学博士研究生学位论文theproliferationofIL-17usingaFACScanFlowCytometer.ResultsIntheTcell/DCcoculturesystem,A20-shRNAtransductedDCsresultedinanincreasedlevelofIL-17expressingCD4+Tcells.ConclusionswecoculturedtransductedDCswithCD4+Tcells,andshowedthatsilencingA20geneexpressioninDCssignificantlyincreasedthepopulationofIL-17positiveCD4+Tcells.ThesefindingsareinagreementwithourearlierstudiesshowinganimportantroleofTh17cellsinthepathogenesisofBD.WethushypothesizethatadecreasedA20expressionduringanactiveepisodeofdiseasewouldbeassociatedwithanincreaseinTh17cells.23 重庆医科大学博士研究生学位论文PartⅤTheeffectofA20onMAPKsignalingpathwayPurposeItisnotexactlyknownhowA20affectsDCsignalingcascades.Inthisstudy,weinvestigatedtheeffectofA20onMAPKsignalingpathway.MethodsBDpatientsandage-matchedandsex-matchedhealthyindividualswereincludedinthepresentstudy.PBMCsinBDpatients(includingpatientswithactiveandinactivedisease)andhealthycontrolswereisolatedbyFicoll-Hypaquedensitygradientcentrifugation.CD14+monocyteswereisolatedusingmagneticcellsorting(MACS),followingthemanufacturer’sinstructions.Onday3ofincubation,iDCsweretransducedwithA20-shRNAat500multiplicitiesofinfections(MOIs)for72hat37°C.DCsweretransductedwithadenovirusfor48hours,whereaftercellswerestimulatedwithLPS(100ng/ml)for30min.PhosphorylationlevelsofJNK,ERK1/2andp38werethendetectedbyflowcytometry.ResultsSilencingofA20leadtoanincreasedphosphorylationofp38andJNK,whereasERK1/2phosphorylationwasnotaffected.ConclusionsSilencingofA20causedanincreasedJNKandp38activation,butdid24 重庆医科大学博士研究生学位论文notaffectERK1/2.Thisissimilartotheresultsofotherstudies.ThepresentresultsshowedthattheeffectofA20onthefunctionofDCswasinvolvedinthepathogenesisofBDthroughJNKandp38dependentpathway.Keywords:Behcetdisease,VKHdisease,A20,DendriticCells,CD4+Tcell25 重庆医科大学博士研究生学位论文锌指蛋白A20在Behcet病和Vogt-小柳原田综合征发病机制中作用的研究前言葡萄膜炎是一类由感染因素和（或）免疫反应等原因造成的脉络膜组织的炎症。它是引起劳动年龄人口视力损害的主要病因[1]。葡萄膜炎可以引起单眼发病，也可引起双眼同时或先后发病，往往反复发作，它可以是眼部的一个独立性疾病，也可以与全身疾病相关联，如Behcet病、Vogt-小柳原田综合征（Vogt-Koyanagi-Haradadisease，VKH综合征）、脊柱关节炎、多发性硬化、结节病等[2]。葡萄膜炎的分类复杂，可按照病因、病理、解剖、病程等进行分类。目前最常用的分类法是按照解剖位置分类，此法将葡萄膜炎分为前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎。葡萄膜炎好发于青壮年，临床表现多样，治疗困难，常常转换为慢性发作，且容易复发。患者由于病情反复发作或炎症无法控制，常常导致视力的丧失。在发达国家，如美国，就有超过2.8%的失明与葡萄膜炎相关，而在发展中国家，这种比例明显增高，有10%的视力损害和5～20%的法定盲与葡萄膜炎密切相关[3]。在我国，VKH综合征和Behcet病是最常见的两种葡萄膜炎类型。就VKH综合征和Behcet病发病情况进行分析，发现在1752例葡萄膜炎患者中，VKH综合征的患者占了所有葡萄膜炎患者总数的15.9%,Behcet病占了总数的16.5%[4]。如果从致盲角度来进行分析，有研究发现，在1214例葡萄膜炎患者（1892眼）中，出现致盲的有355眼，占总数的18.76%，再进一步分析发现，VKH综合征和Behcet病致盲的有73眼，占致盲总数的56.62%[5]。由此不难得出，VKH综合征和Behcet病在我国不但是最常见的葡萄膜炎类型，也是致盲率最高的葡萄膜炎类型。Behcet病是由土耳其的皮肤科医生首次进行报道，它是一种复杂的、免疫介导的多系统综合征。此类疾病主要是由于血管炎性病变导致的葡萄膜炎、复发性口腔溃疡和生殖器溃疡、多形性皮肤病变[6]，其中80%的患者会出现有眼部的病变。26 重庆医科大学博士研究生学位论文Behcet病的发病范围与古代丝绸之路的线路基本吻合，从中国到地中海地区，故又称为“丝绸之路病”，在北欧、美国大陆、非洲南部发病率较低。该病好发于男性，男女比例为2:1。Behcet病的发病原因尚不明确，考虑与毒物接触史、感染、基因、染色体异常、自身免疫有关系。正是因为其病因、机制不明确，所以容易反复发作、受累组织广泛，在治疗上困难，预后差。杨培增教授通过对437例Behcet病患者资料进行Kaplan-Meier分析发现，如果患者诊断Behcet病明确，那么其患病后5年出现视力丧失的可能性为24.5%，患病后10年的可能性进一步加重，达到62.2%[4]。VKH综合征属于自身免疫性疾病，最典型的特征是双眼肉芽肿性葡萄膜炎，同时还常伴有脑膜刺激征、听力下降、耳鸣、皮肤和毛发异常等。VKH综合征好发于亚洲人、美国人、中东人和西班牙人[7]，其发病年龄为20-50岁，男女比例为1：2。目前VKH综合征的发病机制尚不明确，但考虑与自身免疫、遗传以及感染因素相关[8-11]。VKH综合征治疗也同样棘手，预后差，如果治疗不当，将会导致严重的视力下降甚至盲目[12;13]。杨培增教授对410例VKH综合征的患者资料进行分析发现，后葡萄膜炎期、前葡萄膜受累期和前葡萄膜炎复发期患者初诊时视力低于0.1者分别为45%、33.7%和38%[14]。尽管Behcet病和VKH综合征的确切致病原因和发病机制并不清楚，但是近年来的研究发现自身免疫因素和遗传因素参与了两种疾病的发生和发展。研究发现，VKH综合征和Behcet病中Th1和Th17细胞的比例明显增高，同时，细胞因子IFN-γ、IL-17的表达水平也显著升高[15;16]，但是，调节性T（Treg）细胞的比例和功能明显下降[17;18]。在葡萄膜炎的动物模型中发现，当葡萄膜炎发作时，Th1和Th17会出现显著增高，如果抑制Th1和Th17细胞反应或者是抑制与Th1和Th17细胞相关的细胞因子则能够抑制炎症的发生和发展；而Treg细胞过继转移能够显著抑制动物模型中葡萄膜炎发生和发展。来自日本和土耳其的全基因组关联研究显示IL-10、IL-23R/IL-12RB2基因的单核苷酸多态性（SNP）与Behcet病显著相关[19;20]，而IL-10、IL-23R和IL-12R分别是Treg、Th17和Treg细胞分化过程中的关键分子。树突状细胞（Dendriticcells,DCs）是机体内功能最强大的专职抗原递呈细胞(Antigenpresentingcells,APC)，DCs通过分泌IL-12、IL-1beta、IL-6、IL-7、IL-2327 重庆医科大学博士研究生学位论文和OPN等促进Th1和Th17细胞分化及增殖，从而参与免疫反应。A20是在经TNF-α处理后的脐静脉内皮细胞反应中检测到的一个诱导性表达蛋白，因此也被称为TNF-α诱导蛋白3（TNF-α-inducedprotein3,TNFAIP3）。A20表达于多个免疫器官，包括胸腺、脾脏和肠相关免疫组织等。A20是天然免疫受体如TNF受体(TNFreceptor，TNFR)，TOLL样受体(Toll-likereceptor，TLR)和细胞内模式识别分子NOD2(nucleotidebindingoligomerizationdomainprotein2)所介导的NF-κB活化终末信号所必需的分子[21]。去泛素化酶在控制天然免疫受体信号传导中起到关键作用。在此过程中，A20蛋白的氨基端具有卵巢肿瘤基序，具有去泛素化酶功能。第一个被发现对天然免疫具有调节作用的去泛素化酶就是A20。TRAF6是TOLL样受体信号通路中的关键分子，其泛素化调节是NF-κB活化的关键因素，A20则通过对调节TRAF6的去泛素化功能减弱NF-κB信号系统的活性，从而发挥对天然免疫反应的负性调节作用[22;23]。近年研究发A20能够对DCs的活化、成熟和功能进行一系列的调控，因此，其在免疫反应及自身免疫性疾病中的作用也受到广大的关注。已有研究发现在DCs细胞内A20基因缺陷的小鼠能够比野生型小鼠更容易发生自身免疫性肠炎、自身免疫性僵直性关节炎，而且上述两类疾病的严重程度更高，这种有缺陷的小鼠在围产期就很容易致死[24]。另外还有研究者发现DCs细胞内A20基因缺陷的小鼠对外界微生物的刺激敏感性更高，此种有缺陷的DCs细胞表面标志CD40、CD80、CD86等明显增加，炎性细胞因子如TNF-α、IL-1和IL-6分泌水平明显增加，并且可以显著刺激T细胞激活及增殖和促进Th1、Th17细胞的分化[25]。在我们团队的前期研究中[26]发现A20基因中的rs10499194、rs9494885和rs7753873位点的多态性与Behcet病具有相关性，其中rs9494885与Behcet病存在强相关；rs9494885位点的多态性与VKH综合征存在密切相关。通过以上分析和梳理我们推测:DCs细胞内的负性信号调节分子A20改变引起DCs活化和功能改变，最终引起Th1、Th17、Treg细胞改变、一些细胞因子产生及葡萄膜炎发生；病原体感染后不同个体发生不同改变及不同葡萄膜炎还可能与A20的基因变异有关。基于这一基本假设，本课题主要进行以下实验：1、探讨VKH综合征和Behcet病患者PBMCs和DCs中A20的表达水平，通过这个实验明确A20是否参与这两种疾病的发生和发展；2、在第一个实验得到证实后，进一步28 重庆医科大学博士研究生学位论文探讨A20在这两种疾病发生中的作用及机制。通过上述研究，揭示葡萄膜炎发生及发展新的分子机制，为其防治提供新策略和新靶点。29 重庆医科大学博士研究生学位论文第一部分A20在Behcet病与VKH综合征患者中mRNA表达水平的研究第一章A20在Behcet病患者PBMCs中的表达水平1材料及方法1.1研究对象选取活动期Behcet病患者23例，静止期Behcet病患者18例，同时选取23例性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。所有的患者及健康人均来自重庆医科大学附属第一医院葡萄膜炎专科门诊，Behcet病的诊断标准采用的是国际葡萄膜炎会议制定的诊断标准进行诊断[27]（表1）。活动期Behcet病患者指患者在采血时就表现为活动性的葡萄膜炎，而且患者未使用过任何激素类药物或影响全身免疫功能的免疫抑制剂。静止期Behcet病患者指采血时患者处于炎症静止期，无任何眼外症状，且已经停药2月以上。表1：Behcet病国际诊断标准Table1InternationalClinicalCriteriaforBehcet'sDisease临床表现定义反复口腔溃疡由医生观察到或患者诉说有阿弗他溃疡。1年内反复发作至少3次加以下任何2项反复外阴溃疡由医生观察到或患者诉说外阴部有阿弗他溃疡或瘢痕眼病变前和（或）后色素膜炎、裂隙灯检查时玻璃体内有细胞出现或由眼科医生观察到视网膜血管炎皮肤病变由医生观察到或患者诉说的结节性红斑、假性毛囊炎或丘疹性脓疱；或未服用糖皮质激素的非青春期患者出现痤疮样结节针刺试验阳性以20号或22号无菌针头斜行刺入皮内约5mm，48小时后由医生判定在针眼处有>2mm的结节性红斑有反复口腔溃疡并有其他4项中2项以上者，可诊断为本病。上述表现需除外其他疾病。敏感度91%，特异度96%。30 重庆医科大学博士研究生学位论文1.2主要仪器和试剂人淋巴细胞分离液上海生物工程有限公司低温离心机Eppendorf公司，美国TrizolInvitrogen，美国氯仿国药异丙醇国药无水乙醇国药NucleasefreewaterPromega，美国PrimeScriptRTreagentKitTaKaRa公司，日本SYBRPremixExTaqIITMTaKaRa公司，日本ROXReferenceDyeII(50X)TaKaRa公司，日本生物显微镜OlympusBX50，日本实时荧光定量仪ABI7500AppliedBiosystems，美国1.3密度梯度离心分离人外周血单核细胞（Peripheralbloodmononuclearcells，PBMCs）（1）在门诊检查已经确诊的活动期Behcet病患者、静止期Behcet病患者及健康人抽取其静脉血约10mL至肝素抗凝离心管中，并立即混匀避免血液凝固。（2）在已经消毒完毕的超净台内处理肝素抗凝离心管。（3）将10ml全血转入50ml离心管中，再缓慢加入10ml的磷酸缓冲盐溶液（phosphatebuffersaline,PBS）溶液轻轻将二者混匀。（4）在消毒好的透明玻璃管中加入约5ml人淋巴细胞分离液，然后用巴氏管贴壁缓慢将稀释的血液轻轻加到玻璃管内。血液处于人淋巴细胞分离液上层。加入后保持血液与人淋巴细胞分离液液面分界清晰，避免两种溶液混合在一起。（5）配平后离心，温度4℃，离心力800g，按升4降0的升降速度进行离心，离心26分钟。离心后其中的内容物分为四层，上层为血浆（内含血小板），中间层为分层液，底层为红细胞和粒细胞，在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单个核细胞层（薄）。单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。31 重庆医科大学博士研究生学位论文（6）用巴氏管沿玻璃管壁周缘吸取界面层单个核细胞吸出转移至一新玻璃管，加入适量PBS液洗涤细胞，室温离心，800g×10min，2次，离心后弃上清。（7）取10ul细胞悬液加90ml台盼兰染液，3-5分钟后取样进行计数。（8）细胞备用提取RNA。1.4提取PBMCs中的总RNA（1）实验前使用无菌、一次性塑料制品，已标明RNase-Free且未开封过的塑料制品。将1mlTrizol加入到装有细胞的EP管中，使用加样枪头反复吹打Trizol，促使细胞全部溶解。（2）细胞裂解液在室温下放置5min，将0.2ml氯仿加入到1mlTrizol试剂中。振荡器剧烈振荡10-15s后置于室温中15min，让萃取反应完全进行。（3）4℃12000rpm离心15min，从离心机中取出EP管，此时管中的液体分三层，其中上层为水相，中间层为变性的蛋白相，下层为氯仿萃取出的有机相，RNA溶解在水相中。（4）吸取上层透明的水相转移至新的1.5mlEP管中。（5）加入500μL异丙醇使RNA沉淀，轻微振荡10-15s，室温静置20min。静置时间越长RNA变性越充分。（6）4℃12000rpm离心15min后在管底可见透明的胶状沉淀。（7）弃上清，加入1ml预冷的75%乙醇洗涤RNA，除掉异丙醇，颠倒混匀。（8）4℃，离心力7500rpm，离心5分钟。（9）重复第（7）步，再4℃，离心力10000rpm，离心5分钟。（10）弃上清，保持EP管口向下，剩余的上清可用加样枪吸干并且使用滤纸吸干管口乙醇，水平放置EP管，管口朝向酒精灯方向干燥，注意使用加样枪吸干EP管管壁上的液体时勿触及管底的RNA。（11）将逆转录试剂盒中的DEPC处理水30μL加入至EP管中，溶解RNA。1.5测RNA浓度（1）Nanadrop分光光度计探头清洗3次（DEPC处理水）。（2）使用DEPC处理水作为空白对照并调零。32 重庆医科大学博士研究生学位论文（3）按照仪器步骤测量样品的总RNA浓度并记录，当一个样品测量完毕后，需要用DEPC处理水清洗分光光度计探头3次。（4）读取稀释样品的OD260/OD280比值，为1.8-2.0时，表示样品的纯度较高，可用用于进一步实验,记录所测样品的浓度。（5）测量结束后用DEPC处理水清洗探头多次，以便下次使用及增加仪器使用寿命。1.6RNA反转录为cDNA（1）基因组DNA的消除反应（操作在冰上进行）选择的试剂及用量如下（10μL体系）：5×gDNAEraserBuffer2μLgDNAEraser1μLRNAsample最多1μg的体积RNaseFreedH2O补充总量至10μL（2）将上述的试剂加入200μL的PCR管中，进行混匀后瞬时离心，随后放入PCR仪内，PCR仪设置为42℃×2min。反应结束温度降为4℃后取出PCR管。（3）冰上进行反转录反应，反应体系为20μL。5×PrimeScriptBuffer24μLNuclease-FreeWater4μLPrimeScriptRTEnzymeMix1μLRTPrimerMix1μL步骤(2)混合液10μL（4）上述第（3）步中的各试剂混匀后再次离心，把PCR管放入PCR仪内，参数调整为37℃×15min，85℃×5sec，反应结束温度降为4℃后取出即为cDNA。此时得到的cDNA可以进行后续的实时荧光定量聚合酶链反应，剩下的cDNA可以冻存于-20℃以备下次使用。1.7实时荧光定量聚合酶链反应（Polymerasechainreaction，PCR）的检测33 重庆医科大学博士研究生学位论文（1）在冰上配置反应体系(20μL)SYBR®PremixExTaqII（2×）10μLROXReferenceDyeII（50×）0.4μLPCRforwardPrimer（10μM）0.8μLPCRreversePrimer（10μM）0.8μLcDNA1μLNuclease-FreeWater7μL（2）本次实验中A20和β-actin序列如下：引物序列Forward:5'-TGGCTGAACAAGTCCTTCCT-3′A20Reverse:5'-CTTCAGGGTCACCAAGGGTA-3′Forward:5'-CGAGAAGATGACCCAGATCATG-3'β-actinReverse:5'-CAGAGGCGTACAGGGATAGCA-3'（3）将上述混合液混匀并瞬时离心后加入PCR板，放入ABI7500上，采用以下PCR反应程序进行RealTimePCR：95℃×30s-（95℃×5s-60℃×34s）×40个循环-95℃×15s-60℃×60s-95℃×15s。（4）数据分析：统计学分析采用2-△△CT法。1.8统计学分析数据的分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析。在本部分，我们选择Kruskal-Wallis检验，Mann-WhitneyUtest，Bonferronicorrection检验方法，矫正后p＜0.05认为具有统计学显著性差异。2结果2.1活动期Behcet病患者A20在PBMCs中mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人，而静止期Behcet病患者A20的表达水平与正常人无差异34 重庆医科大学博士研究生学位论文Behcet病是一种累及多系统多器官的自身免疫性疾病，确切的发病机制还不清楚。A20可通过TRAF6的去泛素化功能及E3泛素连接酶功能调控转录因子NF-κB信号系统的活性，从而发挥对天然免疫反应的负性调节作用。那么A20在Behcet病中是否会发挥作用还不得而知。因此，我们的研究首先探讨A20在Behcet病患者中是否会发生改变，从而参与疾病的发生及发展。我们把所有的研究对象分为3组，活动期Behcet病患者23例，静止期Behcet病患者18例，同时选取23例性别和年龄相匹配的健康人作为对照组，通过荧光定量PCR的方法来测定每一个组中A20在PBMCs中的表达情况，同时，选用Kruskal-Wallis检验，Mann-WhitneyUtest，Bonferronicorrection进行检验分析，对比三个组之间的差异情况。最后的结果发现，活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人，而且活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显降低，但能够检测的出来。而静止期Behcet病患者及正常人的A20比较则无明显的差异（图1-1）。图1-1活动期Behcet病患者、静止期Behcet病患者和健康对照者PBMCs中A20mRNA的表达水平情况Figure1-1Quantitativerealtime-PCRanalysisofA20mRNAinPBMCsinactiveBDpatientscomparedwithinactiveBDpatientsandsex-andage-matchednormalcontrolsindividuals35 重庆医科大学博士研究生学位论文第二章A20在VKH患者PBMCs中的表达水平1材料及方法1.1研究对象选取活动期VKH病患者20例，静止期VKH患者19例，同时选取23例性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。所有的患者及健康人均来自重庆医科大学附属第一医院葡萄膜炎专科门诊，VKH的诊断标准采用的是VKH国际学会重新制定的诊断标准进行诊断[28]：（1）首次发生葡萄膜炎之前无眼球穿通伤及内眼手术史；（2）临床表现和实验室检查不支持其他眼部疾病；（3）双眼发病，随就诊时病程阶段不同而有不同的眼底表现。早期表现：弥漫性脉络膜炎伴有局限性视网膜下液或大泡性浆液性视网膜脱离。晚期表现：a眼部脱色素，出现晚霞样眼底或Sugiura征，b钱币型脉络膜视网膜脱色素瘢痕或视网膜色素上皮聚集或/和游走；（4）神经系统或听觉异常，就诊时可能已缓解；（5）皮肤表现：如脱发、白发、皮肤脱色素斑。活动期VKH患者指患者在采血时就表现为活动性的葡萄膜炎，而且患者未使用过任何激素类药物或影响全身免疫功能的免疫抑制剂。静止期Behcet病患者指采血时患者处于炎症静止期，无任何眼外症状，且已经停药2月以上。1.2主要仪器和试剂参见第一章1.21.3密度梯度离心分离人外周血单核细胞（PBMCs）参见第一章1.31.4提取PBMCs中的总RNA参见第一章1.41.5测RNA浓度36 重庆医科大学博士研究生学位论文参见第一章1.51.6RNA反转录为cDNA参见第一章1.61.7实时荧光定量PCR的检测参见第一章1.71.8统计学分析参见第一章1.82结果2.1活动期VKH患者、静止期VKH患者及正常人A20在PBMCs中mRNA的表达水平无明显差异VKH综合征的确切发病机制还不明确，但是近年来的研究发现自身免疫因素以及遗传因素都与VKH综合征的发病明确相关。VKH综合征一般认为由黑色素抗原的自身免疫所引起。A20已经证实与SLE、类风湿性关节炎、干燥综合征、银屑病等自身免疫性疾病明确相关。那么，VKH综合征作为一种自身免疫性疾病，A20与其是否有关系还不得而知。因此，我们的研究首先探讨A20在VKH综合征患者中是否会出现异常，从而导致疾病的发生及发展。我们将所有的研究对象分为3组，活动期VKH患者20例，静止期VKH综合征患者19例，同时选取23例性别和年龄相匹配的健康人作为对照组，通过荧光定量PCR的方法来测定每一个组中A20在PBMCs中的表达情况，同时，选用Kruskal-Wallis检验，Mann-WhitneyUtest，Bonferronicorrection进行检验分析，对比三个组之间的差异情况。最后的结果发现，活动期与静止期VKH综合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表达与正常人无明显差异（图1-2）。37 重庆医科大学博士研究生学位论文图1-2活动期VKH综合征患者、静止期VKH综合征患者和健康对照者PBMCs中A20mRNA的表达水平情况Figure1-2Quantitativerealtime-PCRanalysisofA20mRNAinPBMCsinactiveVKHpatientscomparedwithinactiveVKHpatientsandsex-andage-matchednormalcontrolsindividuals3讨论葡萄膜炎是指影响葡萄膜（虹膜、睫状体、脉络膜）及其邻近结构（玻璃体、视网膜、视神经、血管）的任何一种炎症过程。这种炎症过程的起源可以是内源性的，是全身性疾病的一部分或主要发生在眼部，也可以是外源性的，与任何一种影响眼球的感染因素相关，或者是发生于多系统感染。葡萄膜炎按照发生炎症的解剖部位分类，可分为前葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、后葡萄膜炎和全葡萄膜炎3种；按病因可将其分为感染性（细菌、病毒、真菌、寄生虫等）和非感染性（特发性、自身免疫类、创伤性、伪装综合征等）两大类。葡萄膜炎会严重威胁视力，如果不及时正确的处理，可能导致不可逆转的视力丧失。多达35%的葡萄膜炎患者至少有一只眼出现失明或视力损害[29]。在发达国家中，葡萄膜炎是第五位引起严重视力丧失的疾病，多达20%的法定盲是由于葡萄膜炎的并发症所引起[30]。其中VKH综合征和Behcet病是亚洲常见的两种葡萄膜炎疾病类型[31;32]，二者的发病机制均不明确，临床上表现多样，诊断困难，治疗棘手，且反复发作，随时间38 重庆医科大学博士研究生学位论文延长及发作次数增多，预后也越差。A20具有肿瘤抑制因子及炎症信号转导的中心调节因子NF-κB抑制因子的双重功能[33;34]。它在天然免疫和过继性免疫调节中发挥了重要作用，对免疫动态平衡有重要的调节作用。有研究发现[35]，在SLE患者的PBMCs中A20mRNA的表达明显低于正常人，而且A20的表达水平与疾病活动指数、血沉明显相关，SLE患者如果并发肾炎，A20的水平还会进一步下降。在干燥综合征中的研究表明，患者SGEC中的外异蛋白（ectodysplasin,EDA）-A1和EDAR的mRNA和蛋白水平均高于正常组，下调A20后，NF-κB活性增强，它能负向调控EDA-A1/EDAR诱导的NF-κB信号[36]。既然许多的研究研究证实A20在自身免疫性疾病中发挥重要的作用，那么，A20在VKH综合征和Behcet病这两种最常见的葡萄膜炎中是否也同样发挥作用呢？在前期的单核苷酸多态研究中，我们已经证实，A20基因中rs9494885这个位点多态与Behcet病的易感性存在密切相关。rs10499194和rs7753873与Behcet病也存在一定的相关性，A20基因中rs9494885位点的多态与VKH综合征存在相关性[26;37]。因此，我们提出假设，是否A20参与了VKH综合征和Behcet病的发生及发展。我们以活动期Behcet病、VKH综合征患者、静止期Behcet病、VKH综合征患者及性别和年龄相匹配的健康人作为对照组，通过荧光定量PCR的方法来测定每一个组中A20在PBMCs中的表达情况。最后的结果发现，活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人，而且活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显降低，但能够检测的出来。而静止期Behcet病患者及正常人的A20比较则无明显的差异。有意思的是，活动期与静止期VKH综合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表达与正常人无明显差异。我们的研究结果与前面一些研究者的结果是一致的。但是，我们的结果和另外一些研究者的有些不同。在对非酒精性脂肪肝的患者研究中发现，肝纤维化患者A20mRNA及蛋白水平明显高于正常人，出现这样的现象考虑可能是由于A20的升高对于防止肝纤维化有一定的作用[38]。在另一个研究中，小肠上皮细胞收到LPS的刺激后，A20的表达出现增加，而且这种增加与LPS的剂量及刺激时间呈正相关[39]。非酒精性脂肪肝和小肠上皮细胞与Behcet病之间出现的A20差异还不是很清楚，可能与细胞不同或者他们之间涉及的免疫机制不同造成的。虽然，A2039 重庆医科大学博士研究生学位论文在活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显降低，那么，它在其他免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞等的表达情况如何还不得而知。4总结葡萄膜炎是导致盲目的重要原因。VKH综合征和Behcet病在我国是致盲率最高和最常见的葡萄膜炎类型。二者均表现为严重的、不可逆的视力损害，对患者的生活质量造成极大的影响。因此，对VKH综合征和Behcet病这两种疾病的机制进行研究，以找到更好的治疗方法是非常有必要的。A20在天然免疫反应及过继性免疫调节中起到了重要的作用。因此，本部分就通过基因的层面来了解A20的异常是否与VKH综合征和Behcet病有关联。结果发现，活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人，而且活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显降低，但能够检测的出来。而静止期Behcet病患者及正常人的A20比较则无明显的差异。有意思的是，活动期与静止期VKH综合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表达与正常人无明显差异。综上所述，这部分的研究表明，A20在Behcet病患者PBMCs中mRNA的表达水平明显降低，与疾病的活动性密切相关。后期我们将继续研究是否A20对其他的免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞等是否有作用。5研究展望本部分进行了以下两个方面的实验：1、A20在Behcet病患者PBMCs中的表达水平2、A20在VKH综合征患者PBMCs中的表达水平尚需进一步研究的内容：1、A20通过何种机制对疾病的发生发展以及活动性产生影响；2、A20在总的PBMCs水平出现异常，那么，对其他的免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞、B细胞等是否有作用需要进一步的研究。40 重庆医科大学博士研究生学位论文第二部分A20在Behcet病患者DCs中mRNA表达水平的研究1材料及方法1.1研究对象选取活动期Behcet病患者23例，静止期Behcet病患者18例，同时选取23例性别和年龄相匹配的健康人作为对照组。本次研究中的患者及健康人均来自重庆医科大学附属第一医院葡萄膜炎专科门诊，Behcet病的诊断标准采用的是国际葡萄膜炎会议制定的诊断标准进行诊断[27]。活动期Behcet病患者指患者在采血时就表现为活动性的葡萄膜炎，而且患者未使用过任何激素类药物或影响全身免疫功能的免疫抑制剂。静止期Behcet病患者指采血时患者处于炎症静止期，无任何眼外症状，且已经停药2月以上。1.2主要仪器和试剂低温离心机Eppendorf公司，美国TrizolInvitrogen，美国氯仿国药异丙醇国药无水乙醇国药人淋巴细胞分离液上海生物工程有限公司细胞培养液1640Gibco,美国胎牛血清Gibco,美国GM-CSFACROBiosystems，美国人重组IL-4ACROBiosystems，美国CD14+磁珠Miltenyi，德国41 重庆医科大学博士研究生学位论文MACS磁珠分选架Miltenyi，德国NucleasefreewaterPromega，美国ROXReferenceDyeII(50X)TaKaRa公司，日本SYBRPremixExTaqIITMTaKaRa公司，日本PrimeScriptRTreagentKitTaKaRa公司，日本生物显微镜OlympusBX50，日本实时荧光定量仪ABI7500AppliedBiosystems，美国微量加样枪Eppendorf公司，美国1.3密度梯度离心分离人外周血单核细胞（PBMCs）参见第一部分第一章1.31.4CD14+T单核细胞的分离（1）取预留的PBMCs细胞，室温离心300g，10min。（2）在超净台中倒掉上清，保留细胞沉淀，随后加入80ul磁珠buffer吹打混匀细胞，然后加入20ul单核细胞磁珠（CD14+磁珠），随后将BD管放入4℃冰箱孵育15min，此时注意一定要避光。（3）取出孵育的细胞，在BD管中缓慢加入1ml磁珠buffer，室温300g离心10min。（4）倒掉第（3）步离心后的上清，加500ul磁珠buffer混匀细胞。（5）取出MS柱，加入500ul磁珠buffer润湿柱子，上述混匀的细胞加入MS柱。（6）液体滴完后，再加入500ul磁珠buffer，并重复三次。（7）取下MS柱，将其放入新的15mlBD管中，加入1ml磁珠buffer，用MS配套的推注器快速推压磁珠buffer。（8）重复步骤（7）。（9）将装有细胞的BD管中加入2mlPBS，室温离心1000g，5min。（10）弃上清，此时得到的就是CD14+T细胞。（11）用计数板进行台盼蓝细胞计数。42 重庆医科大学博士研究生学位论文1.5单核诱导的树突状细胞（DCs）的培养（1）将分离出的CD14+T细胞加入到1640培养基（内含1%谷氨酰胺，1%青链霉素，10%胎牛血清），轻轻吹匀，根据前面的细胞计数，调整CD14+T细胞的浓度，使24孔培养板中每孔的细胞浓度为1×106细胞/ml。（2）在培养基的每孔中加入人重组GM-CSF（100ng/ml）和人重组IL-4(50ng/ml)进行DCs诱导。（3）将24孔板置于5％CO237℃细胞培养箱中进行培养，在第三天，悬空吸取一半培养液，同时加入500ul的1640培养基及半量重组GM-CSF和人重组IL-4。（4）细胞培养6天时，则刺激转化为未成熟的DCs细胞，根据实验情况，加入LPS（100ng/ml）继续培养24h也就是培养第7天时转化成为成熟的DCs细胞。（5）收取细胞备用。1.6提取DCs中的总RNA参见第一部分第一章1.41.7测RNA浓度参见第一部分第一章1.51.8RNA反转录为cDNA参见第一部分第一章1.61.9实时荧光定量聚合酶链反应的检测参见第一部分第一章1.71.10统计学分析数据的分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析。在本部分，我们选择Kruskal-Wallis检验，Mann-WhitneyUtest，Bonferronicorrection检验方法，矫正后p＜0.05认为具有统计学显著性差异。43 重庆医科大学博士研究生学位论文2结果2.1A20mRNA表达水平在活动期Behcet病患者DCs中显著降低，而静止期Behcet病患者A20的表达水平与正常人无差异前期的实验中，我们已经证实活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人。PBMCs是外周血单个核细胞的总集合，包含淋巴细胞、单核细胞、DCs和其它少量细胞。其中DCs起源于CD34+的造血干细胞,是目前所知的功能最强的、唯一能激活初始性T细胞(NativeTcell)的抗原递呈细胞(Antigenpresentingcell,APC),是混合淋巴细胞反应(Mixedlymphocytereaction,MLR)中最强的刺激剂。DCs已经证实在Ⅰ型糖尿病、自身免疫性甲状腺疾病、SLE、类风湿性关节炎等自身免疫性疾病起重要的作用。因此，我们进一步探讨DCs中A20的表达情况。实验结果显示：活动期Behcet病患者DCs细胞中A20mRNA表达水平明显低于正常人。活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平降低，而静止期Behcet病患者和正常人相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平无明显差异（图2）。图2活动期Behcet病患者、静止期Behcet病患者和正常人DCs中A20mRNA表达水平Figure2A20mRNAexpressioninDCsfromactiveBDpatients,inactiveBDpatientsandnormalcontrols44 重庆医科大学博士研究生学位论文3讨论Behcet病在我国不但是最常见的葡萄膜炎类型，也是致盲率最高的葡萄膜炎类型。正是由于Behcet病反复发作，治疗棘手，预后差等原因，因此，探讨Behcet病的发病机制就显的尤为重要。虽然Behcet病的确切病因和发病机制还不是非常的清楚，但是近年来的研究发现自身免疫因素和遗传因素参与了Behcet病的发生和发展，而其中，又以自身免疫因素最为重要，是研究的重点和热点。有相关的报道证实在Behcet病中，Th1和Th17细胞的比例和所产生的细胞因子IFN-γ、IL-17显著升高[16]，而调节性T（Treg）细胞的比例和功能显著下降[17;40]。在葡萄膜炎的动物模型中发现，Th1和Th17在炎症的高峰期显著增高，抑制Th1和Th17细胞反应或相关的细胞因子可以显著抑制疾病的发生和发展[41]；而Treg细胞过继转移能够显著抑制动物模型中葡萄膜炎发生和发展[42]。不难看出，Th1、Th17和Treg细胞失衡在Behcet病的发生和发展中起着重要的作用。1973年，RalphM.Steinman和ZanvilCohn在小鼠的淋巴结中分离出一种细胞，这种细胞成熟时细胞膜呈树枝状突起，形态独特，与粒细胞、淋巴细胞和单核巨噬细胞不同，故命名为树突状细胞（dendriticcells,DCs）[43]。DCs在人体内广泛存在，目前已经发现，除了大脑和角膜，在人体的各个器官及组织均有表达。DCs是一个非常复杂的血源性细胞群体，其来源可有多种途径。最主要的途径包括从髓系前体细胞及淋巴系前体细胞分化而来。根据DCs的发育阶段及功能不同，其分为以下几类：（1）DCs祖细胞，其主要存在骨髓和肝脏内；（2）DCs前体细胞，此类细胞能够在血液中检测出来；（3）未成熟的DCs，其主要存在外周组织中；（4）成熟的DCs，此类细胞在淋巴组织中发挥作用。DCs是目前为止发现的最强的抗原提呈细胞，在激活T细胞的表现中尤为强大，是B细胞和巨噬细胞的100-10000倍。它是连接天然免疫和活动性免疫的关键桥梁，机体免疫应答的主要启动者，在免疫应答的诱导中发挥关键的作用。DCs还可以调节NK细胞的迀移、增殖和其杀伤功能。有研究表明，当局部出现炎症反应时，NK细胞会聚集到相应的炎症部位，此时，DCs出现活化，同样，也会迁移到该部位，到达炎症部位的DCs通过其表面的IL-15和IL-15Ra复合物刺激NK细胞增殖[44]。同样，在获得性免疫中，DCs是调节T细胞分化的主要介导体,DCs能够诱导CD4+T细胞向Th2分化，从45 重庆医科大学博士研究生学位论文而介导体液免疫反应。DCs还能产生Blys或细胞因子IFN-α，这些因子对于B细胞的增殖和分化都有非常重要的作用[45]。以上的研究结果均说明DCs在天然免疫应答和获得性免疫应答中发挥重要作用。那么，活动期Behcet病患者A20在PBMCs中的表达水平表现出降低，是否在DCs中也会有相应的变化呢？我们继续深入研究，实验结果显示：活动期Behcet病患者DCs细胞中A20mRNA表达水平明显低于正常人。活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平降低，而静止期Behcet病患者和正常人相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平无明显差异。这样的结果与我们前面在PBMCs中的结果是一致的。那我们现在已经明确知道，A20与DCs之间是有着紧密的联系。因此，我们有了以下的推测，A20导致DCs的活化和功能发生改变，最终引起Th1、Th17细胞改变、相应的细胞因子产生，最后导致葡萄膜炎的发生及发展。根据我们的推测，我们接下来探讨A20对DCs的分化和功能有什么样的影响。4总结在第二部分，我们选取活动期Behcet病患者、静止期Behcet病患者及正常人，分离CD14+T单核细胞，诱导DCs，最后通过RT-PCR的方法观察A20mRNA在DCs中的表达水平的情况。最后得出以下结论：活动期Behcet病患者DCs细胞中A20mRNA表达水平明显低于正常人。活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平降低，而静止期Behcet病患者和正常人相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平无明显差异。综上所述，该部分的研究结果证明A20与DCs之间有着一定的联系，而且，A20在DCs细胞中的表达情况与在PBMCs中是一致的。5研究展望在该部分我们对活动期Behcet病患者、静止期Behcet病患者及正常人DCs中A20mRNA的表达水平的情况进行了研究。需要更进一步的研究包括：1、A20对DCs成熟度及分化的影响如何；46 重庆医科大学博士研究生学位论文2、A20对DCs分泌功能有没有影响，能否能对CD4+T细胞的成熟与分化产生影响。47 重庆医科大学博士研究生学位论文第三部分A20在DCs中的功能研究第一章腺病毒转染、转染效率及有效性检测1材料及方法1.1主要试剂和仪器人淋巴细胞分离液上海生物工程有限公司低温离心机Eppendorf公司，美国TrizolInvitrogen，美国氯仿国药异丙醇国药无水乙醇国药细胞培养液1640Gibco,美国胎牛血清Gibco,美国GM-CSFACROBiosystems，美国人重组IL-4ACROBiosystems，美国CD14+磁珠Miltenyi，德国MACS磁珠分选架Miltenyi，德国NucleasefreewaterPromega，美国PrimeScriptRTreagentKitTaKaRa公司，日本SYBRPremixExTaqIITMTaKaRa公司，日本ROXReferenceDyeII(50X)TaKaRa公司，日本生物显微镜OlympusBX50，日本实时荧光定量仪ABI7500AppliedBiosystems，美国微量加样枪Eppendorf公司，美国腺病毒汉恒生物科技有限公司，上海48 重庆医科大学博士研究生学位论文倒置荧光显微镜OlympusCKX41，日本流式细胞仪BDBioscience，美国37℃细胞培养箱ShelLab，美国1.2密度梯度离心分离人外周血单核细胞（PBMCs）参见第一部分第一章1.31.3CD14+T单核细胞的分离参见第三部分1.41.4单核诱导的树突状细胞（DCs）的培养参见第三部分1.51.5腺病毒感染DCs人A20基因干扰（A20-shRNA）腺病毒的制备、包装、扩增和纯化由上海汉恒生物科技有限公司完成（A20基因ID：NM_001270508.1）。因为不同细胞的病毒感染复数（MultiplicityofInfection，MOI）不同，为了确定腺病毒转染DCs的有效性，我们进行相应的预实验来确定腺病毒的转染效率如何。（1）将单核诱导的树突状细胞培养至第三天，显微镜下观察培养的细胞，确保细胞处于良好的生长状态。（2）将生长状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞。（3）将需要感染的目的细胞分为两组，一组目的细胞添加腺体病毒载体，另一组目的细胞添加等滴度同体积的对照病毒载体，培养基内的培养液为正常体积的一半进行感染。加入的病毒量MOI为=10，30，100，300，500，每个MOI值加两个孔2小时后换液。（4）2小时后加入500ul的1640培养基及重组GM-CSF（50ng/ml）和人重组IL-4(25ng/ml)。49 重庆医科大学博士研究生学位论文（5）观察感染情况：感染48小时后，开始观察GFP绿色荧光的表达。1.6腺病毒转染效率的检测（1）将24孔细胞培养板置于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，并拍照（2）将24孔细胞培养板中细胞取出，通过流式细胞仪检测GFP的表达情况。1.7A20干扰效果的检测根据转染效率检测的结果，选取最适合的MOI值进行DCs中A20基因干扰。具体方法参见第四部分1.51.8提取DCs中的总RNA参见第一部分第一章1.41.9测RNA浓度参见第一部分第一章1.51.10RNA反转录为cDNA参见第一部分第一章1.61.11实时荧光定量聚合酶链反应的检测参见第一部分第一章1.71.12统计学分析数据的分析采用SPSS17.0软件进行统计学分析。在本部分，我们选择两独立样本t检验，以p＜0.05认为具有统计学显著性差异。50 重庆医科大学博士研究生学位论文2结果2.1腺病毒转染DCs的荧光图A20没有相应的抑制剂或激动剂，为了研究A20对DCs成熟、分化及功能的研究，因此，我们选择腺病毒转染DCs来进行相关的研究，而病毒能否顺利转染上DCs是本研究的重点，也是关键点。我们先通过带有GFP荧光基团标记的腺病毒进行转染，将转染后的细胞放在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果发现，当MOI值为500时，绿色荧光蛋白的表达情况最高（图3-1）。图3-1带GFP荧光基团标记的腺病毒转染DCs(×200)（左：对照组右：带GFP荧光基团标记组）Figure3-1HumanDCstransfectedwithGFPlabeledAdenovirus(×200)2.2腺病毒转染DCs的效率评估被带有GFP荧光基团标记的腺病毒转染的DCs细胞可以在荧光显微镜下显示绿色荧光蛋白的表达情况。通过上述观察我们确定MOI值为500时大部分DCs细胞被腺病毒转染，但是，具体的转染效率还不得而知。因此，我们采用流式细胞仪的方法检测GFP来进行转染效率的评估。结果显示：当MOI值为500时，流式细胞仪检测转染效率为78.7%，因此我们选择MOI值为500进行A20干扰。（图3-2）。51 重庆医科大学博士研究生学位论文图3-2流式细胞仪检测带GFP荧光基团标记的腺病毒转染DCs的情况（左：转染前右：转染后）Figure3-2HumanDCstransfectedwithGFPlabeledAdenovirusbyflowcytometry2.3腺病毒转染DCs后A20的表达水平通过相应的实验，我们已经掌握了腺病毒稳定有效转染DCs的方法。那么，为了沉默DCs中的A20，我们将包装好的人A20-shRNA腺病毒转染DCs，通过定量PCR的方法来确定转染后A20的表达情况。只有A20被稳定沉默后，才能进一步的研究A20对DCs功能的影响。结果显示，人A20-shRNA腺病毒转染的DCs中A20的呈现低表达。因此，本研究表明腺病毒能成功转染DCs，而且制备的人A20-shRNA腺病毒能够在DCs中导致A20下调（图3-3）。图3-3腺病毒转染DCs后A20的表达情况Figure3-3expressionlevelbeforeandaftertransfectionwithAdenovirus52 重庆医科大学博士研究生学位论文3讨论前面已经提到，DCs是目前已经知道的机体内功能最强大的抗原提呈细胞，它是唯一既能启动免疫应答又能有效刺激再次应答的抗原提呈细胞。它通过摄取、处理传递和提呈抗原，激活T淋巴细胞，启动特异性免疫。许多的研究已经证实，DCs在激发免疫反应和诱导免疫耐受中起着重要的作用。腺病毒是一种大分子（36kb）双链无包膜DNA病毒。1993年，腺病毒载体首次被应用进行临床基因治疗，随后被广泛应用，目前已经成为最常用的生物病毒载体。腺病毒进入细胞后，能把相应的基因组转移至目的细胞核内，但是其对宿主细胞的基因组不会产生突变等影响。腺病毒具有以下优点：1、宿主范围广，能够感染多种细胞，包括增殖细胞和非增殖细胞；2、转基因效率极高，包装容量大，不会融入到感染细胞的基因组内部，不会导致基因突变，毒副作用小[46;47]；3、与人类基因同源，为人类蛋白进行准确地翻译后加工和适当折叠提供了理想环境；4、腺病毒载体易于制备，容易得到高浓度病毒滴度。目前已经有相关的研究表明，腺病毒并不抑制DCs的成熟及功能，因此是作为感染DCs的最佳载体。培养6天的DCs具有最佳转染效果[48]。因此，我们也采用腺病毒进行转染，通过倒置荧光显微镜观察，我们发现当MOI值为500时，绿色荧光蛋白的表达情况最高，大部分的DCs被腺病毒转染。为了更客观的说明腺病毒转染DCs的有效性。我们接着采用流式细胞仪检测进行检测，检测的结果发现腺病毒转染DCs的转染效率为78.7%，能够达到进一步的实验要求。腺病毒转染DCs的成功与否是我们进行以后实验的关键和重点。目前我们已经解决了转染效率这个问题。那么，转染到DCs的腺病毒能否成功阻断A20的表达呢？随后，我们将包装好的人A20-shRNA腺病毒转染DCs，通过定量PCR的方法来确定转染后A20的表达情况。结果显示，人A20-shRNA腺病毒转染的DCs中A20的呈现低表达。因此，本研究表明腺病毒能成功转染DCs，而且制备的人A20-shRNA腺病毒能够在DCs中导致A20下调。解决了腺病毒转染DCs的效率及有效性以后，我们就需要进一步探讨A20对DCs的分化和功能有什么样的影响。53 重庆医科大学博士研究生学位论文4总结在这一部分，我们通过腺病毒对DCs进行转染及转染效率、有效性进行实验。我们先通过带有GFP荧光基团标记的腺病毒进行转染，并通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果发现，当MOI值为500时，绿色荧光蛋白的表达情况最高。随后我们采用流式细胞仪检测GFP的表达，以此来进行转染效率的评估。结果显示：当MOI值为500时，流式细胞仪检测转染效率为78.7%，因此我们选择MOI值为500进行A20干扰。第三步，我们将包装好的人A20-shRNA腺病毒转染DCs，通过定量PCR的方法来确定转染后A20的表达情况。结果显示，人A20-shRNA腺病毒转染的DCs中A20的呈现低表达。综上所述，腺病毒能够有效的对DCs进行转染，且转染效率高。我们制备的人A20-shRNA腺病毒能够阻断A20的表达，并进行后续的研究。5研究展望在该部分我们对腺病毒转染效率及有效性进行了研究。需要更进一步的研究包括：1、A20对DCs成熟度及分化的影响如何；2、A20对DCs分泌功能有没有影响，能否能对CD4+T细胞的成熟与分化产生影响。54 重庆医科大学博士研究生学位论文第二章A20对DCs成熟度的影响1材料及方法1.1主要的试剂、仪器低温离心机Eppendorf公司，美国人淋巴细胞分离液上海生物工程有限公司LPSSigma，美国细胞培养液1640Gibco,美国胎牛血清Gibco,美国GM-CSFACROBiosystems，美国人重组IL-4ACROBiosystems，美国CD14+磁珠Miltenyi，德国MACS磁珠分选架Miltenyi，德国Anti-humanCD40eBioscience，美国Anti-humanCD80eBioscience，美国Anti-humanCD83eBioscience，美国Anti-humanCD86eBioscience，美国Anti-humanHLA-DReBioscience，美国微量加样枪Eppendorf公司，美国腺病毒汉恒生物科技有限公司，上海倒置荧光显微镜OlympusCKX41，日本37℃细胞培养箱ShelLab，美国流式细胞仪BDBioscience，美国1.2密度梯度离心分离人外周血单核细胞（PBMCs）参见第一部分第一章1.355 重庆医科大学博士研究生学位论文1.3CD14+T单核细胞的分离参见第三部分1.41.4单核细胞诱导的树突状细胞（DCs）的培养参见第三部分1.51.5腺病毒感染DCs参见第四部分第一章1.51.6细胞表面染色（1）从细胞培养箱中取出已经培养好的DCs。（2）吹打培养板中的细胞，用加样枪将细胞转移至流式管中，室温下离心500g，5分钟。倒掉上清，加入PBS洗涤细胞2次，再次室温下离心500g，5分钟。（3）弃液，在流式管中加入PBS100ul，然后加入抗CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR流式抗体，震荡，置于冰箱内4℃孵育30分钟。（4）取出细胞，加入1mlPBS，离心300g，10分钟。（5）倒掉上清，加入300ulPBS，震荡混匀后用流式细胞仪检测CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达情况。2结果前一部分的实验中，我们已经证实活动期Behcet病患者DCs细胞中A20mRNA表达水平明显低于正常人。活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平降低，而静止期Behcet病患者和正常人相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平无明显差异。以上结果说明A20表达的降低与Behcet病的发生和发展密切相关。那么，A20是通过什么方式影响DCs细胞，从而导致疾病的发生呢？首先，我们研究A20是否通过影响DCs细胞的成熟度来发挥作用的。我们通过A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，然后再使用流式细胞仪检测DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、56 重庆医科大学博士研究生学位论文HLA-DR的表达水平，从而明确A20是否对DCs细胞成熟分化有影响。结果显示，A20-shRNA腺病毒转染DCs后，对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响（图3-4）。图3-4A20对DCs细胞表面的成熟标记分子的影响Figure3-4EffectofA20onmaturationofDCs3讨论DCs是抗原提呈功能最强大的专职抗原提呈细胞，其在免疫应答的首要环节-抗原提呈中扮演着重要的角色。DCs的发育会经历以下几个阶段，即前体细胞，未成熟细胞和成熟细胞。不论树突状细胞成熟与否，其都会在免疫过程中发挥重要的作用[49]。未成熟DCs能够与外界侵入的抗原相结合，维持自身的免疫耐受。有研究发现，未成熟DCs能够诱导Treg细胞，将脐带血中CD4+T经未成熟DCs处理后，能够出现与Treg细胞类似的增殖，并会导致IFN-γ的减少，IL-10的增多[50]。也有研究报道，对大鼠进行同种异体皮肤移植前注射未成熟骨髓来源的树突状细胞，可以延长移植皮肤的存活时间，并能够产生特异性的免疫耐受[51]。当机体获得外源性刺激信号时，在趋化因子作用下，未成熟DCs细胞向淋巴组织如脾脏或淋巴结迁移，转变成为成熟DCs细胞。成熟DCs细胞摄取加工抗原的活性降低，抗原递呈能力增强，并且能有效与淋巴细胞相作用，激活初始T淋巴细胞。A20在活动期Behcet病患者PBMCs和DCs细胞中表达降低，说明A20的降低与Behcet病的发生发展有关系。那么，A20是否通过对DCs细胞成熟度进行影响从而发挥作用导致Behcet病的发生还不得而知。于是，我们通过A20-shRNA腺57 重庆医科大学博士研究生学位论文病毒转染DCs，使A20低表达，然后再使用流式细胞仪检测DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平，从而明确A20是否对DCs细胞成熟分化有影响。结果显示，A20-shRNA腺病毒转染DCs后，对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响。我们的结果与一些研究是相似的[52]。通过实验发现，A20对DCs细胞的成熟度没有影响。那么，A20到底通过什么样的途径对DCs细胞产生影响，从而引起Behcet病的发生发展需要我们进一步研究。4总结在这一部分，我们通过A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，然后再使用流式细胞仪检测DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平，从而明确A20是否对DCs细胞成熟分化有影响。结果显示，A20-shRNA腺病毒转染DCs后，对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响。综上所述，A20并不是通过对DCs细胞成熟度的影响来发挥作用，我们需进一步研究A20对DCs细胞功能的作用。5研究展望在该部分，我们通过降低DCs细胞中A20的表达来明确A20是否对DCs的成熟度有影响。需要更进一步的研究包括：1、A20对DCs分泌功能有没有影响；2、A20能否能对CD4+T细胞的成熟与分化产生影响。58 重庆医科大学博士研究生学位论文第三章A20对DCs分泌细胞因子的影响1材料及方法1.1主要的试剂、仪器低温离心机Eppendorf公司，美国人淋巴细胞分离液上海生物工程有限公司LPSSigma，美国细胞培养液1640Gibco,美国胎牛血清Gibco,美国GM-CSFACROBiosystems，美国人重组IL-4ACROBiosystems，美国人IL-1βELISA检测试剂盒R&DSystems，美国人IL-10ELISA检测试剂盒R&DSystems，美国人IL-27ELISA检测试剂盒R&DSystems，美国人IL-6ELISA检测试剂盒R&DSystems，美国CD14+磁珠Miltenyi，德国MACS磁珠分选架Miltenyi，德国微量加样枪Eppendorf公司，美国腺病毒汉恒生物科技有限公司，上海倒置荧光显微镜OlympusCKX41，日本37℃细胞培养箱ShelLab，美国流式细胞仪BDBioscience，美国1.2密度梯度离心分离人外周血单核细胞（PBMCs）参见第一部分第一章1.359 重庆医科大学博士研究生学位论文1.3CD14+T单核细胞的分离参见第三部分1.41.4单核诱导的树突状细胞（DCs）的培养参见第三部分1.51.5腺病毒感染DCs参见第四部分第一章1.51.6酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）严格按照人IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27ELISA检测试剂盒的操作步骤进行：（1）用PBS稀释180倍一抗并混匀，用排枪加入ELISA板中，每孔100ul，膜封闭压紧，室温孵育过夜。（2）第二天将ELISA板取出，倒掉液体，在厚厚的吸水纸上，用力拍打板子，力求把孔中的液体完全弃干净。排枪加入Washingbuffer300ul/孔，摇床摇匀2min，在滤纸上拍干液体，如此反复洗板共3次。（3）加入封闭液ReagentDiluent(RD)300ul/孔，37℃水浴箱孵育60min。（4）配制标准品：根据细胞因子说明书将标准品稀释至相应浓度，再进行倍数逐级递减，使最后达到7个稀释浓度，待用。（5）取出ELISA板，弃掉液体，在厚厚的吸水纸上，用力拍干，重复步骤（2）。（6）按浓度配比依次在ELISA板每孔中分别加入标准品以及细胞上清标本100ul，ELISA板使用摇床摇匀，膜封后室温下孵育2h以上。（7）二抗用Reagentdiluent稀释180倍。（8）取出ELISA板，弃掉液体，在厚厚的吸水纸上，用力拍干，重复步骤（2）。（9）ELISA板每孔加入已经稀释的检测二抗100ul，混匀，膜封后室温下避光孵育2h。（10）将原浓度HRP稀释200倍，混匀，备用。（11）取出ELISA板，弃掉液体，在厚厚的吸水纸上，用力拍干，重复步骤60 重庆医科大学博士研究生学位论文（2）。（12）已经稀释的HRP100ul，混匀，膜封后室温下避光孵育20min。（13）配置AB液：底物A液和底物B液按1:1混匀。（14）取出ELISA板，弃掉液体，在厚厚的吸水纸上，用力拍干，重复步骤（2）。（15）A液和B液进行等比混匀，按照100ul/孔加入至ELISA板中孔中，膜封后避光室温孵育20min。（16）取出ELISA板，每孔加入5％H2SO450ul,终止反应，颜色变黄。（17）使用酶标仪检测OD值，并进行统计学分析。2结果在前面的实验中，我们已经发现A20并不是通过对DCs细胞成熟度的影响来发挥作用的。那么，A20会不会对DCs细胞分泌炎性细胞因子产生影响。为了证实以上假设，我们通过A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，通过ELIAS的方法检测DCs细胞分泌炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27的表达情况，从而探讨A20对DCs分泌细胞因子的影响。结果显示：通过腺病毒转染的方法低表达A20，DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加，而IL-10和IL-27的水平降低，A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生（图3-5）。图3-5转染后DCs细胞培养上清中IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27表达水平Figure3-5IL-1β、IL-6、IL-10andIL-27expressiononthesupernatantofDCsaftertransducted61 重庆医科大学博士研究生学位论文3讨论机体对外源性和内源性分子的防御是免疫系统进行调控，免疫系统又是通过固有免疫和适应性免疫来抵御外界病原体侵袭，固有免疫还起到协调体内免疫反应的功能。固有免疫系统因此理所当然的成为了机体的第一道免疫防线。固有免疫发挥其功能依靠巨噬细胞、树突状细胞以及NK细胞等固有免疫细胞表面表达的模式识别受体来识别外界的病原体。当免疫反应发生时，巨噬细胞、树突状细胞以及NK细胞等免疫细胞会产生IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27等细胞因子，这些细胞因子之间相互协调作用，共同完成免疫调节功能。IL-1β是IL-1的一种存在形式，IL-1β可由多种细胞分泌合成，如内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。在生理条件下，IL-1β的含量非常低，但是在许多免疫性疾病如类风湿性关节炎[53]等，IL-1β就会发挥作用，导致其含量升高，这些免疫性疾病的发生都与IL-1β的上调有着密切的关系。IL-1β对Th17细胞分化、增殖及Behcet病发病中起到了重要作用[54]。IL-6能够抑制Th1、Treg细胞的分化，促进Th2、Th17细胞的分化；并且能够促进B细胞增殖、分化并产生抗体。IL-10能够抑制Th1类淋巴因子的合成及其活性，抑制NK细胞的活性，抑制T细胞的凋亡，因此，具有很强的抗炎及免疫抑制活性。已经证实，用IL-10治疗小鼠关节炎，能够减轻关节肿胀和软骨破坏[55]。IL-27由抗原呈递细胞活化早期阶段产生，促进naiveT细胞增殖，促进CD4+T细胞向Th1方向分化，在抗感染、免疫及抗肿瘤免疫等方面发挥作用，参与机体多种疾病的演变过程。在由Th1反应介导的实验性自身免疫性关节炎动物模型中，加入抗IL-27p28抗体能够缓解关节炎的进程[56]。在前一部分的研究中，我们发现A20-shRNA腺病毒转染DCs后，对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响。那么，A20对DCs细胞因子的分泌情况又如何呢？我们通过A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，通过ELIAS的方法检测DCs细胞分泌炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27的表达情况。结果显示：A20低表达后，DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加，而IL-10和IL-27的水平降低，A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。这样的结果与一些研究者的结果是相一致的[57;58]。除了葡萄膜炎以外，在其他的疾病研究如狼疮性肾损伤模型中也发现血清中62 重庆医科大学博士研究生学位论文IL-1β和IL-6的水平增加，如果将这种模型的小鼠注射Ad-A20，其炎症反应明显减轻，肾脏损害降低[59]。在另一项研究中，研究人员在慢性丙型肝炎患者中通过siRNA转染技术沉默A20基因表达，结果发现，随着时间的推移IL-10产生的水平逐渐下降，在72h最为明显[60]。这些结果说明，A20在Behcet病发病机制中是通过影响DCs分泌细胞因子起作用，而不是通过影响DCs的成熟度发挥作用的。4总结在这一部分，我们通过A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，通过ELIAS的方法检测DCs细胞分泌炎性细胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和IL-27的表达情况。结果显示：通过腺病毒转染的方法低表达A20，DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加，而IL-10和IL-27的水平降低，A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。综上所述，A20在Behcet病发病机制中可能是通过影响DCs分泌细胞因子起作用。5研究展望在该部分我们通过降低DCs细胞中A20的表达来明确A20是否对DCs炎症因子分泌水平有影响。需要进行更进一步的研究有：1、A20对CD4+T细胞分泌细胞因子的影响；2、A20通过何种机制对DCs功能产生影响；63 重庆医科大学博士研究生学位论文第四部分A20对共培养体系中CD4+T细胞功能的影响1材料及方法1.1研究对象选取活动期Behcet病患者6例，同时选取6例正常对照。所有的患者及健康人均来自重庆医科大学附属第一医院葡萄膜炎专科门诊，Behcet病的诊断标准采用的是国际葡萄膜炎会议制定的诊断标准进行诊断[27]。活动期Behcet病患者指患者在采血时就表现为活动性的葡萄膜炎，而且患者未使用过任何激素类药物或影响全身免疫功能的免疫抑制剂。静止期Behcet病患者指采血时患者处于炎症静止期，无任何眼外症状，且已经停药2月以上。1.2主要试剂和仪器低温离心机Eppendorf公司，美国人淋巴细胞分离液上海生物工程有限公司LPSSigma，美国细胞培养液1640Gibco,美国胎牛血清Gibco,美国GM-CSFACROBiosystems，美国人重组IL-4ACROBiosystems，美国人CD14+T细胞分选磁珠Miltenyi，德国MACS磁珠分选架Miltenyi，德国人CD4+T细胞分选磁珠Miltenyi，德国ionomycinSigma，美国phorbol-12-myristate-13-acetateSigma，美国（PMA）brefeldinA（BFA）Sigma，美国64 重庆医科大学博士研究生学位论文IL-17流式抗体eBioscience,美国倒置荧光显微镜OlympusCKX41，日本腺病毒汉恒生物科技有限公司，上海微量加样枪Eppendorf公司，美国37℃细胞培养箱ShelLab，美国流式细胞仪BDBioscience，美国1.3密度梯度离心分离人外周血单核细胞（PBMCs）参见第一部分第一章1.31.4分离CD14+T单核细胞参见第三部分1.41.5CD4+T单核细胞的分离（1）离心机300g室温离心分离出的PBMCs细胞10min。（2）弃上清，将80ul磁珠buffer加入到含有细胞的BD管中，吹打混匀，再加入20ul单核细胞磁珠（CD4+磁珠），BD管放入4℃冰箱中孵育15min。（3）取出孵育的细胞，将1ml磁珠buffer加入到细胞中，离心机300g室温离心10min。（4）弃第（3）步离心后的上清，加500ul磁珠buffer混匀细胞。（5）取出MS柱，加入500ul磁珠buffer润湿柱子，上述混匀的细胞加入MS柱。（6）等待液体过滤完毕，再加入500ul磁珠buffer，此操作重复三次。（7）把MS柱放在新的15mlBD管中，将1ml磁珠buffer加入到MS柱中，推注器快速推压磁珠buffer如BD管中。（8）重复步骤（7）。（9）将装有细胞的BD管中加入2mlPBS，室温离心1000g，5min。（10）弃上清，此时得到的就是CD4+T细胞。（11）用计数板进行台盼蓝细胞计数。65 重庆医科大学博士研究生学位论文1.6单核诱导的树突状细胞（DCs）的培养参见第三部分1.51.7腺病毒感染DCs参见第四部分第一章1.51.8DCs与CD4+T细胞共培养（1）DCs培养3天后，腺病毒转染DCs，再进行培养48小时，此时加入LPS（100ng/ml）刺激24小时，使其成为成熟的DCs。（2）取出收集培养板中的成熟DCs，进行细胞计数。（3）将DCs与CD4+T细胞按比例(DCs:CD4+T细胞=1:5)进行混合，加到96孔培养板中，培养6天。（4）收集96孔板中的CD4+T细胞。1.9流式细胞技术检测Th17细胞的比例（1）在超净台中将培养成功的CD4+T细胞从培养板中吸出至消毒的EP管中，400g5min离心。（2）弃液后加入1ml1640至EP管中，吹匀，将细胞种于24孔培养板中。（3）每孔中加入PMA（50ng/ml）和ionomycin（1ug/ml）各1ul，吹匀后放入37℃恒温培养箱孵育1h。（4）随后在24孔培养板中加入BFA（10ug/ml），吹打均匀后37℃恒温培养箱中培养4h。（5）将细胞加入到流式管中。（6）PBS1ml洗涤细胞后离心1450rpm10min。（7）弃上清，加入200ul流式破膜固定剂，混匀，4℃避光孵育30min。（8）取出细胞，加入2ml破膜buffer，混匀，室温离心1450rpm10min。（9）弃上清，加入100ul破膜buffer重悬细胞，再加入抗IL-17抗体，避光4℃冰箱孵育30min。66 重庆医科大学博士研究生学位论文（10）1mlPBS洗涤细胞后离心1450rpm10min。（11）弃液后加入300ulPBS，上机检测。2结果在前面的实验中，我们通过腺病毒转染的方法低表达A20，DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加，而IL-10和IL-27的水平降低，A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。以上结果说明A20能够通过调节DCs分泌的细胞因子来发挥其重要的作用。DCs在T细胞的激活中发挥着重要的作用，有研究发现T细胞中的Th17细胞与Behcet病的发生发展密切相关[15;16]。那么，A20会不会通过调节DCs从而导致T细胞功能发生改变，最终导致疾病的发生及发展。为了验证我们的假设，我们通过A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，然后将转染后的DCs与CD4+T细胞共培养，通过流式细胞仪检测Th17细胞的数量。结果显示，A20-shRNA组共培养的CD4+T细胞中，Th17细胞所占CD4+T细胞中的比例显著升高（图4）。图4A20对Th17细胞的影响（A流式示意图;B统计结果）Figure4EffectofDCtransductionwithA20-shRNAonthepercentageofTh17positiveCD4+Tcells（ARepresentativedotplots;BStatisticalresult）67 重庆医科大学博士研究生学位论文3讨论细胞免疫是人体免疫系统的重要组成部分，而T细胞在细胞免疫中又是起着首要的作用。按照表面标志的不同,T细胞主要分CD8+的细胞毒T细胞，CD4+T细胞，CD4+CD25+的调节/抑制性T细胞。以往的研究主要集中在CD8+的细胞毒T细胞，然而，现在越来越多的研究发现，CD4+T细胞在自身免疫中发挥着重要的作用[61]。目前已经证实CD4+T细胞有4类不同的亚群,他们分别是Th1,Th2,Th17和Treg细胞[62]。初始T细胞在胸腺发育后会迁移至周边组织，再通过相应的信号刺激，抗原提呈细胞如DCs等会把抗原提呈给初始T细胞，初始T细胞会根据不同的条件、微环境等分化为辅助性T细胞（helperTcells，Th）[63]。其中，Th17是新发现的Th亚群，在对抗胞外细菌感染、肿瘤及自身免疫中具有重要作用。有研究发现在小鼠的肿瘤模型中，Th17细胞可使较大体积的B16肿瘤消退,其作用明显强于Th1细胞之效果[64]。在相关的肠道免疫性疾病中，肠相关淋巴样组织存在大量Th17细胞，这些细胞在对抗肠道病原中发挥着免疫保护作用。肠道细菌是分化所必需的，因为无菌小鼠中Th17细胞的数量明显下降[65]。研究发现，Th17细胞的比例和其所产生的细胞因子IL-17在Behcet病中显著升高[15;16]，而调节性T（Treg）细胞的比例和功能明显降低[17;18]。在葡萄膜炎的动物模型中发现，当葡萄膜炎发作时，Th1和Th17会出现显著增高，如果抑制Th1和Th17细胞反应或者是抑制与Th1和Th17细胞相关的细胞因子则能够抑制炎症的发生和发展；而Treg细胞过继转移能够显著抑制动物模型中葡萄膜炎发生和发展。来自日本和土耳其的全基因组关联研究显示IL-10、IL-23R/IL-12RB2基因的单核苷酸多态性（SNP）与Behcet病显著相关[19;20]，而IL-10、IL-23R和IL-12R分别是Treg、Th17和Treg细胞分化过程中的关键分子。前期我们提出假设，DCs内TLR的负性信号调节分子A20改变引起DCs活化和功能改变，最终引起Th17细胞改变、一些细胞因子产生及Behcet病的发生。因此，我们进行了相关的实验，实验结果发现：活动期Behcet病患者DCs细胞中A20mRNA表达水平明显低于正常人。活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平降低，而静止期Behcet病患者和正常人相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平无明显差异；A20-shRNA腺病毒转68 重庆医科大学博士研究生学位论文染DCs后，对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响；通过腺病毒转染的方法低表达A20，DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加，而IL-10和IL-27的水平降低，A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。为了进一步探讨A20对CD4+T细胞的作用。我们通过A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，然后将转染后的DCs与CD4+T细胞共培养，通过流式细胞仪检测Th17细胞的数量。结果显示，A20-shRNA组共培养的CD4+T细胞中，Th17细胞所有CD4+T细胞中所占的比例显著升高。这样的结果也说明，Th17细胞与Behcet病的发生和发展有密切的关系，A20参与Behcet病发病机制的作用通路。4总结在这一部分，我们通过A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，然后将转染后的DCs与CD4+T细胞共培养，通过流式细胞仪检测Th17细胞的数量。结果显示，A20-shRNA组共培养的CD4+T细胞中，Th17细胞所有CD4+T细胞中所占的比例显著升高。综上所述，A20改变引起DCs活化和功能改变，最终引起Th17细胞改变，导致Behcet病的发生和发展。5研究展望在该部分我们通过降低DCs细胞中A20的表达来明确A20是否对CD4+T细胞分泌细胞因子有影响。需要进行更进一步的研究有：A20通过何种机制对DCs功能产生影响；69 重庆医科大学博士研究生学位论文第五部分A20对DCs功能影响的机制1材料及方法1.1主要试剂、试剂盒和仪器低温离心机Eppendorf公司，美国人淋巴细胞分离液上海生物工程有限公司LPSSigma，美国细胞培养液1640Gibco，美国胎牛血清Gibco，美国GM-CSFACROBiosystems，美国人重组IL-4ACROBiosystems，美国CD14+磁珠Miltenyi，德国MACS磁珠分选架Miltenyi，德国anti-humanJNK-PEBDPharmingen，美国anti-humanERK1/2-PE-Cy5-ABDPharmingen，美国anti-humanP38-PEBDPharmingen，美国微量加样枪Eppendorf公司，美国腺病毒汉恒生物科技有限公司，上海倒置荧光显微镜OlympusCKX41，日本37℃细胞培养箱ShelLab，美国流式细胞仪BDBioscience，美国1.2密度梯度离心分离人外周血单核细胞（PBMCs）参见第一部分第一章1.31.3CD14+T单核细胞的分离70 重庆医科大学博士研究生学位论文参见第三部分1.41.4单核诱导的树突状细胞（DCs）的培养参见第三部分1.51.5腺病毒感染DCs参见第四部分第一章1.51.6流式细胞技术检测DCs中JNK、ERK1/2、P38的磷酸化水平（1）DCs培养至第六天时，加入LPS（100ng/ml）刺激30min（2）取出DC细胞，迅速将DC细胞转移至流式管中，500g×5min离心后弃上清（3）每个流式管中加入250ul固定液，37℃孵育15分钟（4）取出流式管，用PBS洗两次，500g×5min离心后弃上清（5）每个流式管中加入200ul破膜剂，4℃孵育30min（6）取出流式管，用PBS洗两次，500g×5min离心后弃上清（7）先将200ulPBS加入到每个流式管中，然后再分别加入20ulanti-phospho-ERK1/2,20ulanti-phospho-p38,5ulanti-phospho-JNK和阴性对照抗体，37℃孵育30分钟（8）取出流式管，用PBS洗两次，500g×5min离心后弃上清（9）每个流式管中加入200ulPBS，震荡，上机检测测2结果在前面的实验中，我们已经证实A20-shRNA腺病毒转染DCs后，对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响；通过腺病毒转染的方法低表达A20，DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加，而IL-10和IL-27的水平降低，A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。A20的降低能够促进Th17细胞所有CD4+T细胞中所占的比例显著升高。但是，A20是通过何种信号通路来影响DCs的功能还不得而知。接下来，我们进一71 重庆医科大学博士研究生学位论文步实验观察A20是否通过MAPK信号通路对DCs发挥作用。我们通过A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，然后再继续培养48小时，接着加入LPS(100ng/ml)培养基内，半小时后，我们通过流式细胞仪检测JNK、p38及ERK1/2的磷酸化水平。结果显示：腺病毒转染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明显升高，具有统计学意义，而ERK1/2的磷酸化水平没有变化（图5-1,5-2）。图5-1流式细胞技术检测JNK、p38及ERK1/2的磷酸化水平Figure5-1ExpressionofphosphorylatedJNK,p38andERK1/2wasdetectedbyflowcytometry72 重庆医科大学博士研究生学位论文图5-2流式细胞技术检测（B）、P38（C）和（D）磷酸化水平的平均荧光强度值Figure5-2MFIofphosphor-JNK,P38andERK1/23讨论细胞对外界环境变化的发生反应部分是由一系列胞内信号途径来诱导的，信号通路接替、放大并整合来自胞外刺激的信号，最终导致基因和生理的改变。有丝分裂原激活蛋白激酶（MitogenActivatedProteinKinase，MAPK）信号通路普遍存在于哺乳动物细胞内。当其被多种刺激因素激活后，可以对细胞进行调控和基因表达，最终对生长、增殖、分化、应激反应、生存和调亡等进行调节[66]。MAPK的激活是众多疾病发病的关键因素，如自身免疫性疾病、感染、肿瘤、炎症性疾病等[67;68]。MAPK信号通路主要包括三条特征性的通路：（1）c-junN氨基末端激73 重庆医科大学博士研究生学位论文酶(JNK)/应激活化蛋白激酶（stress-activatedproteinkinnase,SAPK）信号通路；（2）细胞外信号调节蛋白激酶(exrtacellular-signalregulatedproteinkinase，ERK)信号通路；（3）p38MAPK信号通路。所有MAPK家族成员通过苏氨酸或络氨酸残基磷酸化被特定的上游激酶（MAPKkinase，MAPKK）活化，而每个MAPKK则通过丝氨酸或苏氨酸残基磷酸化被MAPKK激酶（MAPKKkinase，MAPKKK）活化[69]。JNK信号通路是1990年被发现的促分裂原活化蛋白激酶，为MAPK家族的主要成员之一，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。JNK1和JNK2在体内广泛分布,而JNK3则局限于脑组织[70]。JNK信号通路可被细胞因子、氧化损伤等应激所激活，经过一系列活化，最后磷酸化JNK[71]。目前大量研究证实，JNK信号通路在细胞分化、细胞凋亡以及应激反应和组织器官纤维化中发挥着重要作用，由此看来是正常机体与疾病状态时细胞的一个重要调节靶点。在免疫方面有研究表明，在Behcet病人中，IL-37对DCs内活性氧的产生以及JNK信号通路的磷酸化均有明显的抑制作用[72]。同样，在细胞凋亡方面，JNK信号通路对细胞凋亡起着重要的调控作用。用反应性氧核素来抑制MKP活性可以延长JNK的活化[73]。在肿瘤方面，有研究发现[74]JNK的阻断剂能够明显抑制胃泌素促进IEC-18和Caco-2细胞增殖，从而促进大肠癌细胞增殖抑制凋亡。在我们的实验中，通过腺病毒转染降低A20的表达，我们发现，JNK的磷酸化水平明显升高，这与其他研究者的结果是一致的[75]。这也表明JNK信号通路在Behcet病的发生发展中起作用。ERK信号通路是哺乳动物体内被鉴定的首个信号途径，当外界多种刺激因素激活后，它能够将细胞外的信号转移到细胞内，因此，ERK信号通路是最重要，也是最经典的MAPK信号通路。ERK1/2定位于染色体1p34～35，全长3118bp，由ERK1和ERK2两种异构体组成，相对分子量分别为44kD和42Kd，分布于细胞浆内。当外界的刺激因素持续的时间或强度发生变化时，ERK信号通路会根据情况调节细胞的分化、增殖、发育及凋亡等[76]。如果ERK信号通路出现失活，此时细胞表现为停滞在G1晚期，从而无法进入S期。如果外界的刺激因素导致ERK过度活化，则会加速细胞的有丝分裂进程，最终的结果则是导致细胞增殖加强[77]。研究还表明，在大鼠哮喘模型中，ERK信号通路可以增强核转录因子NF-κB和AP-1的活化，加重哮喘大鼠肺部炎症[78]。ERK同样对胸腺细胞发育成熟起非常重要的作用，在相关的研究中，发现ERK能够介导分化T淋巴细胞的作用。这些都74 重庆医科大学博士研究生学位论文证实ERK是细胞增殖与分化、器官发生与胚胎发育中不可缺少的信号蛋白[79]。在本研究中，我们通过腺病毒转染DCs并沉默A20，发现DCs分泌促炎因子IL-6、IL-1β升高，分泌的抑炎因子IL-10降低，而ERK1/2磷酸化水平没有发生变化，这可能是由于ERK1/2与细胞的凋亡、分化及增殖有关。LPS刺激巨噬细胞时发现一种酪氨酸磷酸化蛋白，这就是p38,它由360个氨基酸组成，分子量为38kDa，其与炎症、细胞生长、分化和凋亡相关[80]。哺乳动物细胞中有5种p38异构体，p38α、p38β1、p38β2、p38γ、p38δ。p38信号转导通路主要参与细胞外应激引起的细胞内多种蛋白激酶的连锁反应，进而影响RNA转录和蛋白合成以及细胞表面受体表达等生物学功能[81;82]。炎症刺激,如LPS、TNF、IL-1和缺血-再灌注等，均可介导单核细胞、内皮细胞和中性粒细胞等先天性免疫细胞p38的激活[83]。有研究表明，在实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠中枢神经系统内炎性细胞和神经胶质内的磷酸化的p38水平明显上升，如果使用p38抑制剂阻断p38信号通路，则会明显减少实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的发病，在已经出现自身免疫性脑脊髓炎的小鼠中，使用p38抑制剂还可以延缓病情的发展[84;85]。Behcet病作为一种自身免疫性疾病，我们通过研究发现，使用A20-shRNA腺病毒转染DCs，使A20低表达，通过流式细胞仪检测JNK、p38及ERK1/2的磷酸化水。结果显示：p38的磷酸化水平明显升高，具有统计学意义。这也说明p38信号通路参与了A20对DCs的影响。从以上的结果我们不难看出，腺病毒转染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明显升高，具有统计学意义，而ERK1/2的磷酸化水平没有变化。这与一些研究者的结果是相似的[75]。但是，有意思的是，我们的结果与有的研究又不太一样。有研究发现，发现通过基因敲除的方法，沉默间充质干细胞中的A20基因，可以抑制p38信号通路的激活，从而促进TNF-α的产生以及抑制IL-10生产[86]。我们考虑，骨髓间充质干细胞是一种非常特殊的细胞类型，它具有自我更新和分化的能力，出现这种差异的原因可能是由于细胞类型的不同。通过实验我们发现A20能够通过MAPK信号通路中的JNK及p38对DCs发挥作用，那么，临床中我们能否以MAPK为靶点，研制有效的基因阻断治疗药物，从而为葡萄膜炎患者提供新的治疗对策。75 重庆医科大学博士研究生学位论文4总结综上所述，葡萄膜炎是一类由感染因素和（或）免疫反应等原因造成的脉络膜组织的炎症。其中VKH综合征和Behcet病在我国不但是最常见的葡萄膜炎类型，也是致盲率最高的葡萄膜炎类型。尽管Behcet病和VKH综合征的确切致病原因和发病机制并不清楚，但是近年来的研究发现自身免疫因素和遗传因素参与了两种疾病的发生和发展。研究发现，VKH综合征和Behcet病中Th17细胞反应失衡密切相关。DCs是机体功能最强的专职抗原递呈细胞，DCs通过分泌IL-12、IL-1beta、IL-6、IL-7、IL-23和OPN等促进Th17细胞分化及增殖，从而启动相关免疫应答。A20在免疫反应的负性调节作用，并且已经证实，A20参与DC活化、成熟和功能的调控。通过以上分析和梳理我们推测:DCs细胞内的负性信号调节分子A20改变引起DCs活化和功能改变，最终引起Th1、Th17、Treg细胞改变、一些细胞因子产生及葡萄膜炎发生。因此，我们设计了以下的实验步骤来研究A20是否与VKH综合征和Behcet病的发生和发展密切相关。1、A20在Behcet病与VKH综合征患者中mRNA表达水平的研究。2、A20在Behcet病患者DCs中mRNA表达水平的研究3、腺病毒转染DCs、转染效率及有效性检测。4、A20对DCs成熟度的影响。5、A20对DCs分泌细胞因子的影响。6、A20对共培养体系中CD4+T细胞功能的影响。7、A20对DC功能影响的机制经过实验我们得出以下结论：1、活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显低于静止期Behcet病患者及正常人，而且活动期Behcet病患者PBMCs中A20mRNA的表达水平明显降低，但能够检测的出来。而静止期Behcet病患者及正常人的A20比较则无明显的差异。2、活动期与静止期VKH综合征患者A20在PBMCs中mRNA水平的表达与正常人无明显差异。3、活动期Behcet病患者DCs细胞中A20mRNA表达水平明显低于正常人。76 重庆医科大学博士研究生学位论文活动期Behcet病患者和静止期Behcet病患者相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平降低，而静止期Behcet病患者和正常人相比，其DCs细胞中A20mRNA表达水平无明显差异。4、通过带有GFP荧光基团标记的腺病毒对DCs进行转染，并通过荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况，结果发现，当MOI值为500时，绿色荧光蛋白的表达情况最高，流式细胞仪检测转染效率为78.7%。制备的人A20-shRNA腺病毒能够在DCs中导致A20下调。5、A20-shRNA腺病毒转染DCs后，对DCs细胞表面的成熟标记分子CD40、CD80、CD83、CD86、HLA-DR的表达水平没有明显的影响。6、通过腺病毒转染的方法低表达A20，DCs细胞分泌IL-1β和IL-6的水平增加，而IL-10和IL-27的水平降低，A20能够负向调控DCs细胞分泌炎性因子的产生。7、A20-shRNA组共培养的CD4+T细胞中，Th17细胞所有CD4+T细胞中所占的比例显著升高。8、腺病毒转染DCs并沉默A20后JNK及p38的磷酸化水平明显升高，具有统计学意义，而ERK1/2的磷酸化水平没有变化。综上所述，本研究探讨了A20在Behcet病与VKH综合征患者及正常人中PBMCmRNA表达水平，Behcet病患者及正常人DCs细胞中的表达水平。然后通过腺病毒转染DCs并沉默A20的方法，明确了A20对DCs成熟度的影响，对DCs分泌功能的影响以及A20对DCs功能影响的机制，并研究了A20对共培养体系中CD4+T细胞功能的影响。该研究证明，A20对Behcet病的发生发展起到了重要的作用。以上结论为寻求Behcet病新的防治途径提供部分理论依据和试验基础。5研究展望我们通过研究A20在Behcet病与VKH综合征患者及正常人中PBMCmRNA表达水平、蛋白水平以及在Behcet病DCs细胞中的表达水平证实A20的降低与Behcet病密切相关。后续我们通过腺病毒转染DCs并沉默A20的方法，明确了A20对DCs成熟度的影响，对DCs分泌功能的影响以及A20对DCs功能影响的机制，并研究了A20对共培养体系中CD4+T细胞功能的影响。但仍需进一步研究77 重庆医科大学博士研究生学位论文的内容还有：1、该研究主要是体外实验，还需要行动物实验、体内实验来进一步验证A20在Behcet病发生发展中的作用；2、我们研究了A20对DCs成熟度、分泌功能的影响，但对于其他细胞如巨噬细胞、中性粒细胞等细胞的情况还不清楚；3、我们发现A20能够通过MAPK信号转导通路对DCs的成熟度、功能进行影响，但是否还存在其他的信号传导通路，也是我们需要进一步研究的；4、我们仅仅是选取了VKH综合征和Behcet病这两种最常见的葡萄膜炎类型进行研究，那么，对于其他类型的葡萄膜炎如急性前葡萄膜炎、交感性眼炎等是否也有影响还需要进一步研究。78 重庆医科大学博士研究生学位论文参考文献[1]GritzDC,WongIG.IncidenceandprevalenceofuveitisinNorthernCalifornia;theNorthernCaliforniaEpidemiologyofUveitisStudy[J].Ophthalmology,2004,111(3):491-500;discussion500.[2]PreteM,DammaccoR,FatoneMC,etal.Autoimmuneuveitis:clinical,pathogenetic,andtherapeuticfeatures[J].ClinExpMed,2016,16(2):125-36.[3]BodaghiB,CassouxN,WechslerB,etal.Chronicsevereuveitis:etiologyandvisualoutcomein927patientsfromasinglecenter[J].Medicine(Baltimore),2001,80(4):263-70.[4]YangP,FangW,MengQ,etal.ClinicalfeaturesofchinesepatientswithBehcet'sdisease[J].Ophthalmology,2008,115(2):312-318e4.[5]杨培增，张震，王红等.葡萄膜炎的临床类型及病因探讨[J].中华眼底病,2002,18:25.[6]SakaneT,TakenoM,SuzukiN,etal.Behcet'sdisease[J].NEnglJMed,1999,341(17):1284-91.[7]IqniebiA,GaafarA,SheereenA,etal.HLA-DRB1amongpatientswithVogt-Koyanagi-HaradadiseaseinSaudiArabia[J].MolVis,2009,15:1876-80.[8]YamadaK,SenjuS,ShinoharaT,etal.HumoralimmuneresponsedirectedagainstLEDGFinpatientswithVKH[J].ImmunolLett,2001,78(3):161-8.[9]DuL,KijlstraA,YangP.Immuneresponsegenesinuveitis[J].OculImmunolInflamm,2009,17(4):249-56.[10]KawakamiY,SuzukiY,ShofudaT,etal.Tcellimmuneresponsesagainstmelanomaandmelanocytesincancerandautoimmunity[J].PigmentCellRes,2000,13Suppl8:163-9.[11]LevinsonRD,SeeRF,RajalingamR,etal.HLA-DRB1and-DQB1allelesinmestizopatientswithVogt-Koyanagi-Harada'sdiseaseinSouthernCalifornia[J].79 重庆医科大学博士研究生学位论文HumImmunol,2004,65(12):1477-82.[12]YangP,ZhangZ,ZhouH,etal.ClinicalpatternsandcharacteristicsofuveitisinatertiarycenterforuveitisinChina[J].CurrEyeRes,2005,30(11):943-8.[13]RaoNA,GuptaA,DustinL,etal.FrequencyofdistinguishingclinicalfeaturesinVogt-Koyanagi-Haradadisease[J].Ophthalmology,2010,117(3):591-9,599e1.[14]YangP,RenY,LiB,etal.ClinicalcharacteristicsofVogt-Koyanagi-HaradasyndromeinChinesepatients[J].Ophthalmology,2007,114(3):606-14.[15]LiuX,YangP,LinX,etal.InhibitoryeffectofCyclosporinAandcorticosteroidsontheproductionofIFN-gammaandIL-17byTcellsinVogt-Koyanagi-Haradasyndrome[J].ClinImmunol,2009,131(2):333-42.[16]ChiW,ZhuX,YangP,etal.UpregulatedIL-23andIL-17inBehcetpatientswithactiveuveitis[J].InvestOphthalmolVisSci,2008,49(7):3058-64.[17]GeriG,TerrierB,RosenzwajgM,etal.CriticalroleofIL-21inmodulatingTH17andregulatoryTcellsinBehcetdisease[J].JAllergyClinImmunol,2011,128(3):655-64.[18]NankeY,KotakeS,GotoM,etal.DecreasedpercentagesofregulatoryTcellsinperipheralbloodofpatientswithBehcet'sdiseasebeforeocularattack:apossiblepredictivemarkerofocularattack[J].ModRheumatol,2008,18(4):354-8.[19]MizukiN,MeguroA,OtaM,etal.Genome-wideassociationstudiesidentifyIL23R-IL12RB2andIL10asBehcet'sdiseasesusceptibilityloci[J].NatGenet,2010,42(8):703-6.[20]RemmersEF,CosanF,KirinoY,etal.Genome-wideassociationstudyidentifiesvariantsintheMHCclassI,IL10,andIL23R-IL12RB2regionsassociatedwithBehcet'sdisease[J].NatGenet,2010,42(8):698-702.[21]SunSC.Deubiquitylationandregulationoftheimmuneresponse[J].NatRevImmunol,2008,8(7):501-11.[22]ShembadeN,HarhajEW.RegulationofNF-kappaBsignalingbytheA20deubiquitinase[J].CellMolImmunol,2012,9(2):123-30.[23]TurerEE,TavaresRM,MortierE,etal.HomeostaticMyD88-dependentsignals80 重庆医科大学博士研究生学位论文causelethalinflamMationintheabsenceofA20[J].JExpMed,2008,205(2):451-64.[24]HammerGE,TurerEE,TaylorKE,etal.ExpressionofA20bydendriticcellspreservesimmunehomeostasisandpreventscolitisandspondyloarthritis[J].NatImmunol,2011,12(12):1184-93.[25]KoolM,VanLooG,WaelputW,etal.Theubiquitin-editingproteinA20preventsdendriticcellactivation,recognitionofapoptoticcells,andsystemicautoimmunity[J].Immunity,2011,35(1):82-96.[26]LiH,LiuQ,HouS,etal.TNFAIP3genepolymorphismsconferriskforBehcet'sdiseaseinaChineseHanpopulation[J].HumGenet,2013,132(3):293-300.[27]CriteriafordiagnosisofBehcet'sdisease.InternationalStudyGroupforBehcet'sDisease[J].Lancet,1990,335(8697):1078-80.[28]ReadRW,HollandGN,RaoNA,etal.ReviseddiagnosticcriteriaforVogt-Koyanagi-Haradadisease:reportofaninternationalcommitteeonnomenclature[J].AmJOphthalmol,2001,131(5):647-52.[29]RothovaA,Suttorp-VanSchultenMS,FritsTreffersW,etal.Causesandfrequencyofblindnessinpatientswithintraocularinflammatorydisease[J].BrJOphthalmol,1996,80(4):332-6.[30]ChangJH,WakefieldD.Uveitis:aglobalperspective[J].OculImmunolInflamm,2002,10(4):263-79.[31]BonfioliAA,OreficeF.Behcet'sdisease[J].SeminOphthalmol,2005,20(3):199-206.[32]CheeSP,JapA,BacsalK.SpectrumofVogt-Koyanagi-HaradadiseaseinSingapore[J].IntOphthalmol,2007,27(2-3):137-42.[33]HymowitzSG,WertzIE.A20:fromubiquitineditingtotumoursuppression[J].NatRevCancer,2010,10(5):332-41.[34]BosanacI,WertzIE,PanB,etal.UbiquitinbindingtoA20ZnF4isrequiredformodulationofNF-kappaBsignaling[J].MolCell,2010,40(4):548-57.[35]LiD,WangL,FanY,etal.Down-regulationofA20mRNAexpressionin81 重庆医科大学博士研究生学位论文peripheralbloodmononuclearcellsfrompatientswithsystemiclupuserythematosus[J].JClinImmunol,2012,32(6):1287-91.[36]SistoM,BarcaA,LofrumentoDD,etal.DownstreamactivationofNF-kappaBintheEDA-A1/EDARsignallinginSjogren'ssyndromeanditsregulationbytheubiquitin-editingenzymeA20[J].ClinExpImmunol,2016,184(2):183-96.[37]LiH,LiuQ,HouS,etal.TNFAIP3genepolymorphismsinaChineseHanpopulationwithVogt-Koyanagi-Haradasyndrome[J].PLoSOne,2013,8(3):e59515.[38]WangX,AiL,XuQ,etal.A20AttenuatesLiverFibrosisinNAFLDandInhibitsInflammationResponses[J].Inflammation,2017,40(3):840-848.[39]ZhengCF,ShiJR,HuangY,etal.A20inhibitslipopolysaccharide-inducedinflammationinenterocytes[J].WorldJGastrointestPharmacolTher,2016,7(4):540-549.[40]ClementeXimenisA,CrespiBestardC,CambraConejeroA,etal.InvitroevaluationofgammadeltaTcellsregulatoryfunctioninBehcet'sdiseasepatientsandhealthycontrols[J].HumImmunol,2016,77(1):20-8.[41]WeiJR,WenX,BiblePW,etal.PanaxNotoginsengSaponinControlsIL-17ExpressioninHelperTCells[J].JOculPharmacolTher,2017,33(4):285-289.[42]ShimJ,LeeES,ParkS,etal.CD4(+)CD25(+)regulatoryTcellsameliorateBehcet'sdisease-likesymptomsinamousemodel[J].Cytotherapy,2011,13(7):835-47.[43]SteinmanRM,CohnZA.Identificationofanovelcelltypeinperipherallymphoidorgansofmice.I.Morphology,quantitation,tissuedistribution[J].JExpMed,1973,137(5):1142-62.[44]FerlazzoG,MunzC.DendriticcellinteractionswithNKcellsfromdifferenttissues[J].JClinImmunol,2009,29(3):265-73.[45]YuH,LiuY,HanJ,etal.TLR7regulatesdendriticcell-dependentB-cellresponsesthroughBlySinimmunethrombocytopenicpurpura[J].EurJHaematol,2011,86(1):67-74.82 重庆医科大学博士研究生学位论文[46]PillarisettyVG,ShahAB,MillerG,etal.Liverdendriticcellsarelessimmunogenicthanspleendendriticcellsbecauseofdifferencesinsubtypecomposition[J].JImmunol,2004,172(2):1009-17.[47]KinghamTP,ChaudhryUI,PlitasG,etal.MurineliverplasmacytoiddendriticcellsbecomepotentimmunostimulatorycellsafterFlt-3ligandexpansion[J].Hepatology,2007,45(2):445-54.[48]MillerG,LahrsS,ShahAB,etal.Optimizationofdendriticcellmaturationandgenetransferbyrecombinantadenovirus[J].CancerImmunolImmunother,2003,52(6):347-58.[49]ZhangM,WangQ,LiuY,etal.EffectiveinductionofimmunetolerancebyportalvenousinfusionwithIL-10gene-modifiedimmaturedendriticcellsleadingtoprolongationofallograftsurvival[J].JMolMed(Berl),2004,82(4):240-9.[50]LiuE,LawHK,LauYL.Toleranceassociatedwithcordbloodtransplantationmaydependonthestateofhostdendriticcells[J].BrJHaematol,2004,126(4):517-26.[51]BeriouG,PecheH,GuillonneauC,etal.Donor-specificallografttolerancebyadministrationofrecipient-derivedimmaturedendriticcellsandsuboptimalimmunosuppression[J].Transplantation,2005,79(8):969-72.[52]BreckpotK,Aerts-ToegaertC,HeirmanC,etal.AttenuatedexpressionofA20markedlyincreasestheefficacyofdouble-strandedRNA-activateddendriticcellsasananti-cancervaccine[J].JImmunol,2009,182(2):860-70.[53]BurgerD,DayerJM,PalmerG,etal.IsIL-1agoodtherapeutictargetinthetreatmentofarthritis?[J].BestPractResClinRheumatol,2006,20(5):879-96.[54]GulA,Tugal-TutkunI,DinarelloCA,etal.Interleukin-1beta-regulatingantibodyXOMA052(gevokizumab)inthetreatmentofacuteexacerbationsofresistantuveitisofBehcet'sdisease:anopen-labelpilotstudy[J].AnnRheumDis,2012,71(4):563-6.[55]KasamaT,StrieterRM,LukacsNW,etal.Interleukin-10expressionandchemokineregulationduringtheevolutionofmurinetypeIIcollagen-induced83 重庆医科大学博士研究生学位论文arthritis[J].JClinInvest,1995,95(6):2868-76.[56]GoldbergR,ZoharY,WildbaumG,etal.Suppressionofongoingexperimentalautoimmuneencephalomyelitisbyneutralizingthefunctionofthep28subunitofIL-27[J].JImmunol,2004,173(10):6465-71.[57]WangC,TianY,LeiB,etal.DecreasedIL-27expressioninassociationwithanincreasedTh17responseinVogt-Koyanagi-Haradadisease[J].InvestOphthalmolVisSci,2012,53(8):4668-75.[58]HoraiR,CaspiRR.Cytokinesinautoimmuneuveitis[J].JInterferonCytokineRes,2011,31(10):733-44.[59]LiM,ShiX,QianT,etal.A20overexpressionalleviatespristine-inducedlupusnephritisbyinhibitingtheNF-kappaBandNLRP3inflammasomeactivationinmacrophagesofmice[J].IntJClinExpMed,2015,8(10):17430-40.[60]MaL,ZhouY,ZhangY,etal.RoleofA20ininterferon-alpha-mediatedfunctionalrestorationofmyeloiddendriticcellsinpatientswithchronichepatitisC[J].Immunology,2014,143(4):670-8.[61]WiederT,BraumullerH,KneillingM,etal.Tcell-mediatedhelpagainsttumors[J].CellCycle,2008,7(19):2974-7.[62]ZhuJ,PaulWE.CD4Tcells:fates,functions,andfaults[J].Blood,2008,112(5):1557-69.[63]HarringtonLE,HattonRD,ManganPR,etal.Interleukin17-producingCD4+effectorTcellsdevelopviaalineagedistinctfromtheThelpertype1and2lineages[J].NatImmunol,2005,6(11):1123-32.[64]MuranskiP,BoniA,AntonyPA,etal.Tumor-specificTh17-polarizedcellseradicatelargeestablishedmelanoma[J].Blood,2008,112(2):362-73.[65]AtarashiK,NishimuraJ,ShimaT,etal.ATPdriveslaminapropriaT(H)17celldifferentiation[J].Nature,2008,455(7214):808-12.[66]ZhangW,LiuHT.MAPKsignalpathwaysintheregulationofcellproliferationinmammaliancells[J].CellRes,2002,12(1):9-18.[67]MonacoC,AndreakosE,KiriakidisS,etal.T-cell-mediatedsignallinginimmune,84 重庆医科大学博士研究生学位论文inflammatoryandangiogenicprocesses:thecascadeofeventsleadingtoinflammatorydiseases[J].CurrDrugTargetsInflammAllergy,2004,3(1):35-42.[68]SchwartsburdPM.Chronicinflammationasinductorofpro-cancermicroenvironment:pathogenesisofdysregulatedfeedbackcontrol[J].CancerMetastasisRev,2003,22(1):95-102.[69]ZhangP,MartinM,MichalekSM,etal.Roleofmitogen-activatedproteinkinasesandNF-kappaBintheregulationofproinflammatoryandanti-inflammatorycytokinesbyPorphyromonasgingivalishemagglutininB[J].InfectImmun,2005,73(7):3990-8.[70]DavisRJ.SignaltransductionbytheJNKgroupofMAPkinases[J].Cell,2000,103(2):239-52.[71]WestonCR,DavisRJ.TheJNKsignaltransductionpathway[J].CurrOpinGenetDev,2002,12(1):14-21.[72]YeZ,WangC,KijlstraA,etal.Apossibleroleforinterleukin37inthepathogenesisofBehcet'sdisease[J].CurrMolMed,2014,14(4):535-42.[73]MorganMJ,LiuZG.ReactiveoxygenspeciesinTNFalpha-inducedsignalingandcelldeath[J].Molecules&Cells,2010,30(1):1.[74]SinghP,SarkarS,UmarS,etal.Insulin-likegrowthfactorsaremoreeffectivethanprogastrininreversingproapoptoticeffectsofcurcumin:criticalroleofp38MAPK[J].AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol,2010,298(4):G551-62.[75]SongX,YaoZ,YangJ,etal.HCVcoreproteinbindstogC1qRtoinduceA20expressionandinhibitcytokineproductionthroughMAPKsandNF-kappaBsignalingpathways[J].Oncotarget,2016,7(23):33796-808.[76]QiM,ElionEA.MAPkinasepathways[J].JCellSci,2005,118(Pt16):3569-72.[77]RavenhallC,GuidaE,HarrisT,etal.TheimportanceofERKactivityintheregulationofcyclinD1levelsandDNAsynthesisinhumanculturedairwaysmoothmuscle[J].BrJPharmacol,2000,131(1):17-28.[78]BozinovskiS,JonesJE,VlahosR,etal.Granulocyte/macrophage-colony-stimulatingfactor(GM-CSF)regulateslung85 重庆医科大学博士研究生学位论文innateimmunitytolipopolysaccharidethroughAkt/ErkactivationofNFkappaBandAP-1invivo[J].JBiolChem,2002,277(45):42808-14.[79]SohnSJ,LewisGM,WinotoA.Non-redundantfunctionoftheMEK5-ERK5pathwayinthymocyteapoptosis[J].EMBOJ,2008,27(13):1896-906.[80]KyriakisJM,AvruchJ.Mammalianmitogen-activatedproteinkinasesignaltransductionpathwaysactivatedbystressandinflammation[J].PhysiolRev,2001,81(2):807-69.[81]MuthusamyV,PivaTJ.UVB-stimulatedTNFalphareleasefromhumanmelanocyteandmelanomacellsismediatedbyp38MAPK[J].IntJMolSci,2013,14(8):17029-54.[82]MoseM,KangZ,RaabyL,etal.TNFalpha-andIL-17A-mediatedS100A8expressionisregulatedbyp38MAPK[J].ExpDermatol,2013,22(7):476-81.[83]ArbabiS,RosengartMR,GarciaI,etal.Priminginterleukin8production:roleofplatelet-activatingfactorandp38[J].ArchSurg,1999,134(12):1348-53.[84]NoubadeR,KrementsovDN,DelRioR,etal.Activationofp38MAPKinCD4TcellscontrolsIL-17productionandautoimmuneencephalomyelitis[J].Blood,2011,118(12):3290-300.[85]NamikiK,MatsunagaH,YoshiokaK,etal.Mechanismforp38alpha-mediatedexperimentalautoimmuneencephalomyelitis[J].JBiolChem,2012,287(29):24228-38.[86]DangRJ,YangYM,ZhangL,etal.A20playsacriticalroleintheimmunoregulatoryfunctionofmesenchymalstemcells[J].JCellMolMed,2016,20(8):1550-60.86 重庆医科大学博士研究生学位论文文献综述A20在自身免疫性疾病中作用的研究进展摘要：A20是在经TNF-α处理后的脐静脉内皮细胞反应中检测到的一个诱导性表达蛋白，因此也被称为TNF-α诱导蛋白3（TNF-α-inducedprotein3,TNFAIP3）。A20表达于多个免疫器官，包括胸腺、脾脏和肠相关免疫组织等。A20蛋白的氨基端具有卵巢肿瘤基序，具有去泛素化酶功能，第一个被发现对天然免疫具有调节作用的去泛素化酶就是A20。最近的研究结果发现，A20在自身免疫性疾病的发病机制中至关重要，如1型糖尿病、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、强直性关节炎和类风湿性关节炎等自身免疫性疾病。在这篇综述中，我们主要讨论A20在自身免疫性疾病发病机制中的作用。关键词：A20，自身免疫反应，固有免疫A20是在经TNF-α处理后的脐静脉内皮细胞反应中检测到的一个诱导性表达蛋白，因此也被称为TNF-α诱导蛋白3（TNF-α-inducedprotein3,TNFAIP3）。自从1990年美国病理学家Dixit等发现A20以来，A20逐渐被深入研究，目前已经证实A20在1型糖尿病、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、强直性关节炎和类风湿性关节炎等疾病中均有表达，参与了许多重要的生理或病理过程。1A20的结构人A20基因位于6号染色体长臂2区3带第3亚带，其存在于体内多种细胞内，编码790氨基酸，相对分子质量为90kDa大小的蛋白，它是属于抗原性较强的亲水性蛋白质[1]。A20是一种新型的锌指蛋白，这种新型则是指其具有11个氨基酸残基组成的环指结构[2]。A20蛋白含有两个功能结构域:氨基（N）末端区（1～385）和羧基（C）末端区（386～775）。N端含有卵巢肿瘤结构域（ovariantumordomain，OTU），这是A20的特征性结构区,正是这个结构域使得A20具有去泛素化酶的活性[3]；C末端区则是锌指区域，有7个特征性重复的Cys-Cys锌指结构，分别是6个Cys-X4-Cys-X11-Cys-X2-Cys模序和1个Cys-X2-Cys-X11-Cys-X2-Cys87 重庆医科大学博士研究生学位论文模序。2NF-κB信号通路概述NF-κB广泛表达于几乎所有类型的细胞，同时，它又能被各种各样的刺激所激活，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、细菌及各种各样的压力等[4]。NF-κB家族包括五个DNA结合的成员：P50、P52、P65、P105。这些DNA结合复合物可以激活不同的转录基因组[5]。根据细胞外刺激和受体的不同，NF-κB的激活机制可以划分为两类：经典和非经典途径。经典的NF-κB激活通路依赖于包含两个催化亚基IKKα和IKKβ的IKK复合体以及一个调节亚基NEMO/IKKγ[6]。活化往往是瞬间的，体内存在多种机制下调NF-κB信号通路。3A20调控NF-κB信号通路的机制去泛素化酶A20具有负向调控NF-κB信号通路的功能。在大多数的细胞中，A20通过抑制经典的NF-κB激活通路发挥作用[7]。A20的缺失或降低则会导致NF-κB过度激活，目前普遍认为，过度激活的NF-κB信号会导致包括癌症在内的各种自身免疫性和炎症性疾病的发展。大量的文献表明，A20的缺失导致NF-κB的过度活化，A20的缺陷与各种自身免疫性疾病和炎症性疾病的病理生理学有联系。3.1TNF信号通路受体相互作用蛋白1（receptorinteractingprotein1，RIP1）和E3泛素连接酶肿瘤坏死因子受体相关因子（TNFreceptor-associatedfactor2，TRAF2）：cIAP1和cIAP2是K63泛素化中最关键的步骤。在这个过程中，会募集转化生长因子活化激酶1（TGFbetaactivatedproteinkinase1，TAK1）复合体和IKK复合体，活化IKKβ，最后导致IκBα的蛋白降解，进而使NF-κB发生核转位，影响NF-κB的活化，形成一个负反馈调节通路。A20能够通过影响RIP1和TRAF2这两条不同的通路控制TNF-α介导的NF-κB的活化。A20能够通过OTU域去泛素化K63相关的泛素链，并且还可以通过ZnF4域移除K48多聚泛素化链，从而挽救靶蛋白不被降解[8]。A20的泛素化编辑功能已经被认为是仅对TNF诱导的NF-κB活化所独有的功能。ZnF488 重庆医科大学博士研究生学位论文域最近的研究也发现其在A20的募集使其泛素化RIP1中起作用[9]。3.2TLR4/IL-1R信号通路Toll样受体4（Toll-likereceptor4，TLR4）和白介素-1受体（IL-1receptor，IL-1R）能够导致MyD88的募集，并磷酸化IRAK，随后活化Ｅ3泛素连接酶TRAF6。而A20能够通过E2结合酶抑制TRAF6[10]，这是防止TRAF6自动泛素化途径中的关键一步。在巨噬细胞中，TLR4诱导的自噬作用是Beclin-1的K63泛素化所必需的，A20正是通过减少K63泛素化来制约TLR4的自噬作用[11]。A20也调节选择性自噬，对TLR信号通路进行调节。3.3NOD2信号通路NOD2，细胞内模识别受体，能够识别细菌细胞壁的胞壁酰二肽（MDP），在克罗恩病的病理生理学中起到重要的作用。A20缺陷的BMDM细胞会对MDP刺激产生过度的反应，使RIP2泛素化增加，NF-κB持续活化[12]。有研究表明，在活体的造血细胞中，A20能够抑制NOD2刺激下IL-6的产生[12]。因此，A20能够抑制体外和体内NOD2诱导的信号通路。3.4T细胞和B细胞信号在T淋巴细胞中，NF-κB的激活是通过触发T细胞受体（T-cellreceptor，TCR）信号而发生的。TCR刺激导致蛋白激酶C的激活，从而促进CARMA1、Bcl10和MALT1的集合[13]。MALT1泛素化的形成会激活NF-κB，A20则通过去除MALT1的K63聚泛素链来抑制TCR[14]。在B淋巴细胞，受刺激的B淋巴细胞受体（B-cellreceptor，BCR）通过募集CARMA1、BCL10和MALT1来激活PKCβ。在B细胞中，BCR、CD40和TLRs激活会导致A20对NF-κB进行负向调控[15]。3.5IL-17信号最近研究发现，促炎细胞因子IL-17参与A20抑制NF-κB信号通路的作用。Grag等人证实，A20是IL-17通路中的一个反馈抑制剂[16]，其中A20的C末端区即锌指区域和N端的卵巢肿瘤结构域都会发挥作用。IL-17会导致A20mRNA和89 重庆医科大学博士研究生学位论文蛋白水平增加。A20能够与IL-17受体的二聚体结合，发挥抑制IL-17的作用。然而，A20与IL-17的关系现在还不是完全清楚，比较明确的是AnapC5将A20与IL-17受体联系在了一起[17]。因此，AnapC5能够在IL-17信号通路中调控A20的功能。4A20与临床疾病的关系在过去的许多年中，通过对大样本患者的GWASs研究中发现A20是炎症和自身免疫性病变的易感基因。这些疾病包括类风湿关节炎、幼年特发性关节炎、系统性红斑狼疮、炎症性肠病、银屑病、I型糖尿病、干燥综合征、冠状动脉疾病、风湿性心脏病和系统性硬化症等[18]。大多数单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）位于A20基因编码区的上、下游或内含子区域，这就表明它们通过干扰核心部位来影响A20的表达。4.1A20与系统性红斑狼疮系统性红斑狼疮（SystemicLupusErythematosus，SLE）是一种自身免疫性炎症性结缔组织病，好发于青年女性，病变累及范围广。本病病因至今尚未明确，大量研究显示免疫异常、感染和一些环境因素与本病的发病有关。Muson等[19]人的研究发现，在A20中有三个独立的单核苷酸多态性（rs13192841，rs2230926和rs6922466）与SLE有关，其中包括一个编码区和两个非编码区。SLE相关的TT>A多态核苷酸导致NF-κB结合降低从而影响A20mRNA的表达[20]。在临床中的研究中发现，SLE患者外周血中A20的表达与健康对照组相比明显降低，A20的表达水平与SLE疾病活动指数（R=-0.4661，P=0.0036）和红细胞沉降率（R=-0.5222，P=0.0009）呈负相关，此外，SLE伴有肾炎的患者外周血中A20的表达水平较不伴有肾炎的患者明显降低[21]。4.2A20与肿瘤在遗传方面的研究发现包括MALT淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、活化的B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤在内的B细胞淋巴瘤A20基因突变和缺失，这些基因的变异与NF-κB通路活化相关[22-25]。在其他类型的细胞如胶质瘤细胞，研究也发现A20在组织胶质瘤中高表达，A20的缺失会导致胶质瘤干细胞存活，肿瘤迅速生长[26]。90 重庆医科大学博士研究生学位论文A20在乳腺癌中也出现高表达，这些证据都表明A20可能为乳腺癌等肿瘤提供了新的治疗靶点[27]。Vaziri等[28]人通过对肾透明细胞癌CAKI-1细胞株和结直肠癌HCT-116细胞株的研究发现，在缺氧的环境中，两种细胞株的血管内皮生长因子VEGF和A20的表达明显增高。在细胞培养基中加入索拉菲尼48h后，包括A20在内的上述两种蛋白的表达水平明显抑制。A20失活的发生率在不同的作者报道的结果有所不同，不同的淋巴瘤中差别也非常的大。在经典型HL中，A20发生异常可以达到44%，而在其他的一些淋巴瘤中则只有个别的病例出现A20发生异常。以上的研究表明不同的细胞类型和肿瘤分期，A20既可能作为一个抑癌基因，也可以作为促癌基因。4.3A20与肠道疾病为了研究A20在肠道内环境稳定、炎症和炎症性肠病的发病机制，有研究者敲除小鼠肠道上皮细胞（IntestinalEpithelialCells，IECs）的A20，这种A20IEC-KO小鼠对右旋糖酐硫酸酯钠诱导的结肠炎的敏感性增加。这些小鼠不能从右旋糖酐硫酸酯钠诱导的炎症中恢复，而且对凋亡和TNF诱导的炎症反应更加敏感，进行病理学检查发现结肠缩短、隐窝消失和免疫细胞浸润等[29]。Arsenescu等[30]人的研究发现，A20的表达与克罗恩病呈负相关，A20过表达能够促进肠道上皮细胞的更新与存活。亦有研究发现[31]，肠道上皮细胞中过表达A20能够使肠上皮细胞间的紧密连接加强，从而使肠黏膜屏障更加完整，因此，对右旋糖酐硫酸酯钠诱发的结肠炎起到保护的作用。A20在胃肠黏膜屏障和胃肠黏膜免疫中起着重要的作用，A20的缺失能够造成胃肠黏膜破坏、胃肠免疫功能紊乱以及胃肠道菌群失调等严重反应[32]。4.4A20与类风湿性关节炎GWAS研究已经发现A20是类风湿性关节炎的易感基因[33;34]。在类风湿关节炎膝关节滑膜样本中，能够发现rs6920220、rs6933404、rs6927172这3种基因多态性，它们降低了A20的活性[35]。lsby[35]等人研究发现，A20在类风湿关节炎患者的滑膜细胞、淋巴细胞、成纤维细胞和肌细胞中表达呈阳性。为了确定A20在类风湿性关节炎发生发展中的作用，研究者敲除小鼠所有髓系来源细胞的A20，91 重庆医科大学博士研究生学位论文这些A20myel-KO小鼠出现自发性关节炎，并且与人类类风湿性关节炎的特征相似，比如II型胶原抗体和血清炎性细胞因子的存在[36]。髓系A20的缺失也会促进破骨细胞前体细胞的扩展和增强破骨细胞的分化，这表明A20也可以直接控制NF-κB的反应。对比A20与类风湿性关节炎的易感性，A20myel-KO小鼠能够通过增加细胞因子和趋化因子的产生免受致死急性A型流感病毒的感染。4.5A20与银屑病A20的基因多态性已在银屑病患者中证实[37]。在动物实验中也发现A20的缺失与银屑病的病理过程密切相关，这些老鼠不会出现自发的皮肤炎症。相反，A20E-KO小鼠出现角质细胞的过度增殖，并形成外胚层器官的异常，如毛发蓬乱头，趾甲增长以及皮脂腺细胞的增生[38]。相比野生型小鼠而言，A20缺失的小鼠会引起严重的皮肤炎症，进一步研究发现，A20缺失的小鼠炎性细胞因子IL-17和IL-23表达水平明显上调。银屑病患者的皮肤活检显示A20基因mRNA的表达水平明显低于正常对照组[39]。除了以上疾病，还有许多临床中的疾病与A20密切相关，如I型糖尿病[40]、干燥综合征[41]、冠状动脉疾病[42]、创伤[43]和多发性硬化[44]等。A20目前已经被广泛认为是调节炎症和免疫的关键因素。人类遗传学研究与小鼠实验研究均表明A20与疾病的易感性和治疗的有效性紧密相关。因此，A20可以作为一个预测和预后的标志。此外，A20也可能是治疗炎症和自身免疫性疾病的一条新途径。参考文献[1]MoorePB,SteitzTA.TheinvolvementofRNAinribosomefunction[J].Nature,2002,418(6894):229-35.[2]OpipariAW,Jr.,BoguskiMS,DixitVM.TheA20cDNAinducedbytumornecrosisfactoralphaencodesanoveltypeofzincfingerprotein[J].JBiolChem,1990,265(25):14705-8.[3]LeeEG,BooneDL,ChaiS,etal.FailuretoregulateTNF-inducedNF-kappaBandcelldeathresponsesinA20-deficientmice[J].Science,2000,289(5488):2350-4.92 重庆医科大学博士研究生学位论文[4]TakeuchiO,AkiraS.Patternrecognitionreceptorsandinflammation[J].Cell,2010,140(6):805-20.[5]HaydenMS,GhoshS.SharedprinciplesinNF-kappaBsignaling[J].Cell,2008,132(3):344-62.[6]IsraelA.TheIKKcomplex,acentralregulatorofNF-kappaBactivation[J].ColdSpringHarbPerspectBiol,2010,2(3):a000158.[7]SunSC.Deubiquitylationandregulationoftheimmuneresponse[J].NatRevImmunol,2008,8(7):501-11.[8]WertzIE,O'rourkeKM,ZhouH,etal.De-ubiquitinationandubiquitinligasedomainsofA20downregulateNF-kappaBsignalling[J].Nature,2004,430(7000):694-9.[9]LuTT,OnizawaM,HammerGE,etal.DimerizationandubiquitinmediatedrecruitmentofA20,acomplexdeubiquitinatingenzyme[J].Immunity,2013,38(5):896-905.[10]ShembadeN,MaA,HarhajEW.InhibitionofNF-kappaBsignalingbyA20throughdisruptionofubiquitinenzymecomplexes[J].Science,2010,327(5969):1135-9.[11]ShiCS,KehrlJH.Traf6andA20differentiallyregulateTLR4-inducedautophagybyaffectingtheubiquitinationofBeclin1[J].Autophagy,2010,6(7):986-7.[12]HitotsumatsuO,AhmadRC,TavaresR,etal.Theubiquitin-editingenzymeA20restrictsnucleotide-bindingoligomerizationdomaincontaining2-triggeredsignals[J].Immunity,2008,28(3):381-90.[13]CoornaertB,BaensM,HeyninckK,etal.TcellantigenreceptorstimulationinducesMALT1paracaspase-mediatedcleavageoftheNF-kappaBinhibitorA20[J].NatImmunol,2008,9(3):263-71.[14]DuwelM,WeltekeV,OeckinghausA,etal.A20negativelyregulatesTcellreceptorsignalingtoNF-kappaBbycleavingMalt1ubiquitinchains[J].JImmunol,2009,182(12):7718-28.[15]ChuY,VahlJC,KumarD,etal.Bcellslackingthetumorsuppressor93 重庆医科大学博士研究生学位论文TNFAIP3/A20displayimpaireddifferentiationandhyperactivationandcauseinflammationandautoimmunityinagedmice[J].Blood,2011,117(7):2227-36.[16]GargAV,AhmedM,VallejoAN,etal.ThedeubiquitinaseA20mediatesfeedbackinhibitionofinterleukin-17receptorsignaling[J].SciSignal,2013,6(278):ra44.[17]HoAW,GargAV,MoninL,etal.Theanaphase-promotingcomplexprotein5(AnapC5)associateswithA20andinhibitsIL-17-mediatedsignaltransduction[J].PLoSOne,2013,8(7):e70168.[18]MaA,MalynnBA.A20:linkingacomplexregulatorofubiquitylationtoimmunityandhumandisease[J].NatRevImmunol,2012,12(11):774-85.[19]MusoneSL,TaylorKE,LuTT,etal.MultiplepolymorphismsintheTNFAIP3regionareindependentlyassociatedwithsystemiclupuserythematosus[J].NatGenet,2008,40(9):1062-4.[20]AdriantoI,WenF,TempletonA,etal.AssociationofafunctionalvariantdownstreamofTNFAIP3withsystemiclupuserythematosus[J].NatGenet,2011,43(3):253-8.[21]LiD,WangL,FanY,etal.Down-regulationofA20mRNAexpressioninperipheralbloodmononuclearcellsfrompatientswithsystemiclupuserythematosus[J].JClinImmunol,2012,32(6):1287-91.[22]NovakU,RinaldiA,KweeI,etal.TheNF-{kappa}BnegativeregulatorTNFAIP3(A20)isinactivatedbysomaticmutationsandgenomicdeletionsinmarginalzonelymphomas[J].Blood,2009,113(20):4918-21.[23]KatoM,SanadaM,KatoI,etal.FrequentinactivationofA20inB-celllymphomas[J].Nature,2009,459(7247):712-6.[24]SchmitzR,HansmannML,BohleV,etal.TNFAIP3(A20)isatumorsuppressorgeneinHodgkinlymphomaandprimarymediastinalBcelllymphoma[J].JExpMed,2009,206(5):981-9.[25]CompagnoM,LimWK,GrunnA,etal.MutationsofmultiplegenescausederegulationofNF-kappaBindiffuselargeB-celllymphoma[J].Nature,2009,459(7247):717-21.94 重庆医科大学博士研究生学位论文[26]HjelmelandAB,WuQ,WickmanS,etal.TargetingA20decreasesgliomastemcellsurvivalandtumorgrowth[J].PLoSBiol,2010,8(2):e1000319.[27]VendrellJA,GhayadS,Ben-LarbiS,etal.A20/TNFAIP3,anewestrogen-regulatedgenethatconferstamoxifenresistanceinbreastcancercells[J].Oncogene,2007,26(32):4656-67.[28]VaziriSA,AlhazzouriA,GrabowskiDR,etal.Sorafenibtreatmentofclear-cellrenalcellcarcinoma(CCRCC)andcolorectalcarcinoma(CRC)cells:Differentialeffectsongeneexpressionandcelldeathpathways[J].JournalofClinicalOncology,2007.[29]VereeckeL,SzeM,McGuireC,etal.Enterocyte-specificA20deficiencysensitizestotumornecrosisfactor-inducedtoxicityandexperimentalcolitis[J].JExpMed,2010,207(7):1513-23.[30]ArsenescuR,BrunoME,RogierEW,etal.SignaturebiomarkersinCrohn'sdisease:towardamolecularclassification[J].MucosalImmunol,2008,1(5):399-411.[31]KolodziejLE,LodolceJP,ChangJE,etal.TNFAIP3maintainsintestinalbarrierfunctionandsupportsepithelialcelltightjunctions[J].PLoSOne,2011,6(10):e26352.[32]Rakoff-NahoumS,MedzhitovR.Roleoftheinnateimmunesystemandhost-commensalmutualism[J].CurrTopMicrobiolImmunol,2006,308:1-18.[33]PlengeRM,CotsapasC,DaviesL,etal.Twoindependentallelesat6q23associatedwithriskofrheumatoidarthritis[J].NatGenet,2007,39(12):1477-82.[34]FodilM,BenzaouiA,Zemani-FodilF,etal.AssociationofPTPN22(rs2476601)andSTAT4(rs7574865)polymorphismswithRheumatoidArthritisintheWesternAlgerianpopulation[J].ActaReumatolPort,2015,40(1):56-62.[35]ElsbyLM,OrozcoG,DentonJ,etal.FunctionalevaluationofTNFAIP3(A20)inrheumatoidarthritis[J].ClinExpRheumatol,2010,28(5):708-14.[36]MatmatiM,JacquesP,MaelfaitJ,etal.A20(TNFAIP3)deficiencyinmyeloidcellstriggerserosivepolyarthritisresemblingrheumatoidarthritis[J].NatGenet,95 重庆医科大学博士研究生学位论文2011,43(9):908-12.[37]NairRP,DuffinKC,HelmsC,etal.Genome-widescanrevealsassociationofpsoriasiswithIL-23andNF-kappaBpathways[J].NatGenet,2009,41(2):199-204.[38]LippensS,LefebvreS,GilbertB,etal.Keratinocyte-specificablationoftheNF-kappaBregulatoryproteinA20(TNFAIP3)revealsaroleinthecontrolofepidermalhomeostasis[J].CellDeathDiffer,2011,18(12):1845-53.[39]AkiA,NagasakiM,MalynnBA,etal.HypomorphicA20expressionconferssusceptibilitytopsoriasis[J].PLoSOne,2017,12(6):e0180481.[40]FukayaM,BrorssonCA,MeyerovichK,etal.A20Inhibitsbeta-CellApoptosisbyMultipleMechanismsandPredictsResidualbeta-CellFunctioninType1Diabetes[J].MolEndocrinol,2016,30(1):48-61.[41]JohnsenSJ,GudlaugssonE,SkalandI,etal.LowProteinA20inMinorSalivaryGlandsisAssociatedwithLymphomainPrimarySjogren'sSyndrome[J].ScandJImmunol,2016,83(3):181-7.[42]ZhouZH,PengJ,MengZY,etal.NovelA20-gene-elutingstentinhibitscarotidarteryrestenosisinaporcinemodel[J].DrugDesDevelTher,2016,10:2341-51.[43]LiuB,JiangD,OuY,etal.Ananti-inflammatoryroleofA20zincfingerproteinduringtraumacombinedwithendotoxinchallenge[J].JSurgRes,2013,185(2):717-25.[44]PergaS,MartireS,MontaroloF,etal.A20inMultipleSclerosisandParkinson'sDisease:CluetoaCommonDysregulationofAnti-InflammatoryPathways?[J].NeurotoxRes,2017,32(1):1-7.96 重庆医科大学博士研究生学位论文致谢在此我要深深的感谢导师杨培增教授，感谢导师在我博士研究生期间的耐心指导和无微不至的关怀。杨老师严谨的科学态度、精湛的医术、精益求精的工作作风无一不让我受益匪浅。杨老师不但是对我，对他的每一个学生都是关怀备至、谆谆教导。在工作中，杨老师高尚的医德医风、勤恳的敬业精神，为每一位患者解除病痛。杨老师这种高尚的人格魅力时时刻刻影响着我，杨老师的的谆谆教诲我铭记在心，并以杨老师为学习榜样，兢兢业业，不断学习。感谢重庆医科大学眼科学实验室李鸿老师、侯胜平老师、苏冠男老师、于红松老师、袁刚祥老师及曹庆丰老师为我的研究工作付出的宝贵时间和精力。感谢王朝奎、邓柏林、叶子、黄阳、邱一果、丁琳、张迪珂、朱云云、唐吉宏、谭涵丹、彭稚喜、AizeKijlstra、苏文成、常瑞、邓静、张东磊等同学给予我的鼓励和帮助。感谢重庆医科大学附属第一医院眼科周春江、王瑶、郭文娟等老师在学习和生活中给予我的鼓励和帮助！最后特别感谢我的家人。感谢他们一直以来对我无私的帮助和无微不至的关心。97 重庆医科大学博士研究生学位论文攻读博士期间发表文章[1]DengB,YeZ,LiL,ZhangD,ZhuY,HeY,WangC,WuL,KijlstraA,YangP.HigherexpressionofNOD1andNOD2isassociatedwithVogt-Koyanagi-Harada(VKH)syndromebutnotBehcet’sdisease.(currentmolecularmedicine,IF:3.63)[2]YueHe,ChaokuiWang,GuannanSu,BolinDeng,ZiYe,YangHuang,GangxiangYuan,AizeKijlstra,HongLi,andPeizengYang.DecreasedexpressionofA20isassociatedwithocularBehcet’sdisease(BD),butnotwithVogt-Koyanagi-Haradadisease(VKH).(BritishJournalofOphthalmology,IF:3.806)98