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ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine（临床医学院）二○一八届博士研究生学位论文养阴益气活血法减少糖尿病GK大鼠血糖波动的机制探索TheMechanismsExplorationofNourishingYinBenefitingQiandTransformingStasisMethodonReducingGlucoseFluctuation研究生姓名：晁俊指导教师：谢春光教授学科专业：中医内科学二○一八年五月1 学位论文养阴益气活血法减少糖尿病GK大鼠血糖波动的机制探索晁俊指导教师姓名：谢春光教授申请学位级别：博士研究生专业名称：中医内科学论文提交时间：2018年5月论文答辩时间：2018年5月二○一八年五月 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文中文摘要目的：基于“脾胰同源”理论，应用基因芯片技术探索养阴益气活血法减少糖尿病GK大鼠血糖波动的分子机制。方法：60只GK大鼠适应性喂养4周后，将随机血糖值高于11.1mmol/L的50只5月龄SPF级雄性2型糖尿病GK大鼠纳入本实验，随机分为5组：模型组、参芪复方组高、中、低剂量组（以下分别简称参高组、参中组、参低组），西药组，适应性喂养4周后，每日给予高脂饲料，连续8周，建立糖尿病大血管病变模型。另设10只5月龄雄性Wistar大鼠，为空白组，每日给予普通饲料。一共6组。造模同时给予药物干预治疗。进入正式实验后，连续给药8周，参高组、参中组、参低组分别给予高、中、低剂量参芪复方浸膏灌胃，西药组给予西格列汀混悬液灌胃，空白组、模型组给予生理盐水灌服。药物干预期间观察大鼠一般状态，并根据体重变化及时调整灌胃量，每周一次测一日内8:00，10:00，14:00，16:00，18:005个时间点的血糖情况，并用每日血糖平均水平（MBG）、每日平均血糖的标准差（SDBG）、最大血糖波动幅度（LAGE，日内血糖最高值与最低值之差）衡量各组大鼠的血糖波动情况。统计4周、8周后各组大鼠MBG、SDBG、LABG值；实验第8周处死，采集血液标本，采用7710型全自动生化分析仪检测胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)；采用放免法和ELISA法测定血清胰岛素（Insulin）、胰高血糖素（Glucagon）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）；双抗体夹心ELISA法测定血C反应蛋白（CRP）水平；HE染色，光镜观察各组动物腹主动脉、胰腺组织病理形态学；选取效果最佳的参芪复方组、模型组、空白组、西药组，每组分别采集3只大鼠胰腺50-100mg，抽提RNA，采用Agilent4*44k全基因组表达谱芯片对全部样本的RNA进行差异基因检测，将差异基因进行GO、Pathway富集，并对关键差异基因Id2、Usp2、Pik3r1、Ddit4进行PCR验证。结果：药物干预后，各组大鼠的精神状态和毛色均较模型组为佳。GK大鼠饮水量偏多。实验第4周，参高组、西药组的饮水量低于模型组，实验第8周，参中组的摄食量低于模型组，模型组大鼠的饮水量均高于其余各组；参高组、参中组、西药组的TC均低于模型组；参芪复方各剂量组及西药组均能降低TG水平，与西药组相比，参低组的TG高于西药组；与模型组相比，西药组的INS高于模型组，西药组、参高组的GC低于模型组，西药组的GC低于其余各组；与模型组1 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文相比，各组大鼠（除参低组外）的CRP均低于模型组；与模型组相比，各组的CLP-1均高于模型组，而参高组、参低组的GLP-1低于西药组；血糖波动情况：实验第4周，各组GK大鼠的MBG、SDBG、LAGE均高于正常Wistar大鼠，与模型组相比，参高组的MBG低于模型组，参高组、参中组、西药组的SDBG低于模型组，参芪复方各剂量组、西药组的LAGE均低于模型组；实验第8周，与模型组相比，其余各组的MBG、SDBG、LAGE均低于模型组（除参低组的SDBG外），与西药组相比，参芪复方各剂量组的SDBG、LAGE均高于西药组；病理形态学结果：参高组、参中组、西药组在改善腹主动脉病理形态方面效果较为明显，参中组、参高组在改善胰腺组织病理形态方面较为显著，西药组、参低组次之。基因芯片检测结果：差异基因筛选：模型组VS正常组以共有差异基因349条，其中表达上调的有128条，表达下调的有211条。参中组VS模型组共有差异基因77条，其中表达上调的有54条，表达下调的有23条。西药组VS模型组共有差异基因95条，其中表达上调的有46条，表达下调的有49条。对差异基因进行GO分析，模型组VS空白组的差异基因，涉及的生物学过程可概括为代谢过程、昼夜节律、细胞增殖、细胞分泌、白细胞细胞黏附、细胞迁移、对光刺激的反应等。参中组VS模型组的差异基因，涉及的生物学过程有昼夜节律、细胞增殖、细胞迁移、细胞黏附、负调控肿瘤坏死因子介导的信号通路、细胞对刺激的反应、伤口愈合、TOR信号的负调控、调节磷脂酰肌醇3-激酶活性、凋亡信号通路等。西药组VS模型组差异基因，涉及的生物学过程有昼夜节律、细胞迁移、细胞粘附、细胞增殖、调节伤口愈合、调节炎症反应、稳态过程的调节、胰岛素分泌等生物学过程等。对差异基因的Pathway分析：模型组VS正常组组涉及的主要通路依次为精氨酸和脯氨酸代谢、代谢途径等；参中组VS模型组涉及的主要通路依次为胰腺癌、mTOR信号通路、肾细胞癌、细菌侵入上皮细胞、VEGF信号通路、小细胞肺癌、ErbB信号通路、FcγR介导的吞噬作用、GnRH信号通路、调节肌动蛋白细胞骨架、T细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、局部粘着等；西药组VS模型组差异基因涉及的主要通路为精氨酸和脯氨酸代谢、唾液分泌、GnRH信号通路。结合基因芯片差异基因pathway和GO功能富集分析的结果发现，参中组2 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文VS模型组，其中的关键通路为mTOR信号通路，差异基因为：Pik3r1、Ddit4，均表达上调；参中组VS模型组、西药组VS模型组均涉及的GO条目为昼夜节律，富集的关键基因均有Id2、Usp2，均表现为Id2的表达下调和Usp2的表达上调（P＜0.05）；将关键差异基因Id2、Usp2、Pik3r1、Ddit4进行定量PCR验证，总结得出，在参中组/模型组中，Id2表达为下调趋势，Pik3r1、Usp2、Ddit4均为表达上调趋势。经PCR验证后，表达趋势相符，且有统计学意义。结论：养阴益气活血法可以改善胰岛细胞功能，减少血糖波动，延缓糖尿病GK大鼠大血管病变的发展；养阴益气活血法通过调节基因Pik3r1、Ddit4表达上调，影响mTOR信号通路，推测通过抑制mTOR，激活自噬对胰岛β功能的保护；糖尿病GK大鼠的血糖波动与胰腺组织中昼夜节律的基因表达具有相关性。养阴益气活血法可能通过调控胰腺Id2、Usp2基因的表达，发挥其稳定血糖波动的作用。模型组/空白组、参芪复方组/模型组、西格列汀组/模型组的基因芯片结果比较分析，三个比较组筛选出的差异基因分析，参芪复方组/模型组基因表达上调者偏多，并且富集的pathway也较多，体现了参芪复方多靶点、多途径的治疗特点。关键词：养阴益气活血法；血糖波动；基因芯片；mTOR信号通路；生物钟节律；Pik3r1；Ddit4课题来源：国家自然科学基金青年科学基金项目（NO.81503566）3 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文AbstractOBJECTIVE:ToexplorethemolecularmechanismofreducingbloodglucosefluctuationindiabeticGKratsbyusinggenechiptechnologytoexplorethemechanismofnourishingyin,benefitingqiandtransformingstasisbasedonthetheoryof"thehomologyofspleenandpancreas".METHODS:After4weeksofadaptivefeedingof60GKrats,505-month-oldmaleSPFtype2diabeticGKratswitharandomizedglycemicvaluehigherthan11.1mmol/Lwereincludedinthisexperimentandrandomlydividedinto5groups:model,thehigh-,medium-,andlow-dosegroupsofShenqicompoundgroup(thefollowingarereferredtoastheShen-high,Shen-medium,andShen-lowgroupsrespectively)andthewesternmedicinegroupwerefedwithhigh-fatdietfor8weeksafteradaptivefeedingfor4weeks,establishingamodelofdiabeticmacroangiopathy.Tenmale5-month-oldwistarratswereusedasblankgroupsandweregivendailyfeed.Therewere6groups.Atthesametime,themodelwasgivendrugintervention.Afterenteringtheformalexperiment,continuousadministrationfor8weeks,high-,medium-,andlow-doseShenqicompoundextractswereintragastricallyadministratedintheShen-highgroup,Shen-mediumgroup,andShen-lowgrouprespectively,andthewesternmedicinegroupwasgivenintragastricadministrationofsitagliptinsuspension.Theblankgroupandmodelgroupweregivennormalsalineirrigation.Duringthedrugintervention,thegeneralstateoftheratswasobserved,andtheamountofgavagewasadjustedaccordingtothechangeofbodyweight.Thebloodglucosewasmeasuredatthetimeof8:00,10:00,14:00,16:00,and18:00withinonedayofeveryweek.Theconditionandthebloodglucosefluctuationsineachgroupofratsweremeasuredusingthemeandailybloodglucoselevel(MBG),thestandarddeviationofthedailyaveragebloodglucoselevel(SDBG),themaximumbloodglucoselevelfluctuationrange(LAGE,thedifferencebetweenthehighestandlowestdailybloodsugarlevels).TheMBG,SDBG,andLAGEofratsineachgroupwerecountedafter4weeksand8weeks.Eightweekslater,bloodsampleswerecollected,andcholesterol(TC)andtriglyceride(TG)weredetectedusingaModel4 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文7710automaticbiochemicalanalyzer.Seruminsulin,glucagon,GLP-1weremeasuredbyradioimmunoassayandELISA;SerumC-reactiveProtein(CRP)levelsweremeasuredbydouble-antibodysandwichELISA;HEStainingandlightmicroscopywereperformedtoobservethehistopathologicalmorphologyoftheabdominalaortaandpancreasineachgroup.Thebest-selectedShenqicompoundgroup,modelgroup,blankgroup,andwesternmedicinegroupwereselected.Eachgroupreceived3ratswith50-100mgofpancreas.RNAwasextractedanddifferentialgenedetectionwasperformedonallsamplesusingAgilent4*44kgenome-wideexpressionprofilingmicroarray.DifferentialgeneswereenrichedwithGOandPathway,andPCRwasperformedtoverifythekeydifferentialgenesId2,Usp2,Pik3r1,andDdit4.RESULTS:Afterdrugintervention,thementalstateandcoatcolorofeachgroupwerebetterthanthoseofthemodelgroup.GKratsdrinkmorewater.Inthefourthweekofexperiment,thewaterintakeoftheShen-highgroupandthewesternmedicinegroupwaslowerthanthatofthemodelgroup.Intheeighthweekoftheexperiment,thefoodintakeoftheShen-mediumgroupwaslowerthanthatofthemodelgroup,andthedrinkingwaterofeachgroupwaslowerthanthatofthemodelgroup;Comparedwiththemodelgroup,theTCintheShen-high,Shen-medium,andwesternmedicinegroupsallreduced;Each-doseofShenqicompoundgroupandthewesternmedicinegroupcanreducetheTGlevel.Comparedwiththewesternmedicinegroup,theTGoftheShen-lowgroupishigherthanthewestern.-medicinegroup.Comparedwiththemodel-.group,theINSofthewesternmedicinegroupwashigherthanthemodelgroup,theGCofthewesternmedicinegroupandtheShen-highgroupwaslowerthanthemodelgroup,andtheGCofthewesternmedicinegroupwaslowerthantheothergroups;Comparedwiththemodelgroup,theCRPlevelsofeachgroupinrats(exceptfortheShen-lowgroup)werelowerthanthoseinthemodelgroup.Comparedwiththemodelgroup,theCLP-1ineachgroupwashigherthanthatinthemodelgroup,whiletheGLP-1levelsinthehighandlowgroupswerelowerthanthewesternmedicinegroup.Bloodglucosefluctuations:MBG,SDBG,andLAGEofGKratsineachgroupwerehigherthannormalwistarratsinthe4thweek.5 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文Comparedwiththemodel-group,theMBGoftheSengaogroupwaslowerthanthatofthemodelgroup.TheSDBGofthemiddlegroupandwesternmedicinegroupwaslowerthanthatofthemodelgroup,andtheLAGEofeachgroupofShenqicompoundandWesternmedicinegroupwaslowerthanthatofthemodelgroup.Intheeighthweekoftheexperiment,comparedwiththemodelgroup,theMBG,SDBG,andLAGEineachgroupwerelowerthanthoseinthemodelgroup(exceptfortheSDBGofShen-lowgroup).Comparedwiththewesternmedicinegroup,theSDBGandLAGEineachdosegroupofShenqicompoundwerehigherthanthoseinthewesternmedicinegroup;Pathomorphologicalresults:Shen-high,Shen-mediumandwesterngroupweremoreeffectiveinimprovingthepathologicalmorphologyofthemainabdominalartery.Shen-medium,Shen-highgroupweremoresignificantimprovementinthepathologicalmorphologyofthepancreas,followedbythewesternandShen-lowgroup.Genechiptestresults:differentialgenescreening:therewere349commondifferentialgenesinthemodelgroupvsnormalgroup,ofwhich128wereup-regulatedand211weredown-regulated.Therewere77differentialgenesintheShen-mediumvsmodelgroup,ofwhich54wereup-regulatedand23weredown-regulated.Therewere95differentiallyexpressedgenesinthewesterngroupvsmodelgroupofwesternmedicinegroup,ofwhich46wereup-regulatedand49weredown-regulated.GOanalysisofdifferentialgenes.ThedifferentialgenesinthemodelgroupandtheVSblankgroupinvolvebiologicalprocessesthatcanbesummarizedasmetabolicprocesses,circadianrhythms,cellproliferation,cellsecretion,leukocyteadhesion,cellmigration,responsetolightstimuli,etc.ThedifferentialgenesintheShen-mediumvsmodelgroupinvolvedbiologicalprocessesincludingcircadianrhythms,cellproliferation,cellmigration,celladhesion,negativelyregulatedtumornecrosisfactor-mediatedsignalingpathways,cellularresponsetostimulation,woundhealing,andthenegativeregulationofTORsignaling,regulationofphosphatidylinositol3-kinaseactivity,apoptoticsignalingpathways.Westernmedicinevsmodelgroupdifferentialgenesinvolvedinbiologicalprocessessuchascircadian6 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文rhythm,cellmigration,celladhesion,cellproliferation,regulationofwoundhealing,regulationofinflammatoryresponse,regulationofhomeostasis,insulinsecretionandotherbiologicalprocesses.Pathwayanalysisofdifferentialgenes:Themainpathwaysinvolvedinthemodelgroupandthenormalgroupwerearginineandprolinemetabolismandmetabolicpathways.Themainpathwaysinvolvedinthevsmodelgroupwerepancreaticcancer,mTORsignalingpathway,renalcellcarcinoma,bacterialinvasionepithelialcells,VEGFsignalingpathway,smallcelllungcancer,ErbBsignalingpathway,FcγRmediatedphagocytosis,GnRHsignalingpathway,regulatingactincytoskeleton,Tcellreceptorsignalingpathway,leukocytetransendothelialmigration,localadhesion,etc.Westernmedicinevsmodelgroupdifferentialgenesinvolvedinthemainpathwayforarginineandvalinemetabolism,salivarysecretion,GnRHsignalpath.CombinedwithgenechippathwayandGOfunctionalenrichmentofdifferentialgeneanalysisresults,wefoundthatthekeypathwayintheShen-mediumvsmodelgroupwasthemTORsignalingpathway,andthedifferentialgeneswere:Pik3r1andDdit4,bothofwhichwereup-regulated;TheShen-mediumgroupvsthemodelgroupandthewesternmedicinegroupvsmodelgroupallinvolvedtheGOitemswhichwerecircadianrhythms.ThekeygenesforenrichmentwereId2andUsp2,bothshowingdown-regulationofId2expressionandup-regulationofUsp2(P<0.05);thekeydifferencegeneId2,Usp2,Pik3r1,andDdit4wereverifiedbyquantitativePCR.Inconclusion,inthereferenceShen-mediumvsmodelgroup,Id2expressionisdown-regulated,andPik3r1,Usp2,andDdit4areallup-regulated.AfterverifiedbyPCR,theexpressiontrendwasconsistentandstatisticallysignificant.Conclusion:Themethodofnourishingyin,invigoratingqiandtransformingstasiscanimprovethefunctionofisletcells,reducebloodglucosefluctuation,anddelaymacrovasculardiseaseindiabeticGKrats;Themethodofnourishingyin,invigoratingqiandtransformingstasiscanupregulatetheexpressionofgenesPik3r1andDdit4andaffectmTORsignalingpathway.InhibitionofmTOR,activationofautophagyonprotectionofisletβfunction;BloodglucosefluctuationsindiabeticGKratscorrelate7 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文withcircadianrhythmgeneexpressioninpancreatictissue.Themethodofnourishingyin,invigoratingqiandtransformingstasismayplayaroleinstabilizingbloodglucosefluctuationsbyregulatingtheexpressionofId2andUsp2genesinthepancreas.Comparativeanalysisofgenechipresultsbetweenmodelgroup/blankgroup,Shenqicompoundgroup/modelgroup,sitagliptingroup/modelgroup,theup-regulationofgeneexpressionbetweenShenqicompoundgroup/modelgrouparemorethanothergroups,andtheenrichmentofthepathwaysarealsomorethanothergroups,reflectingthemulti-targeted,multi-pathwaytreatmentcharacteristicsofShenqicompound.Keywords:Nourishingyin,invigoratingqiandtransformingstasismethod;Glucosefluctuation;Genechip;mTORsignalingpathway;circadianrhythm;Pik3r1;Ddit48 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文目录中文摘要................................................................................................................1Abstract..................................................................................................................4目录........................................................................................................................9缩略词词表..........................................................................................................11引言......................................................................................................................13实验研究..............................................................................................................151材料.........................................................................................................151.1实验动物.......................................................................................151.2饲养环境及饲料...........................................................................151.3实验用药品...................................................................................151.4主要仪器与及试剂.......................................................................162方法..........................................................................................................182.1分组及造模方法...........................................................................182.2给药方法.......................................................................................182.3标本采集与处理...........................................................................192.4观察指标及检测方法...................................................................192.4.1一般情况...................................................................................192.4.2血糖波动测定情况...................................................................192.4.3血脂检测...................................................................................192.4.4血清胰岛素（Insulin）检测.....................................................192.4.5大鼠胰高血糖素（Glucagon）检测........................................202.4.6大鼠胰高血糖素样肽-1（GLP-1）检测...................................202.4.7大鼠超敏C反应蛋白（hsCRP）检测.....................................212.4.8腹主动脉、胰腺组织病理形态学观察...................................212.4.9大鼠胰腺组织表达谱芯片.......................................................222.4.10实时荧光定量PCR检测.........................................................302.5统计学方法...................................................................................323实验结果...................................................................................................323.1一般情况观察...............................................................................323.2各组大鼠摄食量情况..................................................................333.3各组大鼠饮水量情况..................................................................343.4各组大鼠体重变化情况..............................................................353.5各组大鼠血脂总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的情况.......353.6各组大鼠血清胰岛素（INS）、胰高血糖素（GC）水平比较...373.7各组大鼠C反应蛋白（CRP）水平比较.....................................393.8各组小鼠GLP-1的水平比较........................................................403.9各组大鼠血糖波动情况...............................................................413.10腹主动脉、胰腺组织病理形态学比较.....................................433.11基因芯片结果与分析.................................................................463.12基因芯片检测结果....................................................................483.12.1差异基因统计.........................................................................483.12.2差异基因的GO功能富集分析..............................................489 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文3.12.3差异基因的pathway功能富集分析....................................513.13关键基因Pik3r1、Ddit4、Id2、Usp2实时荧光定量PCR检测结果..................................................................................................................534讨论..........................................................................................................564.1中医对糖尿病及血糖波动的认识...............................................564.2西医对血糖波动的认识...............................................................614.3本实验动物模型的评价...............................................................654.4参芪复方减少血糖波动改善糖尿病大血管病变的配伍思想...714.5养阴益气活血法减少GK大鼠血糖波动的机制探讨.................744.5.1养阴益气活血法发挥作用的宏观指标评价............................744.5.2养阴益气活血法减少血糖波动的微观机制分析....................765创新性及特色..........................................................................................876结论..........................................................................................................887问题与展望..............................................................................................88致谢......................................................................................................................89参考文献..............................................................................................................90综述....................................................................................................................102在读期间公开发表的学术论文........................................................................124独创性声明........................................................................................................125学位论文使用授权书........................................................................................12510 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文缩略词词表英文缩写英文全称中文译名ALXalloxan四氧嘧啶ASAtherosclerosis动脉粥样硬化BPBiologicalprocess生物学过程CCCellularcompent细胞组分CGMcontinuousglucosemonitoring动态血糖监测CVDcardiovasculardisease心血管疾病DMDiabetesmellitus糖尿病FCFoldChange变异倍数GCGlucagon胰高血糖素GIglycemicindex高升糖指数葡萄糖依赖性促胰岛素释放多GIPglucose-dependentinsulinotropicpeptide肽GKratsGoto-KakizakiRatGK大鼠GLP-1glucagon-likepeptide-1胰高血糖素样肽-1GOGeneOntology基因本体GSISglucose-stimulatedinsulinsecretion葡萄糖刺激的胰岛素分泌GVglycaemicvariability血糖变异性HbA1chemoglobinA1c糖化血红蛋白ICAM-1intercellularadhesionmolecule-1细胞间黏附分子-1IL-1βinterleukin-1β白介素-1βIL-6interleukin-6白介素-6IL-8interleukin-8白介素-8INSInsulin胰岛素京.都基.因和基.因组.百科全书.数K.E.G.GKy.oto.Encyclopedia.Of.Genes..andGenomes.据库.LAGEMaximumbloodglucosefluctuations最大血糖波动幅度LFA-3lymphocytefunction-associatedantigen-3淋巴细胞功能相关抗原-311 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文MFMolecularfunction分子功能mTORmammaliantargetofrapamycin哺乳动物雷帕霉素靶蛋白PI3KPhosphoinositide-3-Kinase磷脂酰肌醇3-激酶Pik3r1Phosphoinositide-3-KinaseRegulatory磷酸肌醇-3-激酶调节亚基1Subunit1PPGEPostprandialbloodglucosefluctuations餐后血糖波动幅度RegulatedindevelopmentandDNAdamageREDD1调节DNA发展和损伤反应1response1RNSReactivenitrogenspecies活性氮簇ROSReactiveoxygenspecies活性氧簇SCNsuprachiasmaticnucleus下丘脑的视交叉上核SDBGStandarddeviationofbloodglucoselevels血糖水平的标准差SODsuperoxidedismutase超氧化物歧化酶STZstreptozotocin链脲佐菌素T2DMType2diabetesmellitus2型糖尿病VCAM-1vascularcelladhesionmolecule-1细胞黏附分子-1VECvascularendothelialcells血管内皮细胞VEGF-Avascularendothelialgrowthfactor-A血管内皮生成因子-A12 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文引言糖尿病（diabetesmellitus，DM）已经是全球性健康问题，人类患病数量高达3.82亿，预计2035年该病发病率将增加至5.92亿。根据疾病控制中心的数据，糖尿病发病率目前的趋势表明，在美国到2050年，每三人当中就有一人将被诊[1]断患有糖尿病。绝大多数糖尿病患者（90%-95%）患有2型糖尿病（T2DM），而1型糖尿病患者仅占5％-10％。我国2010年成人糖尿病流行病学调查结果显[2]示，中国成人糖尿病患病率已经高达11.6%。2型糖尿病（Type2diabetesmellitus，T2DM）发病最主要的始动环节是胰岛素相对不足和靶组织对胰岛素敏感性降低，是遗传、环境和行为共同作用的结[3]果，在现代社会当中，糖尿病发病趋势的不断升高，可归因于不健康的饮食习惯，如增加糖、脂肪、加工食品和甜饮料的摄入量，水果和蔬菜的低消耗以及久坐的生活方式、睡眠不足有关。胰岛功能障碍及随着病程的延长进行性减退是T2DM的主要的特征。慢性并发症可累计全身重要器官，严重影响患者的生活质量，其中糖尿病大血管并发症是糖尿病的常见并发症之一，《中国糖尿病防治指南》明确指出：在糖尿病慢性血管并发症当中，糖尿病大血管病变是我国致死率、发病率、危害性最大的并[4]发症之一。主要包括心血管疾病、脑血管疾病以及下肢血管病变，均以动脉粥样硬化（Artherosclerosis，AS）为其发病基础。临床研究发现，降低糖化血红蛋白（HbA1c）而不控制血糖波动（glucosefluctuation）并不能在降低心血管疾病[5]（cardiovasculardisease，CVD）发病率方面显出益处。HbA1c虽然是血糖控制和药物疗效的“金标准”，但只能反映3个月的平均血糖水平，患者每日的血糖水平波动变化则无法在HbA1c当中得到体现。试验和研究证明，波动性高血糖[6]比持续性高血糖对血管的损伤更大，是引起心血管并发症的独立危险因素。因此，在控制血糖水平时，血糖波动正在成为一个重要的潜在参数，在实现HbA1c达标的同时，“精细降糖，平稳达标”的治疗理念是干预糖尿病大血管病变，降低糖尿病患者致残率、致死率的关键问题。随着T2DM病程的延长，胰岛β细胞分泌功能逐渐减退，胰岛素抵抗逐渐加13 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[7]重，导致T2DM患者自身调节血糖机制减弱，是血糖波动显著增大的重要机理。目前，常规西药降糖仍然是临床主要手段，主要以胰岛素皮下注射和口服降糖药为主，但存在低血糖发生率高，伴有胃肠道不适等不良反应。中医药的调节作用异于西药降糖的强制性，有整体调节，恢复机体内环境的特点，既往的研究中发现导师谢春光教授的临床经验方参芪复方具有平稳降糖，减少血糖波动的功效，[8]能改善糖尿病大鼠胰岛素抵抗，抑制胰岛β细胞凋亡，保护胰岛功能，并能减[9]轻其慢性炎症状态，保护血管内皮，有效干预糖尿病大血管病变。因此本实验对参芪复方改善胰岛β细胞功能，减少血糖波动的机理进行深入探索，为中医药临床治疗糖尿病，防治血管并发症提供理论依据。本研究的技术路线如下：14 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文实验研究1材料1.1实验动物购买自发性2型糖尿病GK大鼠60只，均为SPF（specificpathogenfree）级，雄性，5月龄，由中国科学院上海实验动物中心：上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号码：SCXK（沪）2012-0002。Wistar大鼠10只，SPF级，雄性，5月龄，由成都达硕实验动物有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK（川）2015-030。1.2饲养环境及饲料饲养环境：所有实.验GK大鼠和Wistar大鼠均饲养于四川省中医药科学院实验动物中心，SPF动物实验屏障系统动物试验区内，每笼3~5只，每天更换托盘一次，所用笼具、饲料、托盘、饮水均高压灭菌（15磅、20min）。饲养环境温度为22°C~23°C，湿度为55%~60%。每天光照/黑暗时间为12h/12h。有专业的实验人员负责实验期间的灌胃、换水、添加饲料等操作。饲料：实验期间，各组大鼠自由摄食，正常组Wistar大鼠饲喂普通饲料，普通饲料由四川省中医药科学院实验动物中心提供，饲料热量成分：碳水化物71%，脂肪4.5%，蛋白20%。其余各组GK大鼠饲喂高脂饲料，高脂饲料配方为：.普通饲料88.2%，精炼猪油10%，胆固醇1.5%，猪胆盐0.3%，由成都达硕实验动物有限公司制成条状块料，烤干、辐照灭菌，真空包.装备用。饮水：实验期间，实验动物自由摄水，饮用水均为灭菌纯水，由四川省中医药科学院实验动物中心提供。1.3实验用药品参芪复方药物成.分（成人一日剂量）：人参15g，黄芪15g，生地10g，天花粉10g，山茱萸10g，丹参10g，山药10g，制大黄6g；参芪复方浸膏：将人参粉碎成粗粉末，用30%乙醇浸泡24h后，以3ml/min的速度缓缓过滤到无色，收集过滤液，静置24h小时，取上清液，浓缩成稠膏。滤渣与其余七味，加水煎煮两次，合并滤液，与人参浸膏合并浓缩为稠膏，1ml15 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文浸膏含原生药10g。由四川省中医药研究院中医研究所药剂科生产，批号：20161117；磷酸西格列汀片100mg，由默沙东公司生产，国药准字J20140095，在灭菌乳钵中，研成细粉末，加入蒸馏水30ml混匀制备混悬液。1.4主要仪器与及试剂血糖仪：强生稳豪倍易型血糖仪（美国强生公司），注册号：沪食药监械(准)字2014第2400013号；血糖试纸：美国强生公司，批号：国食药监械（进）字2014第2400247号；电子天平：上海海康电子仪器厂生产，型号：YB1201；-80℃超低温冰箱：日本SANYO公司，型号：MDF-U53V，制造编号：12060233；-20℃低温冰箱：中国海尔公司，型号：BCD-236HT；饮水处理器：杭州永洁达净化科技有限公司，型号：MF.-RO-5；HE:苏木素伊红(HE)染色试剂盒（C0105，BeyotimeBiotechnology）石蜡包埋机，LeicaEG1150C分体式石蜡包埋机；全自动石蜡切片机，LeicaRM2235；脱水机：LeicaASP300S；自动染色机：LeicaAutoStainerXL；显微镜：奥林巴斯OlympusBX53，摄像头：DP27；荧光显微镜：LEICADM4000B；微波炉，生产商：.格兰仕微波炉电器有限公司，型号：P70D20P-TF；脱色摇床，生产商：北京六一仪器厂，型号：WD-9405A；Th.ermo.cycler（热循环仪）：MJ公司生产，型号：PTC-100；AgilentMicroarrayScanner（芯片扫描仪）：.美国Agilent.technologiesSantaClara.公司生产，型号：G2565BA；HybridizationChamber（杂交仓）：美国AgilenttechnologiesSantaClara公司生产，型号：G2534A；NanoDropND-1000UV–VISSspectrophotometer（全波长紫/可见光扫描分光光度仪）：Nanodrop公司生产，型号ND1000；.16 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文定量PCR仪：7900HTSequenceDetectionSystem(ABI,USA)大鼠总胆固醇（CHOL）检测试剂盒：上海西唐生物科技有限公司，货号：F15207；大鼠甘油三酯（TRIG）检测试剂盒：上海西唐生物科技有限公司，货号：F11586；大鼠胰岛（Insulin）ELISA试剂盒：上海西唐生物科技有限公司，货号：F15960；大鼠胰高血糖.素（Glucagon）ELISA试剂盒：上海西唐生物科技有限公司，货号：F15624；大鼠胰高血糖素样肽-1（GLP-1）ELISA试剂盒：上海西唐生物科技有限公司，货号：F15623；大鼠超敏C反应蛋白（hsCRP）ELISA.试剂盒：上海西唐生物科技有限公司，货号：F15232；胰岛素抗体：Anti-Insulinantibody[EPR17359](Abcam,ab181547)1:300荧光二抗：LabeledDonkeyAntiRatIgGAntibodies（Invitrogen,A21208）1:500RNeasy.mini.Kit.(250)：德国QIAGEN.GmBH.公司生产，货号.：74106；RNeasymicroKit(50)QIAGENGmBH,Germany74106；RNase-freeDNaseset(50)QIAGENGmBH,Germany79254；LowInputQu.ick.AmpLabelingKit,One-ColorAgilenttechnologiesSantaClara,US5190-2305；RNASpike-InKit,One-ColorAgilenttech.nologiesSantaClara,US5188-5282；GeneExpressionHybridizationKitAgilenttechnologiesSantaClara,US5188-5242；GeneExpressionWashBufferKitAgilenttechnologiesSantaClara,US5188-5327；反转录试剂：ReverTraAceqPCRKit（TOYOBO）；17 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文定量PCR试剂：ABIPowerSYBR.GreenPCRMasterMix(ABI,USA)；引物合成：上海生工生物工程有限公司。2方法2.1分组及造模方法共60只大鼠，进行适应性喂养4周，筛选出两次随机血糖≥11.1mmol/L的50只大鼠纳入本实验，随机分为5组：模型组、参芪复方高、中、低剂量组，西格列汀组，连续给药8周，并每日给予高脂饲料，建立糖尿病大血管病变模型。造模同时给予药物干预。另设10只Wistar大鼠为正常组。给予普通饲料，平行对照。2.2给药方法组别例数饲药给药剂量给药方式给药时间-1-1空白组10生理盐水5ml∙Kg∙d灌胃8周-1-1模型组10生理盐水5ml∙Kg∙d灌胃8周-1-1西药组10西格列汀16mg∙Kg∙d灌胃8周-1-1参高组10参芪复方2.88g∙Kg∙d灌胃8周-1-1参中组10参芪复方1.44g∙Kg∙d灌胃8周-1-1参低组10参芪复方0.72g∙Kg∙d灌胃8周.适.应.性喂养.4周.后.，.造.模.同.时.给予药物干预治疗.，.按.下.表.给.药：.注：-1-1①参高组按2.88g∙Kg∙d（相当于成人剂量的20倍，成人按60kg体重计）灌服中药混悬液。-1-1②参中组按1.44g∙Kg∙d（相当于成人剂量的10倍，成人按60kg体重计）灌服中药混悬液。-1-1③参低组按0.72g∙Kg∙d（相当于成人剂量的5倍，成人按60kg体重计）灌服中药混悬液。-1-1④西药组按16mg∙Kg∙d（相当于成人剂量的10倍，成人按60kg体重计）灌服西格列汀混悬液。⑤每周称量大鼠体质量，并根据体质量变化及时调整灌胃量。18 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文2.3标本采集与处理各组大鼠于第8周末进行处死，处死前禁食不禁水8小时，麻醉剂为10%水合氯醛，根据大鼠体质量，按0.35g/kg标准腹腔注射麻醉。暴露腹主动脉，插入一次性无菌头皮针，每只大鼠采血8~10ml，血液标本每10只为一组，以3500r/min离心15分钟，分离血清，取上清液，放置于-20℃冰箱保存，待测血脂、胰岛素、胰高血糖素、GLP-1、炎症相关指标。采血后迅速剪开胸腹腔，暴露出主动脉，取出1cm左右的腹主动脉投入预先配好的10%福尔马林固定液中，经固定后，石蜡包埋，切片，以备普通光学显微镜观察。取胰腺组织，标记后投入液氮中，后置于-80℃低温保存，用于胰腺组织病理学观察和胰腺组织基因芯片检测。2.4观察指标及检测方法2.4.1一般情况每日对各组大鼠的皮毛色泽、精神状态、饮水、摄食、体重状态等基本情况观察。2.4.2血糖波动测定情况每周严格消毒，取血针针刺采血，用血糖仪测试，每周一次测定一日内8:00，10:00，14:00，16:00，18:00这5个时间点的血糖情况。根据5点血糖值，用平均血糖水平（MBG）、平均血糖的标准差（SDBG）、最大血糖波动幅度（LAGE）表示血糖波动情况。2.4.3血脂检测用ELISA试剂盒检测胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)。2.4.4血清胰岛素（Insulin）检测①测定原理：本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。用抗大鼠Insulin单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的Insulin与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠Insulin，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，Insulin浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中Insulin浓度。19 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文②检测程序：加样：每孔各加入标准品或待测样品5ul。将反应板振荡60秒；每孔加入第一抗体工作液45ul（空白除外），盖紧封板膜以避免交叉污染，将反应板置振荡器（400-500rpm）室温（18-25℃）120分钟；洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟；洗板：同前；每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟；每孔加入100ul终止液混匀；30分钟内用酶标仪450nm处测吸光值。③结果计算与判断：所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算；.以标准品10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线；根据样品OD值计算出相应Insulin含量即可。2.4.5大鼠胰高血糖素（Glucagon）检测①测定原理：本实验采用双抗体夹心ABC-ELISA法。原理同上。②检测程序：加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板置振荡器（400-500rpm）室温120分钟；洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；每孔加入蒸馏水.和第一抗体工作液各50ul（空白除外），将反应板充分混匀后置37℃20分钟；洗板：同前；每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟；洗板：同前；每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟；每孔加入100ul终止液混匀；30分钟内用酶标仪450nm处测吸光值。③结果计算与判断：所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD.低于0.1，也可以直接计算；以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线；根据样品OD值计算出相应Glucagon含量即可。2.4.6大鼠胰高血糖素样肽-1（GLP-1）检测①测定原理：本实验采用双抗体夹心ABC–ELISA法。原理同上。②检测程序：加样：每孔各加入标准品.或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟；洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4–6次，向滤纸上印20 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文干；每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul（空白除外），将反应板充分混匀后置37℃20分钟；洗板：同前；每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟；洗板：同前；每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟；每孔加入100ul终止液混匀；30分钟内用酶标仪450nm处测吸光值。③结果计算与判断：所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算；以标准品10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线；根据样品OD值计算出相应GLP-1含量即可。2.4.7大鼠超敏C反应蛋白（hsCRP）检测①测定原理：本实验采用双抗体夹心ABC–ELISA法。原理同上。②检测程序：加样：每孔.各加入标准品.或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟；洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干；每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50ul（空白除外），将反应板充分混匀后置37℃20分钟；洗板：同前；每孔加酶标抗体工作液100ul，将反应板置37℃10分钟；洗板：同前；每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗处反应15分钟；每孔加入100ul终止液混匀；30分钟内用酶标仪450nm处测吸光值。③结果计算与判断：所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算；以标准品500、250、125、62.5、31.2、15.6、7.8、0ng/ml为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线；根据样品OD值计算出相应hsCRP含量，再乘上稀释倍数即可。2.4.8腹主动脉、胰腺组织病理形态学观察取下动物组织块投入10％福尔马林中，使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解。经固定后，常规.石蜡包埋，4μm切片。脱水透明：切片常规用.二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5分钟→二甲苯（Ⅱ）5分钟→100％乙醇2分钟→95％的乙醇1分钟→80％乙醇1分钟→75％乙醇1分钟→蒸馏水洗2分钟。苏木素染.色5分钟，自来水冲洗。盐酸乙醇分化30秒（提插数下）。自来水浸泡15分钟或温水（约50℃）5分钟。置伊红液2分钟。常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）分钟→95％乙醇（Ⅱ）1分钟→100％乙醇（I）1分钟→100％乙醇（Ⅱ）1分钟→二甲苯石碳酸（3：1）21 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文1分钟→二甲苯（I）1分钟→二甲苯（Ⅱ）1分钟→中性树脂封固。2.4.9大鼠胰腺组织表达谱芯片4个实验组（空白组、模型组、参芪复方中剂量组、西药组），芯片实验每组只检测3只，芯片一共做12个样本。本研究所用的基因芯片由上海伯豪生物技术有限公司提供。基因芯片名称为：Agilent大鼠全基因4*44K芯片（designID：014879）。2.4.9.1基因芯片的原理基因芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸，或者直接将大量预先合成的探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样本杂交，通过对杂交信号的检测分析，得出样品的基因序列及基因表达信息。基因芯片上固定的探针主要包括cDNA、寡核苷酸两种类型，这些探针固化于芯片上形成基因探针的微集阵列，因此，基因芯片又被称为微阵列。根据芯片上探针分子种类的不同，可以分为cDNA芯片和寡核苷酸芯片两大类。基因芯片技术实质是一种大规模集成的固相杂交（反向点杂交），其基本原理是核酸分子杂交，即依据DNA双链碱基互补配对、变性和复性的原理，以大量已知序列的寡核苷酸、cDNA或基因片段作探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性、定量分析得出待测样品的基因信息。基因芯片技术主要包括芯片的制作、样品的准备，分子杂交和检测分析。2.4.9.2样本的抽提与纯化采用TAKARARNAisoPlus#9109并且根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的totalRNA抽提，抽提所得totalRNA经AgilentBioanalyzer2100电泳质检合格后使用RNeasymicrokit和RNase-FreeDNaseSet，纯化t.otalRNA。（1）总RNA的提取采用Invitrogen的TRIzol进行总RNA的提取。具体步骤如下：1、均质化：每50-100mg组织加入1mlTrizol，然后用匀浆器将组织彻底粉碎。2、均质化的样品在15-30℃放置5min，加入0.2倍体积的预冷的氯仿，盖紧盖子后剧烈振摇15s使之充.分混匀，然后在15-30℃放置2~3min，4℃7,000rpm离心15min，离心后形成下层红色的酚氯仿相，中间相和上层无色22 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文水相。3、吸取上层无色水相，转移.至新的离心管（水相的体积约为均质化时所用TRIzol体积的60%），加入0.8倍体积的异丙醇，剧烈摇晃使之充分混合，4℃7,000rpm.离心.15min，弃上清液。4、加入70%酒精，颠倒离心管数次以洗去沉淀所含盐分。用Tip头先将沉淀打散，然后4℃7,000rpm离心10min，弃上清液。5、重复以上步骤1次。6、15-30℃晾干，然后加入适量的RNase-free的水以充分溶解RNA。7、用分光光度计分析RNA浓度，在260nm1OD约等于40ug/ml的RNA。a）需要在260和280nm和测定吸光度来确定样品的浓度和纯度。b）A260/A280应接近2.0为较纯的RNA（比值在1.9-2.1也可）；8、1%琼脂糖电泳或AgilentBioAnalyzer。（2）总RNA的纯化Trizol抽提的RNA，因纯度不高，会影响探针的标记效率和芯片杂交结果，需使用QIAGEN。RNeasy®Kit纯化总RNA。1、取总RNA≤100µg溶解于100µlRNasefree水中，加入350µlBufferRLT并充分混匀。2、加入250µl无水乙醇，Tip头充分混匀。3、将共计700µl含总RNA的溶液转入套在2ml离心管内的RNeasy柱子内，13200rpm离心15sec，弃去滤过液。4、吸取350µl.BufferRW1到RNeasymini柱子内，13200rpm离心15sec，弃去滤过液。5、将10µl的DNaseⅠ加入到70µl的BufferRDD,混匀。6、将80µl的mix加入到柱子内，室温放置15min。7、吸取350µlBufferRW1到RNeasymini柱子内，13200rpm离心15sec，弃去滤过液。8、吸取500µl.BufferRPE到RNeasymini柱子内，13200rpm离心15sec，弃去滤过液。23 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文9、重复步骤8一次。10、换新的套管，13200rpm，2min。并将柱子转入到洗脱管中。11、将RNeasy.mini柱子转入收集管中。12、吸取30µlRNasefree水，静置1min，13200rpm离心1min。13、重新将洗脱管中的30ul样品转回柱子，静置1min，13200rpm离心1min。14、NanoDrop测得RNA浓度和260/280。2.4.9.3样本的质检芯片实验起始样本为totalRNA，totalRNA经NanoDropND-2000分光光度计及AgilentBioanalyzer2100进行质检，经质检RNA样本均合格，进行后续的芯片实验。2.4.9.4样本.RNA.的放大.与标.记实验样品RNA采用Agilent表达谱芯片配套试剂盒，LowInputQuickAmpLabelingKit，One.-Color和标准操作流程对样品totalRNA进行放大和标记，并用RNeasyminikit纯化标记后的cRNA。（一）准备单标的spikein。按照不同的RNA起始量，用DilutionBuffer稀释spike-in。起始RNA稀释情况加样总RNA(ng)mRNA（ng）1st.2nd.3rd.4th.10.1:20.1:25.1:20.1:10.2.25.1:20.1:25.1:20.1:4.2.50.1:20.1:25.1:20.1:2.2.100.1:20.1:25.1:20.2.200.1:20.1:25.1:20.2.51:20.1:25.1:20.2.（二）反转录1、配置如下反应溶液总RNA10-200ng1.5ul稀释好的one-dyespikein2.0ul24 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文T7PromoterPrimer0.8ulNuclease-freewater（whitecap）1.0ul总体积5.3ul2、PCR仪器上65℃保温10分钟，冰浴5分钟。3、同时将5Xfirststrandbuffer在80℃预热3分钟，室温备用。4、配置反转录.mix.5XFirstStrandBuffer2.0ul0.1MDTTv1.0ul10mMdNTPmix0.5ulAffinityScriptRNaseBlockMix1.2ul总体积4.7ul5、将上述4.7µlmix加入变性后的冰浴的RNA中，混匀，离心。6、PCR：40℃反应2小时；70℃灭活15分钟；4℃反应5分钟。（三）荧光标记.1、配置标记mixNuclease-freewater0.75µl5*transcriptionbuffer3.2µl0.1MDTT0.6µlNTPmix1.0µlT7RNAPolymeraseBlend0.21µlCy3-CTP0.24µl总6.0µl2、加入上述6.0µlmix，混匀，离心。3、PCR：40℃反应2小时；4℃反应5分钟。（四）标记产物纯化1、加84ul的Nuclease–freewater，总体积至100ul。2、加350ul的RL，混匀。3、加250ul的无水乙醇，混匀，不要离心。4、将700ul的mix，转到柱子上。13000rpm，4℃离心30sec。丢弃流过液。25 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文5、加500ul的RPE，13000rpm，4℃离心.30sec。丢弃流过液。6、另加500ul的RPE，13000rpm，4℃离心60sec。丢弃流过液。7、换新的套管，13000rpm，4℃空转30.sec。并将柱子转入到洗脱管中。8、加30ul的Nuclease-freewater，静置1min，13000rpm，4℃离心30sec。9、重新将洗脱管中的30ul样品转回柱子，静置1min，13000rpm，4℃离心30sec。10、用NanoDrop测得RNA浓度，Cy3浓度，260/280。11、探针量的要求：1.×芯片cRNA>5ugCy3>6pmol/ug2×芯片cRNA>3.75ugCy3>6pmol/ug4×芯片cRNA>1.65ugCy3>6pmol/ug5×芯片cRNA>0.825ugCy3>6pmol/.ug2.4.9.5芯片杂交按照Agilent表达.谱芯片配套提供的杂交标准流程和配套试剂盒，GeneExpressionHybridizationKit，在滚动杂交炉HybridizationOven.中65℃，10rpm，滚动杂交17小时，杂交cRNA上样量1.65μg，并在.洗缸stainingdishes中洗片，洗片所用的试剂为GeneExpressionWashBufferKit。1、按以下表格配片段化mixComponents1x2x4x8xCy3-cRNA5μg3.75μg1.65μg600ng10XBlockingAgent50μL25μL11μL5μLNuclease-freewaterbringvolumeBringvolumebringbringto240μLto120μLvolumevolumeto52.8μLto24μL25XFragmentation10μL5μL2.2μL1μLBufferTotalVolume250μL125μL55μL25μL2、60℃保温30min。26 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文3、冰浴1min，短暂离心。4、加等体积的2xGExHybridization.BufferHI-RPM，混匀。C.o.mponents1x2x4x8xcRNAfromFragmentationMix250μL125μL55μL25μL2xGExHybridizationBuffer250μL125μL55μL25μLHI-RPM5、13,000rpm，离心1min。6、置于冰上。7、将杂交仓放在水平桌面上，放上带垫圈盖玻片。8、按以下体积加入样品。Components1.x2.x4.x8.xVolumePrepared500μL250μL110μL50μLVolumetoHybridize490μ.L240μ.L10μL40μL9、将芯片上带有“Agilent”面朝下，.盖到盖玻片上。10、迅速组装好杂交仓。11、在杂交炉中，65℃，10rpm，杂交17h。2.4.9.6芯片洗涤和扫描完成杂交的芯片采用AgilentMicroarrayScanner(Cat.#G2565CA,Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)进行扫描，软件设置Dyechannel:Green,Scanresolution=3μm,PMT100%,20bit。用FeatureExtractionsoftware10.7(Agilenttechnologies,SantaClara,CA,US)读取数据，最后采用R软件中limma包进行归一化处理，所用的算法为Quantile。1、洗液1和洗液2加入2ml的10%TritonX-102，洗液2需要37℃预热过夜。2、将已经完成杂交的芯片从杂交炉中取出，拆开杂交仓，按以下步骤洗涤芯片。拆片GEWashBuffer1室温洗1GEWashBuffer1室温1min洗2GEWashBuffer237℃1min3、将洗好的芯片装入片夹中，放入扫描仪进行扫描。27 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文扫描参数如下：规格DyechannelScanregionScanresolutionTiff(μm)1×244K2×105KScanArea(61Green520bit4×44Kx21.6mm)8×15K1×1M2×400KScanArea(61xGreen320bit4×180K21.6mm)8×60K2.4.9.7芯片实验质控情况原.始.数.据.文.件.名样.品.名.称.C.y.3C.V.值.(%)*检.出.率(%)*251487922404_S01_GE1_107_Sep09_1_1PC016.2961254.66002251487922404_S01_GE1_107_Sep09_1_2PC025.2094645.34728251487922404_S01_GE1_107_Sep09_1_3PC035.8665850.07663251487922404_S01_GE1_107_Sep09_1_4PM015.5336545.24267251487922405_S01_GE1_107_Sep09_1_1PZ025.3910343.95329251487922405_S01_GE1_107_Sep09_1_2PY035.4126444.09196251487922405_S01_GE1_107_Sep09_1_3PM044.7620457.4261251487922405_S01_GE1_107_Sep09_1_4PM066.6323640.37222251487922406_S01_GE1_107_Sep09_1_1PZ057.9645450.85269251487922406_S01_GE1_107_Sep09_1_2PZ066.3871346.62207251487922406_S01_GE1_107_Sep09_1_3PY045.6303342.33548251487922406_S01_GE1_107_Sep09_1_4PY056.3916242.93152变异系数(CV值)标准偏差与平均值之比，用百分数表示，计算公式为：CV=SD/Mean×100%。CV值通过两组数据之间的比较分析来判断该体系是否稳定。在Agilent表达谱28 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文芯片实验中，用重复探针点(10次重复)信号的CV值来计算芯片的稳定性和技术的稳定性。根据不同的芯片，这样的探针点从10到100个不等。本项目芯片检出率计算方法：检出点（Flags不包含A的点）总数与全部探针数的比值为该芯片的检出率。结论：测序结果符合标准，可以进行数据分析。2.4.9.8数据分析分析12张基因芯片的数据结果，对原始数据进行归一化处理，对样本之间进行比较分析，筛选出有差异的基因，并对差异基因进行聚类，对差异基因富集的GO、pathway进行分析等。2.4.9.8.1数据信息挖掘应用上海伯豪生物技术有限公司开发的实时在线分析系统SAS（SBCAnalysisSystem）筛选出差异基因、聚类分析、GO富集分析、pathway富集分析等，在基因信息数据库GeneCard，基因本体数据库（GeneOntology，GO）和京都基因和基因组百科全书数据库（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes，KEGG）中进行分析，确定差异基因行使了哪些生物学功能和与哪些信号通路最为相关。分析哪些主要通路和生物学过程与血糖波动具有相关性。2.4.9.8.2芯片.数.据.处理.将芯片数据扫面后进行归一化处理。对每个探针点的Flag值/Call值，表达谱芯片中用A，P，M来表示三种不同的情况：A：该探针的信号与本底不具有显著性差异；P：该探针的信号与本底具有显著性差异；M：该探针的信号与本底的差异介于A和P之间。样本P值越多，说明检出率越高，去掉样本重复中出现3个A以上的数据，保留至少1个P以上的数据结果（含M）。对数据进行t检验以筛选差异基因，以为P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为强显著性差异。以扫描值变异倍数（FoldChange，FC）进行差异基因的上调和下调的判断。FC值表示两样本组织荧光信号强度比值。FC＞2表示基因表达上调，FC值越大说明基因上调越明显；FC＜1表示基因表达下调，FC值越小说明基因下调越明显。2.4.9.8.3数据库平台2.4.9.8.3.1GO数据库基因本体（GeneOntology）是一个在生物信息学领域中广泛使用的本体，29 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文GO注释系统是个有向无环图，包括三个分支：细胞组分（Cellularcompent，CC）、分子功能（Molecularfunction，MF）、生物学过程（Biologicalprocess，BP）。GO通过注释词汇的层次结构使得研究人员能够从不同层面查询和使用基因注释信息，因此，一个基因或蛋白可从三个层面得到注释。细胞组分：是指基因产物位于细胞中的位置（如核糖体、粗面内质网）。分子功能：描述在个体分子生物学上的活性，如催化活性、转运活性或结合活性。生物学过程：是由分子功能有序的组成的，具有多个步骤的一个过程，如细胞周期、细胞凋亡、代谢过程。因本实验和细胞生物学过程密切相关，故GO条目筛选时主要从BP途径上进行筛选。2.4.9.8.3.2KEGG数据库KEGG是由日本京都大学生物信息学中心建立的生物信息学数据库。网址为：http：//www.genome.jp/keg/.KEGG是系统分析基因功能、基因组信息数据库，它有助于研究者把基因及表达信息作为一个整体网络进行研究。基因组信息存储在GENES数据库里，包括完整和部分测序的基因组序列；更高级的功能信息存储在PATHWAY数据库里，包括图解的细胞生化过程如代谢、膜转运、信号传递、细胞周期，还包括同系保守的子通路等信息。KEGG提供的整合代谢途径（pathway），包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代谢及有机物的生物降解，不仅提供了所有可能的代谢途径，而且对催化各步反应的酶进行了全面的注释，包含有氨基酸序列、PDB库的链接等等。通过在搜索引擎中输入基因代码便可得到该基因的通路图，输入信号通路名称即可得到该信号通路的图谱。KEGG是进行生物体内代谢分析、代谢网络研究的强有力工具。将差异基因进行KEGG富集分析，可以把差异显著的pathway进行富集，有助于找到实验条件下显著性差异变化的生物学调控通路。2.4.9.8.3.3SBCAnalysisSystemSAS（SBCAnalysisSystem）系统是上海伯豪生物技术有限公司开发的实时在线分析系统。该系统整个多个公共数据库，可对多个数据库进行交叉查询。利用该系统可对表达谱芯片进行功能注释和统计分析。这些分析包括差异倍数技术、t检验、GO富集分析、pathway富集分析、相关性分析以及聚类分析等。2.4.10实时荧光定量PCR检测用实时荧光定量PCR检测关键差异基因。30 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文（1）实.时.荧.光.定.量.P.C.R.原.理.实时荧光定量PCR的基本原理就是样本核酸扩增呈指数增长，在反应体系和条件完全一致的情况下，样本DNA含量与扩增产物的对数成正比，由于反应体系中的荧光染料或荧光标记物（荧光探针）与扩增产物结合发光，其荧光量与扩增产物量成正比，由此通过荧光量的检测就可以测定样本核酸量。（2）实时荧光定量PCR实验步骤①cDNA第一链合成：a）从-80℃冰箱中去除RNA，在4℃下解冻，然后再0.2mlPCR管中配制反应溶液：ComponentVol(μL)5xRTBuffer4EnzymeMix1PrimerMix1RNAtemplate(0.5μg)+H2O14总volume20b）将PCR管置于37℃孵育15min，98℃变性5min，4℃保温。②SYBRGreenqPCRa）在1.5mL离心管中配置反应混合液（384孔板）：ComponentVol(μL)2×SYBRGreenPCRbuffer5Forwardprimer(10μM)0.5Reverseprimer(10μM)0.5RNATemplate5ngddH2OXul总volume10c）将PCR管子置于PCR仪中进行反应，50℃孵育2min，然后95℃，10min；接着进行40个循环：95℃，15秒；60℃，1min，最后添加溶解曲线。（3）PCR扩增的基因引物序列31 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文引物由甲方采用PrimerExpress3.0.1软件设计，由生工生物工程(上海)股份有限公司公司合成，引物序列及相关信息见下表。序号引物名称引物序列(5'to3')A_43_P11685-FGAGCTTATGTCGAATGACAGCAId2A_43_P11685-RAAAGGAAAAAGTCCCCAAATGCA_44_P227655-FGCTTTCTGAAGCTTTACCAGCTPik3r1A_44_P227655-RACATCCTCGGCCCTGTCTACCTTA_44_P407259-FACGAACCAGCAAGCTCACAAUsp2A_44_P407259-RCAAATTCTCTCAAGTCCAGGTC170373-A_44_P55TCTGACAGCAGCAACAGTGGCTTTDdit46895170373-F-A_44_P55GAGACACCCCATCCAGGTATGA（4）各基因起始浓度计算6895-R基本参数：Ct值：C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数，起始模板量越是大Ct值越是小。每个反应的Ct值的含义是，在该循环数的时候，所有的扩增样品的产物量相等。因为比较的是转录水平的差异，所以通.过检测每个样品的管家基因，将目的基因归一化。PCR产物的增长形式为2n，如果各种试剂和外部所加条件均理想化，N就是循环数。所以先得到ΔCt=Ct待测基因－Ct管家基因，再转-△Ct换为原始模板浓度=2。2.5统计学方法除基因数据以外，所有数据均采用SPSS20.0进行统计分析，计量资料以均_数±标准差（.x±.s.）表示，符合参数检验者，采用单因素方差分析，不符合参数检验者，采用非参数检验方法进行数据分析，结果以P＜0.05为有统计学意义。3实验结果3.1一般情况观察GK大鼠躯干部分浅棕黄色，头部、四肢白色，Wistar大鼠毛色较白且更有光泽。适应性饲养一周，GK大鼠精神状态较好，皮毛光亮，反应敏捷。造模开32 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文始，与正常Wistar对照组相比，GK大鼠饮水量偏多，摄食量偏少，体重偏低。各组GK大鼠，随周龄增长，出现精神萎靡，反应迟缓，动作缓慢的现象。实验过程中有个别大鼠的尾尖部有坏死现象，坏死部位会自动脱落，考虑由于测血糖次数过多引起。模型组大鼠在实验第7周（第44天）死亡一只，死亡解剖后，发现有肝脓肿表现，可能是由于感染引起的肝脓肿导致死亡，参芪复方高剂量大鼠在实验第8周（第52天）死亡一只，可能是由于灌胃时大鼠挣扎过度，药汁误入气管，窒息死亡。3.2各组大鼠摄食量情况_表1各组大鼠摄食量比较（g）（x±s）组别N实验前第4周第8周**正常组1023.3±1.823.0±0.823.0±0.9ΔΔΔΔΔΔ模型组919.4±1.319.1±0.819.6±1.1ΔΔΔΔΔΔ参高组918.4±1.518.6±0.619.0±0.8ΔΔΔΔΔΔ**参中组1019.1±1.718.5±0.518.3±0.5ΔΔΔΔΔΔ参低组1019.2±1.319.0±0.818.9±0.8ΔΔΔΔΔΔ西药组1019.4±1.018.9±0.718.8±0.6注：.与模.型.组.比较，*P.＜.0.0.5，*.*P＜.0..01；与.正.常.组比较.，ΔP＜.0..05.，.ΔΔP＜.0..01；与.西.药.组比较.，P.＜0..0.5.，P.＜.0.01。图1各组大鼠摄食量比较（g）33 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文由表1，图1可.见.，正常组的.摄食.量均高于其余各组大.鼠（P＜0.01），实验第8周后参芪复方中剂量组的摄食量低于模型组（P＜0.01）。3.3各组大鼠饮水量情况_表2各组大鼠饮水量比较（ml/d）（x±s）组别N实验前第4周第8周****正常组1035.6±3.737.2±2.938.2±3.5ΔΔΔΔΔΔ模型组942.4±4.648.8±3.054.1±4.1ΔΔΔΔΔΔ**参高组944.7±4.147.3±4.048.5±3.5ΔΔΔΔ**ΔΔ**参中组1043.5±4.644.1±3.745.6±4.7ΔΔΔΔΔΔ*参低组1042.1±4.946.0±3.949.9±4.2ΔΔΔΔ*ΔΔ**西药组1042.7±4.844.8±3.846.0±3.3注：与.模.型.组.比较.，*P.＜.0..05，**P.＜.0.0.1；与.正常.组.比较，Δ.P.＜0..05，ΔΔ.P.＜0..01；与西.药.组比.较，P.＜.0..05，..P＜.0.01。图2各组大鼠饮水量比较（ml/d）由表2，图2可见.，正常组大鼠的饮水量低于其余各组（.P.＜0.0.1），实验第.4.周，参中组、.西.药组的.饮水.量低于.模型.组，实.验.第8周，模型组的饮水量均高于其余各组，与西药组相比，参低组的饮水量高于西药组。表明，参芪复方中剂量能改善GK大鼠多饮表现。34 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文3.4各组大鼠体重变化情况_表3各组大鼠体重比较（g）（x±s）组别N实验前第4周第8周正常组10341.1±18.5369.1±16.9405.6±21.3ΔΔΔΔΔΔ模型组9308.2±19.0332.8±19.8364.6±15.2ΔΔΔΔΔΔ参高组9305.9±10.8323.8±9.3356.0±15.7ΔΔΔΔΔΔ参中组10314.5±11.5337.4±11.4362.3±10.8ΔΔΔΔΔΔ参低组10307.5±13.4326.6±14.5356.8±14.3ΔΔΔΔΔΔ西药组10316.2±14.6338.1±16.5367.3±17.8注：与模型组比较，*.P.＜.0.0.5，.**P＜.0.0.1；与正.常组.比.较，ΔP＜0.05，Δ.Δ.P＜.0.01；与.西.药.组.比较，.P＜0.05，P.＜0.01。图3各组大鼠体重比较（g）由表.3，图3可见.，正常组的体重高于其余各组（P＜.0..01）。3.5各组大鼠血脂总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的情况3.5.1各组大鼠TC的情况35 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文_表4各组大鼠TC比较（mmol/L）稀释100倍（x±s）组别N第8周**正常组100.18±0.02ΔΔ模型组90.25±0.02*ΔΔ参高组90.22±0.03**参中组100.21±0.02ΔΔ参低组100.23±0.03**Δ西药组100.21±0.02注：与模.型.组.比较.，*P＜.0..05，**P.＜.0.01；与.正.常组比.较，.ΔP.＜0..0.5，Δ.ΔP.＜.0..0.1；与西药.组.比.较.，P.＜0..05，.P.＜0..01。图4各组大鼠TC比较（mmol/L）由表4，图4可见，实验第8周，与模型组相比，参高组、参中组、西药组均能降低TC。且参中组、西药组统计学意义更为明显（P＜0.01），说明参芪复方中剂量组、西药组均能降低对TC水平。3.5.2各组大鼠TG的情况_表5各组大鼠TG比较（mmol/L）稀释10倍（x±s）组别N8周**正常组100.42±0.03ΔΔ模型组90.62±0.06**ΔΔ参高组90.50±0.06**Δ参中组100.47±0.03*ΔΔ参低组100.56±0.07**Δ西药组100.49±0.0436 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文注：.与模.型.组比较.，*P.＜0..05，**P＜.0..01；与.正.常.组比较.，ΔP.＜0..05，ΔΔ.P.＜0..01；.与西.药组.比较，P.＜0..05，.P.＜0..01。图5各组大鼠TG比较（mmol/L）由表5，图5可见，实验第8周，与模型组相比，参高组、参中组、参低组、西药组的TG均低于模型组（P＜0.05），与西药组相比，参低组的TG高于西药组（P＜0.01）。表明，参芪复方各剂量组、西药组均能降低TG水平。3.6各组大鼠血清胰岛素（INS）、胰高血糖素（GC）水平比较3.6.1各组大鼠血清INS水平比较_表6各组大鼠INS比较（ng/ml）（x±s）组别N第8周**正常组100.54±0.10ΔΔ模型组90.34±0.13参高组90.43±0.14参中组100.44±0.09Δ参低组100.42±0.11**西药组100.50±0.10注：与模.型组.比较.，*P.＜0..05，**.P.＜0..01；与.正常.组.比较，.ΔP.＜0..05，.ΔΔP.＜0..01；与.西.药.组比.较.，P.＜0..05，.P.＜.0..01。37 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图6各组大鼠INS比较（ng/ml）由表6，图6可见，实验第8周，模型组、参低组的INS低于正常组（P＜0.05），与模型组相比，西药组、正常组的INS高于模型组（P＜0.01），参芪复方剂量组虽然高于模型组，但无统计学意义（P＞0.05）。表明西药组具有更高的胰岛素水平。3.6.2各组大鼠血清GC水平比较_表7各组大鼠GC比较（pg/ml）（x±s）组别N第8周**正常组10175.42±33.60ΔΔ模型组9567.93±76.75*ΔΔ参高组9484.53±97.03ΔΔ参中组10500.26±77.80ΔΔ参低组10536.33±94.99**ΔΔ西药组10379.13±93.97注：与模.型.组.比较.，*P.＜.0..05，*.*P＜.0..01；与正.常.组.比.较.，Δ.P＜.0.05，Δ.Δ.P＜.0.01；与西.药.组.比较，.P＜.0.05，P.＜.0.01。38 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图7各组大鼠GC比较（pg/ml）由表7，图7可见，GK大鼠各组的GC均明显高于正常组（P＜0.01），与模型组相比，参高组、西药组的GC低于模型组（P＜0.05），与西药组相比，其余各组的GC均高于西药组（P＜0.01）。可见参高组、西药组均能降低胰高血糖素水平。3.7各组大鼠C反应蛋白（CRP）水平比较_表8各组大鼠CRP比较（ng/ml）稀释10倍（x±s）组别N第8周**正常组10108.85±13.03ΔΔ模型组9164.75±20.89**ΔΔ参高组9137.34±22.26**Δ参中组10130.01±31.75ΔΔ参低组10151.80±20.63*ΔΔ西药组10140.93±15.00注：与.模.型.组.比较.，*P.＜.0.05.，**P.＜0..01；与.正.常.组比.较，Δ.P＜0..05，Δ.Δ.P＜0..01；与西.药.组比.较，P.＜.0..0.5，P.＜.0.01。39 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图8各组大鼠CRP比较（ng/ml）由表8，图8可见，实验第8周，GK大鼠各组的CRP均高于正常组（P＜0.05），与模型组相比，参高组、参中组、西药组的CRP均低于模型组。说明参高组、参中组、西药组均能降低CRP水平。3.8各组小鼠GLP-1的水平比较_表9各组大鼠GLP-1比较（ng/ml）（x±s）组别N第8周**正常组101.63±0.06ΔΔ模型组91.36±0.08**ΔΔ参高组91.48±0.08**ΔΔ参中组101.53±0.07**ΔΔ参低组101.49±0.05**Δ西药组101.57±0.06注：与模.型.组.比.较，*P.＜.0.05，**P.＜0.01；.与正.常.组比.较，ΔP.＜0.05，ΔΔP.＜0.01；与西药.组.比.较，P＜.0.05，P.＜0.01。40 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图9各组大鼠GLP-1比较（ng/ml）由表9，图9可见，实验第8周，GK大鼠各组的GLP-1均低于正常组（P＜0.05），与模型组相比，其他各组的GLP-1均高于模型组（P＜0.01），与西药组相比，参高组、参低组的GLP-1均低于西药组。说明参芪复方各剂量组、西药组均具有更高的GLP-1水平。3.9各组大鼠血糖波动情况3.9.1实验前血糖情况25wistar组20GK组血糖1510mmol/L5002468101214161820Time（h）图10实验前血糖情况正常组10只，GK组分别各组随机抽取2只，共10只。由图10可见，GK大鼠的血糖波动幅度大于正常wistar大鼠。41 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文3.9.2实验第4周的血糖波动情况比较_表10实验第4周各组大鼠血糖波动情况比较（mmol/l）（x±s）组别NMBGSDBGLAGE******正常组105.00±0.420.63±0.381.72±1.06ΔΔΔΔΔΔ模型组1019.39±1.563.15±0.858.76±2.23ΔΔ*ΔΔ**ΔΔ**参高组1017.32±2.962.12±0.785.98±2.36ΔΔΔΔ**ΔΔ**参中组1018.21±1.632.08±0.765.78±2.26ΔΔΔΔΔΔ*参低组1018.27±2.782.70±0.776.91±1.91ΔΔΔΔ**ΔΔ**西药组1017.79±1.882.02±0.575.45±1.48注：与模型组.比.较.，*.P.＜0.05，**P.＜0.01；与.正.常.组比.较，ΔP.＜0.05，ΔΔ.P.＜0.01；与.西.药组比.较，.P＜.0.05，P.＜0.01。30正常组模型组20高剂量血糖中剂量低剂量mmol/L西药组10002468101214161820Time（h）图11实验第4周各组大鼠血糖波动情况比较由表10，图11可见，实验第4周，各组GK大鼠的MBG、SDBG、LAGE均高于正常Wistar大鼠，与模型组相比，参高组的MBG低于模型组，参高组、参中组、西药组的SDBG低于模型组，参芪复方各剂量组、西药组的LAGE均低于模型组。3.9.3实验第8周血糖波动情况比较42 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文_表11实验第8周各组大鼠血糖波动情况比较（mmol/l）（x±s）组别NMBGSDBGLAGE******正常组105.07±0.950.67±0.451.87±1.24ΔΔΔΔΔΔ模型组921.47±2.182.62±0.537.35±1.44ΔΔ**ΔΔ*ΔΔ*参高组918.85±1.672.06±0.645.83±1.60ΔΔ**ΔΔ**ΔΔ**参中组1018.77±1.401.92±0.805.22±2.06ΔΔ**ΔΔΔΔ*参低组1019.05±2.012.18±0.535.87±1.41ΔΔ**ΔΔ****西药组1017.68±0.621.10±0.333.05±0.99注：与模型组.比.较.，*P.＜0.05，**P.＜0.01；.与正.常.组.比较，.ΔP.＜0.05，ΔΔP.＜0.01；.与西药.组.比较.，P.＜0.05，P.＜0.0.。3025Wistar组20模型组血糖15高剂量中剂量mmol/L10低剂量西药组5002468101214161820Time（h）图12实验第8周各组大鼠血糖波动情况比较由表11，图12可见，实验第8周，与模型组相比，其余各组的MBG、SDBG、LAGE均低于模型组（除参低组的SDBG外），与西药组相比，参芪复方各剂量组的SDBG、LAGE均高于西药组。可见西药组的MBG、SDBG、LAGE较低，参芪复方各组比较，中剂量组的MBG、SDBG、LAGE相对较低。3.10腹主动脉、胰腺组织病理形态学比较3.10.1腹主动脉病理形态学比较正常组：腹主动脉可见完整光滑内膜、中膜弹力纤维完整，细胞胞核整齐排列，外膜可见附着营养血管及脂肪等（见图13）。模型组：腹主动脉内膜不光滑，内皮细胞部分破坏，可见少量附壁细胞；中膜弹力纤维层及其细胞核均排列紊乱，43 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文血管壁变薄（以中膜弹力纤维层为主），并可见血管全层嗜酸性变，红染（见图14）。参芪复方高剂量组：腹主动脉内膜不光滑，散在内皮细胞破坏，可见少量附壁细胞；中膜弹力纤维层及其细胞核均排列紊乱，血管壁轻微变薄，未见血管全层嗜酸性变，红染（见图15）。参芪复方中剂量组：内膜不光滑，散在内皮细胞破坏，可见少量附壁细胞，中膜弹力纤维层及其细胞核排列略紊乱，血管壁轻微变薄（以中膜弹力纤维层为主），未见血管全层嗜酸性变，红染（见图16）。参芪复方低剂量组：内膜不光滑，内皮细胞部分破坏，可见少量附壁细胞；中膜弹力纤维层及其细胞核均排列紊乱，血管壁变薄（以中膜弹力纤维层为主），并可见血管全层嗜酸性变，红染并可见弹力纤维间疑似脂质空泡，程度较模型组轻，较参芪复方高、中剂量组重（见图17）。西药组：内膜不光滑，内皮细胞部分破坏，可见少量附壁细胞；中膜弹力纤维层及其细胞核略排列紊乱，血管壁变轻微薄，未见血管全层嗜酸性变，红染，并可见弹力纤维间疑似脂质空泡，程度较模型组轻（见图18）。图13正.常组.H.E×2.00图.14模.型组.H.E×.20.0图15参.高.组.HE.×2.00图.16参.中.组H.E.×2.0044 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图17参.低.组.HE×.2.00图18.西.药.组×.2003.10.2胰腺组织病理形态学比较正常组：正常胰腺，可见其外分泌部（胰腺）及内分泌部（胰岛），胰岛大小形态未见异常改变（见图19）。模型组：胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积），可见胰岛含铁血黄素沉积（见图20）。参芪复方高剂量组：胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，及部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积）（见图21）。参芪复方中剂量组：胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积）（见图22）。参芪复方低剂量组：糖原及炎症介于正常组和模型组之间（见图23）。西药组：胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积）（见图24）。图19正常组HE×200图20模型组HE×20045 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图21参高组HE×200图22参中组HE×200图23参低组HE×200图24西药组HE×2003.11基因芯片结果与分析3.11.1原始数据的归一化处理芯片扫描得到的原始数据由R软件中limma包进行归一化处理，所用的算法为Quantile，归一化信号值为经过log2计算的信号值。3.11.2表达差异基因筛选原始数据用软件R软件中limma包归一化后，采用Fold-change（表达差异倍数）以及T检验（Student’st-test）统计学方法对差异基因进行筛选，挑选条件如下：1）Fold-change（linear）≤0.5或者Fold-change（linear）≥2，2）T-testp-value＜0.05。3.11.3差异基因层级聚类（Heatmap）聚类热图（heatmap）是对样本和基因分别进行分级聚类之后，通过热图表现基因不同样本中表达情况的直观的图形表现形式。该分析方法原理：根据差异46 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文基因数据的数学特征进行分类，并得到样品和基因在表达模式上的关系，从而得出具有生物学意义的结论。下方文本为样本编号，右侧文本为基因（探针）编号，每一列代表一个样本，每一行表示一个基因（探针）。黑色代表0，表示基因表达水平没有变化，红色代表表达水平升高，绿色代表表达水平降低；颜色的亮度代表基因表达水平升高或降低的程度。表达相似的基因（探针）和样本聚类在一起。模型组VS空白组参中组VS模型组西药组VS模型组图25胰腺组织表达谱芯片组间差异基因聚类热图从图25可大概可以看出，模型组/空白组：基因表达下调者偏多；参芪复方47 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文组/模型组：基因表达上调者偏多；西药组/模型组：基因表达上调下调基本均等。3.12基因芯片检测结果3.12.1差异基因统计表12差异基因统计表组别差异基因总数上调数量下调数量模型组VS空白组349128211参中组VS模型组775423西药组VS模型组954649按筛选标准P＜0.05，FC值＞2筛选，模型组与空白组比较，共有差异基因349条，其中表达上调的有128条，表达下调的有211条。参芪复方中剂量组与模型组相比较，共有差异基因77条，其中表达上调的有54条，表达下调的有23条。西药组与模型组相比，共有差异基因95条，其中表达上调的有46条，表达下调的有49条。可见模型组/空白组基因下调者多；参芪复方组/模型组基因上调者多；西药组/模型组基因上调下调基本均等。3.12.2差异基因的GO功能富集分析GO分析为对差异基因的功能进行富集，并使用统计学的方法来检测GO条目中富集的差异基因的显著性，并用P-value大小来表示其显著性。本实验主要研究生物学过程（biologicalprocess）的层次.，分.析差异.基因.主要.行使了.哪些生.物学过.程.。3.12.2.1模型组VS空白组差异表达基因GO功能富集分析分析模型组VS空白组差异基因的GO功能注释和富集，筛选出部分显著富集的GO条目。详见下表13：表13模型组VS空白组GO功能分析结果BiologicalprocessGOIDP-valuemetabolicprocessGO:00081520.0000carbohydratemetabolicprocessGO:00059750.0005glucosemetabolicprocessGO:00060060.0011circadianrhythmGO:00076230.012448 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文negativeregulationofcircadianrhythmGO:00427540.0086entrainmentofcircadianclockGO:00096490.0203entrainmentofcircadianclockbyphotoperiodGO:00431530.0132cellproliferationGO:00082830.0006leukocyteproliferationGO:00706610.0006mononuclearcellproliferationGO:00329430.0005secretionbycellGO:00329400.0000regulationofinsulinsecretionGO:00507960.0007leukocytecell-celladhesionGO:00071590.0046cellmigrationGO:00164770.0008regulationofresponsetoexternalstimulusGO:00321010.0474responsetolightstimulusGO:00094160.0392responsetoseleniumionGO:00102690.0005glutaminefamilyaminoacidcatabolicprocessGO:00090650.0007如表13所示，模型组VS空白组的差异基因，可能涉及的生物学过程可概括为代谢过程、昼夜节律、细胞增殖、细胞分泌、白细胞细胞黏附、细胞迁移、对光刺激的反应、对硒离子的反应、谷氨酰胺家族氨基酸分解代谢过程等。其中代谢过程包含：碳水化合物代谢过程、葡萄糖代谢过程；昼夜节律包含：生物钟的夹带、通过光周期夹带生物钟；细胞增殖包含：白细胞增殖、单核细胞增殖；细胞分泌包含：调节胰岛素分泌。3.12.2.2参芪复方中剂量组VS模型组差异表达基因GO功能富集分析分析参中组VS模型组差异基因的GO功能注释和富集，筛选出部.分.显著.富集的.GO.条目.。详见下表14：表14参中组VS模型组GO功能分析结果BiologicalprocessGOIDP-valuecircadianregulationofgeneexpressionGO:00329220.0055circadianbehaviorGO:00485120.0516entrainmentofcircadianclockbyphotoperiodGO:00431530.0006entrainmentofcircadianclockGO:00096490.0010cellproliferationGO:00082830.0164smoothmusclecellproliferationGO:00486590.001749 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文cellmigrationGO:00164770.0037regulationofcellmigrationGO:00303340.0292dendriticcellmigrationGO:00363360.0345regulationofkeratinocytemigrationGO:00515470.0147negativeregulationoftumornecrosisfactor-mediatedGO:00108040.0183signalingpathwaycell-substrateadhesionGO:00315890.0152responsetolightstimulusGO:00094160.0150positiveregulationofglucoseimportinresponsetoGO:20012750.0201insulinstimulusdetection.of.chemical.stimulus.involved.in.sensory.GO:00015800.0416perception.ofbitter.taste.woundhealing,spreadingofepidermalcellsGO:00353130.0327negativeregulationofTORsignalingGO:00320070.0012regulationofphosphatidylinositol3-kinaseactivityGO:00435510.0024apoptoticsignalingpathwayGO:00971900.0004如表14所示，参中组VS模型组的差异基因，涉及的生物学过程有昼夜节律、细胞增殖、细胞迁移、细胞黏附、负调控肿瘤坏死因子介导的信号通路、细胞对刺激的反应、伤口愈合、TOR信号的负调控、调节磷脂酰肌醇3-激酶活性、凋亡信号通路等。其中昼夜节律包含：生物钟夹带、光周期、运动节律、通过光周期夹带生物钟、调节昼夜节律；细胞增殖包含：平滑肌细胞增殖、正调控细胞增殖、负调控细胞增殖、调节平滑肌细胞增殖、正调节平滑肌细胞增殖、上皮细胞增殖、调节上皮细胞增殖；细胞迁移包含：细胞迁移、树突状细胞迁移、ameboidal型细胞迁移、调节角质形成细胞迁移；细胞粘附包含：细胞-基底粘附、细胞-基质粘附、细胞-基质粘附的调节、上皮细胞-细胞粘附；对刺激的反应包含：细胞对化学刺激的反应、.对光.刺激.的反.应、.葡萄.糖输.入对.胰岛素刺.激反应.的正.调.节、检测涉及苦味的感官知觉的化学刺激物。3.12.2.3西药组VS模型组差异表达基因GO功能富集分析分析西药组VS模型组差异基因的GO功能注释和富集，筛选.出部.分显著.富集的G.O条目.。详见下表15：50 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文表15西药组VS模型组GO功能分析结果BiologicalprocessGOIDP-valuerhythmicprocessGO:00485110.0014circadianrhythmGO:00076230.0007circadianbehaviorGO:00485120.0007regulationofcircadiansleep/wakecycle,GO:00108400.0195wakefulnessregulationofcircadiansleep/wakecycle,GO:00451880.0450non-REMsleepcellmigrationGO:00164770.0278epithelialcellmigrationGO:00106310.0049regulationofkeratinocytemigrationGO:00515470.0260positiveregulationofcellmigrationinvolvedinGO:00900500.0260sproutingangiogenesisregulationofhomeostaticprocessGO:00328440.0090regulationofheatgenerationGO:00316500.0481regulationofenergyhomeostasisGO:20005050.0481negativeregulationofcelladhesionGO:00071620.0361negativeregulationofleukocytecell-cellGO:19030380.0397adhesionpositiveregulationofwoundhealingGO:00903030.0096insulinsecretionGO:00300730.0284由表15可见，西药组VS模型组差异基因涉及的生物学过程有昼夜节律、细胞迁移、细胞粘附、细胞增殖、调节伤口愈合、调节炎症反应、稳态过程的调节、胰岛素分泌等生物学过程等。昼夜节律包含的GO有：昼夜节律行为、昼夜节律睡眠/觉醒周期，非REM睡眠、节昼夜睡眠/觉醒周期，觉醒、通过光周期夹带生物钟等；细胞迁移包含有：上皮细胞迁移、调节角质形成细胞迁移、细胞迁移的正调控涉及发芽血管生成；稳态过程的调节包含的GO有：调节热量产生、调节能量平衡；细胞粘附包含的GO有：细胞粘附的负调节、负性调节白细胞细胞粘。3.12.3差异基因的pathway功能富集分析将差异表达基因进行KEGG富集分析，找到有显著性意义的生物学调控通51 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文路。富集分析方法：采取的方法是.fisher.精确.检验.，挑.选的.标准是落.在某个.ter.m/pathway.上差.异.的.基.因.数目.＞＝.2，P.-.value.＜.0.05。3.12.3.1模型组VS空白组差异基因的pathway富集分析通过对模型组VS空白组差异基因的pathway富集分析，筛选出部分显著富集的pathway条目。详见下表16：表16模型组VS空白组差异基因的pathway富集分析结果PathwayNameP-valueGeneIDArginineandprolinemetabolism0.0002Arg2/Ckb/Glud1/Prodh/Sat1Glyc.o.s.p.h.in.gol.ipid.bi.os.y.nthesis.−l.ac.to0.0029Abo/B3galt2/Fut4andneolactoseriesMetabolicpathwaysOocytemeiosis0.0053Igf1/Pkmyt1/Plk1/Ppp1cb/PrkacbProgesterone−mediatedoocytematuration0.0002Braf/Cdc25a/Pkmyt1/Plk1/PrkacbAmoebiasis0.0162Arg2/C8g/Cd1d1/Prkacb由表16可见，模型组VS空白组差异表达基因涉及的主要信号通路依次为精氨酸和脯氨酸代谢、糖鞘脂生物合成-乳糖和新乳糖系列、代谢途径、卵母细胞减数分裂、孕酮介导的卵母细胞成熟、阿米巴病。3.12.3.2参中组VS模型组差异基因的pathway富集分析分析参中组VS模型组差异基因的pathway富集，筛选.出部分.显著富.集的pathway。详见下表17：表17中药组/模型组差异基因的pathway富集分析结果PathwayNameP-valueGeneIDPancreaticcancer0.0004Pik3r1/Arhgef6/Cdc42mTORsignalingpathway0.0060Ddit4/Pik3r1Renalcellcarcinoma0.0103Pik3r1/Cdc42Bacterialinvasionofepithelialcells0.0109Pik3r1/Cdc42VEGFsignalingpathway0.0121Pik3r1/Cdc42Smallcelllungcancer0.0151Itga6/Pik3r1ErbBsignalingpathway0.0154Hbegf/Pik3r1FcgammaR-mediatedphagocytosis0.0183Pik3r1/Cdc42GnRHsignalingpathway0.0205Hbegf/Cdc42Regulationofactincytoskeleton0.0010Itga6/Pik3r1/Arhgef6/Cdc42Tcellreceptorsignalingpathway0.0246Pik3r1/Cdc42Leukocytetransendothelialmigration0.0272Pik3r1/Cdc4252 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文Focaladhesion0.0078Itga6/Pik3r1/Cdc42Axonguidance0.0327Unc5b/Cdc42Neurotrophinsignalingpathway0.0336Pik3r1/Cdc42Toxoplasmosis0.0341Itga6/Pik3r1Pathwaysincancer0.0334Itga6/Pik3r1/Cdc42由表17可见，参中组/模型组差异表达基因涉及的主要通路依次为胰腺癌、mTOR信号通路、肾细胞癌、细菌侵入上皮细胞、VEGF信号通路、小细胞肺癌、ErbB信号通路、FcγR介导的吞噬作用、GnRH信号通路、调节肌动蛋白细胞骨架、T细胞受体信号通路、白细胞跨内皮迁移、局部粘着、轴突指导、神经营养因子信号通路、弓形体病、癌症途径。3.12.3.3西药组VS模型组差异基因的pathway富集分析分析西药组VS模型组差异基因的pathway富集，筛选.出部.分.显.著.富.集.的pathway。详见下表18：表18西药组/模型组差异基因的pathway富集分析结果PathwayNameP-valueGeneIDArginineandprolinemetabolism0.0006Arg2/Sat1/ProdhSalivarysecretion0.0250Itpr1/Kcnn4GnRHsignalingpathway0.0388Itpr1/Hbegf西药组/模型组差异基因涉及的主要通路为精氨酸和脯氨酸代谢、唾液分泌、GnRH信号通路。3.13关键基因Pik3r1、Ddit4、Id2、Usp2实时荧光定量PCR检测结果结合基因芯片差异基因和pathway和GO功能富集分析的结果发现，发现参中组VS模型组的差异基因Pik3r1表达量上调，并参与多条GO和pathway，并发现在mTOR信号通路富集，并统计学意义较明显；参中组VS模型组、西药组VS模型组均涉及的GO条目为昼夜节律，富集的关键基因均有Id2、Usp2。因此将Id2、Usp2、Pik3r1、Ddit4进行定量PCR验证。如表19所示为以上四个基因的基因芯片P值和FC值，表20所示为PCR验证的P值和FC值，表21所示为四个基因的mRNA相对表达量，其中P＜0.05有统计学意义，FC值＞2为上调，FC值＜1为下调。53 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文表19差异基因的基因芯片结果P（FC）GeneName模型组/空白组参中组/模型组西药组/模型组Id20.31（1.33）0.02（0.37）0.02（0.38）Usp20.07（0.20）0.02（3.81）0.14（6.20）Pik3r10.56（0.89）0.04（2.80）0.67（0.82）Ddit40.07（0.48）0.001（4.24）0.002（1.61）注：FC值＞2为上调，FC值＜1为下调。表20差异基因的定量PCR结果P（FC）GeneName模型组/空白组参中组/模型组西药组/模型组Id20.33（1.36）0.01（0.26）0.04（0.46）Usp20.3（0.18）0.01（5.29）0.02（11.34）Pik3r10.53（1.28）0.02（3.43）0.42（1.39）Ddit40.46（0.63）0.05（6.88）0.03（3.33）注：FC值＞2为上调，FC值＜1为下调。_表21Id2、Usp2、Pik3r1、Ddit4mRNA相对表达量（x±s））组别Id2mRNAUsp2mRNAPik3r1mRNADdit4mRNA*空白组0.111±0.046750.0371±0.01490.0996±0.00290.0168±0.0096模型组0.151±0.04180.0066±0.00390.129±0.74040.0094±0.0090****参中组0.0391±0.00940.0351±0.01110.443±0.12950.0730±0.0371***西药组0.0697±0.019870.0752±0.02960.179±0.06440.0353±0.0099注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。图26Id2、Usp2mRNA相对表达量柱状图54 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图27Pik3r1、Ddit4mRNA相对表达量柱状图由以上图表可见，Id2在基因芯片结果中，参中组/模型组、西药组/模型组表达下调（P＜0.05），模型组/空白组表达上调（P＞0.05），上调趋势不明显，在PCR中得到了一致的结果；Usp2在基因芯结果中，参中组/模型组（P＜0.05）、西药组/模型组（P＞0.05）表达上调，在模型组/空白组表达下调（P＞0.05），经PCR验证后，参中组/模型组、西药组/模型组上调趋势更加明显，且有统计学意义；Pik3r1在基因芯片结果中，参中组/模型组表达上调（P＜0.05），在西药组/模型组、模型组/空白组（P＞0.05）表达下调，均无统计学意义。经PCR验证，参中组/模型组表达上调更为明显（P＜0.05），在西药组/模型组、模型组/空白组（P＞0.05）表达上调，但无统计学意义。Ddit4在基因芯片的结果中，参中组/模型组、西药组/模型组表达上调（P＜0.05），模型组/空白组表达下调（P＞0.05），经PCR验证后，参中组/模型组、西药组/模型组表达上调趋势更加明显（P＜0.05），模型组/空白组表达下调（P＞0.05）。总结得出，在参中组/模型组中，Id2表达为下调趋势，Pik3r1、Usp2、Ddit4均为表达上调趋势。经PCR验证后，表达趋势相符，且有统计学意义。55 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文4讨论4.1中医对糖尿病及血糖波动的认识4.1.1中医对糖尿病病因病机的认识糖尿病在中医学中称之为“消渴”，“消瘅”、“三消”等名称。消渴之名首见于《黄帝内经》，《素问∙奇病论》载：“此人必数食甘美而多肥也……故其气上溢，转为消渴”，并以“善渴、数饮”“善食而瘦”等为主要症状，从而出现了“三多一少”（多饮、多食、多尿、消瘦）的描述。对于消渴病病因论述，《内经》将其总结为过食甘肥、情志失调、瘀血阻滞、五脏亏虚、外感六淫等因素，并指出胃肠结热，上焦火盛，肺津灼伤，血瘀化热等为消渴之病机。针对病因病机，提出“治之以兰，除陈气也”，指出当用甘寒之品，生津止渴，同时禁食膏粱厚味、燥热伤津之品。东汉张仲景《金匮要略》中将消渴发病归结为胃热、肾虚、肺胃津伤，认为“营气不足，燥热内生”，或阳明胃热亢盛，耗伤阴津，“趺阳脉浮而数，浮即为气，数即为消谷而大坚，气盛则溲数……即为消渴”。张仲景首创白虎人参汤、肾气丸等，成为后世治疗消渴病基础方。隋代太医巢元方所著《诸病源候论》将消渴分“八候”，论著中指出久服五石散，肾阴被灼，下焦虚热为消渴之病因，并首次阐述消渴病并发痈疽等并发症，并认识到适当运动对消渴病的益处，主张“消渴病人先行一百二十步，多者千步，然后食之”。唐代医家孙思邈的《备急千金要方》创立清热泻火、生津止渴大法，其中“消渴门”所录消渴病方52首，其中玉泉丸、黄连丸、玉壶丸等名方沿用至今，所用之药天花粉、麦冬、地黄、黄连等，对后世有极大的指导意义。北宋时期，朝廷官方修书《太平圣惠方》中将消渴病单独列为“三消论”，明确指出“三消”一词：“夫三消者，一名消渴；二名消中；三名消肾……一则饮水多而小便少者，消渴也；二则吃食多而饮水少，小便少赤黄者，消中也；三则饮水随饮便下，小便味甘而白浊，腰腿消瘦者，消肾也”。金元时期，刘河间创立燥热病机说，在治疗上，倡导除燥热而布津液，多用寒凉之剂，推崇白虎汤、承气汤等，所创宣明黄芪汤立意于补肺气而布津液。李东垣进一步提出“津液不足，结而不润，皆燥热为病”的思想，在《兰室秘藏∙消渴论》中创立生津甘露56 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文饮，以清热润燥之法治疗消渴病。“滋阴派”的创始人朱丹溪创立“阳常有余，阴常不足”及“相火”理论，治疗消渴之时提倡“养阴、降火、生血”为主要大法，并慎用香燥之品，并言天花粉“乃消渴神药也”。至此，消渴病“养阴清热”治法日趋完善，为后世以养阴清热法治疗消渴病奠定基础。至明代，戴元礼在《证治要诀》记录“黄芪六一汤”加减治疗消渴病，将益气放在首位。“黄芪六一汤”的出处为《太平惠民和剂局方》：黄芪六两、甘草一两组成，“治.男子.、妇.人诸.虚.不足.，.肢.体.劳.倦.，.胸.中.烦.悸，.时常.焦渴..，.唇.口干燥.，.能.饮食.。或先渴而欲发疮疖，或病痈疽而后渴者，尤宜服此。常服平补气血。”是益气生津法治疗消渴的基础方。明代补肾学说较为盛行，张景岳在《景岳全书∙消渴论治》中强调不可一概以“火证”而论，提出温补肾阳之治法。张景岳认为消渴乃肾气不足，元阳衰退，气不摄精所致，所用当“壮水养气，以左归饮、大补元煎之类主之”，若是火衰不能化气，而至于气虚不能化液，“当以右归丸、八味地黄丸之类主之”。清代医家在前人的基础上提出新的观点。叶天士《临证指南医案∙三消》云：“心境愁郁，内火自燃，乃消症大病。”说明了情志失调是导致消渴的因素之一。孟河医派的奠基人费伯雄在《医醇媵义∙三消》中，在润肺、清胃、滋肾常见之法当中，分别佐以渗湿化痰、润燥化痰和少参渗利，以治疗消渴病火盛伤阴，燥湿并见的复杂病机，又下消日久，病益深，而用滋阴活血之品。陈修园根据脾“喜润恶燥”的特性，在《医学实在易》中道“黄芪六一汤取气化为水之义……七味白术散，方中有藿木之香燥，”故在治疗当中不可一味使用滋阴甘寒之品，而忽视了燥脾之药。随着对消渴病病因病机的不断深化认识，总结其根本病机，一言以蔽之，即为“本虚标实”，先天禀赋不足，五脏亏虚，易生消渴，而生郁热、生痰浊、成瘀血，发生变证。发展至现代，社会的进步和人们生活方式的改变，糖尿病的发病率随之显著增加，当代医家，辨证予以“滋养清热、生津润燥、补肾益气、肝脾同调”的治疗方法，并强调“痰瘀、瘀血、浊毒”等病理因素。中医学秉承着“辨证论治”和“天人合一”的整体观，并非单单降低血糖指标，而是着眼于病人的整体状态。平稳降低血糖，减少血糖的波动，减少并发症的发生发展，达到阴阳平衡。《素问∙四气调神大论》中记载：“圣人不治已病治未病，不治已乱治57 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文为乱……夫病已成而后药之，乱已成而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎”。《黄帝内经》中此句提出了“治未病”的预防思想。“治未病”包括未病先防和已病防变，对于糖尿病及其并发症，更是防胜于治。4.1.2中医对血糖波动的病机认识2型糖尿病患者的糖代谢紊乱除了整体血糖水平升高外，另外一个重要特征即血糖波动幅度较大。血糖波.动.容.易.引.发.糖.尿.病.慢.性.并.发.症，包括微血管病变和大血管病变。相对于持续性高血糖，剧烈的波动性高血糖对血管的危害更大。中医药通过其辨证论治的核心思想，平衡阴阳，维持机体稳定的状态，从而达到整体调节和稳定血糖的作用。因此，从调节血糖波动的角度入手，能更充分地发挥中医优势。在中医古代文献中对消渴认识由来已久，但无“血糖波动”这一说法，目前中医虽未对血糖波动的研究尚形成公认、系统的辨证体系，但在理论和实践的基础上对血糖波动的病机亦有一定认识。4.1.2.1从“脾胰同源”论血糖波动在《难经》第四十二难中提到“脾重二斤三两，扁广三寸，长五寸，有散膏半斤，主裹血，温五藏，主藏意”。其中所言“散膏”，古籍中称之为胰腺组织。张锡纯在《医学衷中参西录》中指出：“古人不名膵而名为散膏，散膏即膵也，为膵之质为胰子，形如膏，而.时.时.散.其.膏.之.液.于.十.二.指.肠.之.中.，……故.曰.散.膏.，为.脾.之.副.脏”；“膵为脾之副脏，尾衔接于脾门，其全体之动脉有自脾脉分支而来，故与脾有密切关系”根据古代文献对“散膏”形态和重量的描述，与现代医学的胰腺不谋而合。脾主运化，“饮入于胃，游溢精气，上输.于脾，脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱，水精四布，五经并行”。其中的“脾气散精”即是将胃腐熟的饮食水谷转化为精微物质和津液，通过肺的气化作用而敷布全身，濡养五脏六腑。现代医学之胰腺，是人体第二大消化腺，内分泌腺即胰岛分泌胰岛素和胰高血糖素，维持体内血糖平稳，如胰岛β细胞功能障碍，导致分泌胰岛素减少，或者外周组织对胰岛素的敏感性降低，则会发生血糖升高，导致糖尿病的发生。“血糖”在现代中医学当中可归属于“水谷精微”范畴，胰岛细胞分泌胰岛素降低“血糖”，如脾脏运化水谷一般。脾虚则运化失职，于是上奉者少，而流失者多，糖尿病之“糖尿”，就是精微的流失。因此，中医的“脾”的功能包括现代58 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[10]医学的“胰”。著名中医临床家何绍奇提出“脾胰同源”的思想，认为糖尿病病在胰，胰归属于脾，故绝大多数病人从脾治，治脾即是治胰，脾的运化恢复[11]才是正常的降糖之道。《医学衷中参西录》中有曰：“消渴一证，起于中焦而极于上下，……因中焦病，而累及于脾，……有时膵脏发酵，多酿甜味，由水道下陷，其人小便遂含有糖质。迨至膵病累及于脾，致脾气不能散精达肺而津液少，不能通调水道则小便无节，是以渴而多饮多溲也”。并认为导致消渴的病机为“元气不升，大气下陷，脾不散精”。《素问∙奇病论》有：“脾瘅……此肥美之所发也……肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”，《素问释义》谓：“食肥则气滞而不达，故内热；食甘则中气缓而善留，故中满。”张景岳亦云：“肥者，味厚助阳，故能生热；甘者，性缓不散，故能留中。热留不去，久必伤阴，其气上溢，故转变为消渴之病。”饮食不节，过食肥甘，则超过脾胃负担，肠胃乃伤，则脾转输不利，中焦升降失常，令人中满内热，水谷精微布散失常，发为消渴，引起“血糖波动”。4.1.2.2从“肝脾不调”论血糖波动情绪不稳定与血糖波动亦有相关，古代文献中有论述，《灵枢·五变》曰：“怒则气上逆，胸中蓄积，血气逆留……转而为热，热则消肌肤，故为消瘅。”叶天士在《临证指南医案》中指出：“心境愁郁，内火自燃，乃消症大病。”刘河间《三消论》云：“五志过极，皆从火化，热盛伤阴，致令消渴。”中医学将情志变化归于肝，肝主疏泄，调畅气机，疏泄情志，助脏腑气化与藏血，调节气血津液的代谢。肝气调达与否，关系到水液代谢和脾胃运化功能。肝脾不调导致[12]水谷精微运化和输布失常，影响血糖波动。肝为肝脏，体阴而用阳，肝气主升主动，肝脏的功能太过则易出现肝火上炎，灼伤阴液；木火刑金，耗伤肺阴；肝失疏泄，情志不畅，肝气郁结，郁久化热，灼伤阴津；肝失疏泄，则中焦脾胃升降失调，津液的升降输布失调，津液壅滞中焦，不得布散，则在上表现为口渴而不欲饮，在中则表现为中满，身重，疲倦，腹型肥胖，在下表现为多尿；肝失疏泄，横逆犯脾，脾失健胃，运化水谷精微功能失调。中医通过肝脾同调，使气机条达，津液布散正常，达到生理与心理的双重平衡。59 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文4.1.2.3从“阴火论”论治血糖波动①“火与元气不两立”李东垣在《脾胃论∙脾胃虚实传变论》：“元气之充足，皆由脾胃之气无所伤，而后能滋养元气；若胃气之本弱，饮食自倍，则脾胃之气既伤，则元气亦不能充，而诸病之所由生也。”《脾胃论·饮食劳倦所伤始为热中论》中有“饮食失节，寒温不适，则脾胃乃伤。喜、怒、忧、恐，损耗元气。既脾胃气衰，元气不足，而心火独盛。心火者，阴火也……脾胃气虚，则下流于肾，阴火得以乘其土位。”脾气健旺，则元气充足，脾气亏虚，元气不足，则相火妄动为阴火。李东垣“火与元气不两立”的理论，元气与阴火之间相互制约，元气不足，则阴火亢盛；反之元气充足，则阴火收敛。②“阴火论”与血糖波动的关系“阴火”理论首见于金代医家李东垣《内外伤辨惑论》，其最早源于《黄帝内经》，《素问·调经论》中，“阴虚生内热奈何？岐伯曰：有所劳倦，形气衰少，谷气不盛，上焦不行，下脘不通，胃气热，热气熏胸中，故.内热”此句与《素问·奇病论篇》“此肥.美之人所发也，其人必数食甘美而多肥也，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”之“中满内热”理论理同，均为过食肥甘伤及脾胃，食郁化热。《兰室秘藏∙消渴门》“高消者，舌上赤脉，大渴引饮，……中消者，善食而瘦，自汗，大便硬，小便数，……下消者，烦渴引饮，耳轮焦干，小便如膏”。李东垣认为，脾胃内伤，元气亏虚，全身脏腑功能失司，水谷精微运行障碍，不升反降，下走小便；元气下陷，阳伏阴中化火，阴火上乘三焦，始病热中，“阴火”鴟张，熏蒸肺、胃、肾，津血损耗，致气血津血不足，发病为消渴。元气亏虚，气虚下陷，阴火鴟张形成血糖波动较大，易出现低血糖[13]的重要病机。王进波等应用“阴火论”探讨脆性糖尿病，认为脾胃元气不足是消渴形成的始动原因，阴火是血糖波动的重要原因，脆性糖尿病治宜补中益气、升举精微、泻阴火，自拟十味平糖方，由李东垣清暑益气汤化裁而来。为治疗“元气不足，阴火困脾”脆性糖尿病而设，治之益气、畅中、泻火为法，黄芪、白术、人参补气健脾之本，共为君药；柴胡、升麻、葛根奏升提之力升发脾阳，泽泻、黄柏攻逐阴火；麦冬、葛根、五味子、清虚热生津，纳相火。共奏补元气，纳阴火，升60 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[14]清阳，平稳降糖之功。4.2西医对血糖波动的认识4.2.1血糖波动的概念及评价指标血糖波动（glucosefluctuation）又称血糖变异性（glycaemicvariability）、血糖漂移性，是指血糖在高峰和低谷之间的不稳定变化.，.不仅包括短期血糖波动，[15]即.日.间.血糖.波动和.日内.血糖波动.，还包括长.期.血糖波动.，即.HbA1c变.异性.。近年来，随着连续动态血糖监测系统（CGMS）评估技术的发展，可精确评估DM患者血糖漂移的特征。目前临床上将平均血糖波动幅度（MAGE）作为反映[16]血糖波动的金标准。监测血糖波动的方式有2种，动态血糖监测（continuousglucosemonitoring，CGM）和自我血糖监测（self-monitoringofbloodglucose，SMBG），CGM能够提供实时葡萄糖波动的准确检测，并用于调查生活方式和治疗对日常血糖控制的影响，并制定个性治疗计划，以充分控制血糖水平的短期波动。SMBG较为灵活，通过7~8次/日血糖检测结果能够较为准确地估计T2DM[17-18]患者的日内血糖波动，且与CGM有较好的相关性。常用的CGM评估血糖波动的指标及正常参考值，常用的7点SMBG评估血糖波动的指标及正常值如[19]见下表。表1常用的动态血糖监测指标及正常参考值评.估.指.标特点.和/或.临床.意义.正常参考值*血糖.水平.的标准.评价总体偏离平均血糖值的程度，但无＜1.40mmol/L差（.SDBG.）法区分主要的和细小的波动*平均.血糖.波动.幅采用“滤波”的方法.，从而能真正反映＜.3.90.mmol/L度（..MAGE..）血糖波动而不仅仅是统计学意义上的离散特征**最大血糖波动幅评价最大血糖.波动的幅度＜.4.40.mmol/L度（.LAGE.）**日间血糖平均绝评估日间.血.糖的波.动程度，体现每日之＜.0.83.mmol/L对差（.MODD.）间血糖的.重复性***注：来源于正常人群检测值的95%分位；来源于正常人群的平均值。表2常用的动态血糖监测指标及正常参考值参数名称特点和/或临床意义正常参考值61 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文血糖水平的标准例如：患者监测日内7点血糖水平分别为6、＜.2.0.mmol/L.差（.SDBG）10、7、14、8、16、6mmol/L，则SDBG=[(6－9.57)2+(10－9.57)2+(7－9.57)2+(14－9.57)2+(8－.9.57)2.+.(16－9.57)2+.(6－9.57)2]/(7－1).，再开方.。注.：9.57.为.7.点.血糖的平均.值.*餐后血糖波动幅例如：患者三餐后血糖值分别15、17、＜2.2..mmol/L度..(PPGE)21mmol/L，相应的餐前血糖水平为7、8、9mmol/L，则PPGE=[(15－7)+(17－8)+(21－8)]/3=10mmol/L**最大血糖波动幅例如.：患者日内最大血糖值.为17mmol/L，最＜.4.4..mmol/L度(.LAGE.)小血糖值为.5mmol/L，则.LAGE=17－5=.12mmol/L4.2.2影响血糖波动的因素血糖的稳定性受多种因素的控制，正常人在神经、内分泌及肝组织等的精密调节下血糖的波动幅度不大，血糖相对平稳。而作为糖尿病病人，由于胰岛素敏感性下降和胰岛功能下降，导致血糖的波动幅度增加，平稳性得不到控制。波动性高血糖，比慢性持续性高血糖对糖尿病血管并发症危害更大。影响血糖波动的[20]因素有，胰岛β细胞功能障碍及胰岛素抵抗、饮食不节、运动和药物.等。①胰岛β细胞功能下降：胰岛β细胞功能进行性减退甚至衰竭是T2DM的主要特征，导致胰岛素分泌减少.，调节血糖能力下降，易导致血糖的波动，胰岛[21]功能越差，血糖波动越明显。②餐后高血糖:餐后高血糖对于血糖波动的贡献大于空腹血糖即使在血糖控制良好的2型糖尿病患者中，HAb1c变异性的70%可以用餐后血糖异常来解释[22]。尤其是中国人的饮食习惯和饮食结构，纳入较多高升糖指数食物以及碳水化合物，餐后血糖迅速升高，导致.血糖.波动.的幅度.增加。③药物：血糖波动包括餐后高血糖及低血糖的发生，口服降糖药后易导致低血糖，这也是血糖波动增加的主要原因之一。如促进胰.岛.素分泌.的药.物或者.胰岛素.本身.等均会.增加患.者的.低血糖风.险，增.加血.糖波动.。④昼夜节律紊乱：长期以来人们认识到葡萄糖稳态和胰岛素分泌的昼夜节律调节是人类代谢控制的重要特征，昼夜节律紊乱在当今社会日益普遍，并可能部[23]分是由于全球2型糖尿病（T2DM）和代谢综合征的显着增加造成的。昼夜节[24]律通过介导许多代谢酶和传导系统的表达和/或活性参与控制外周组织疾病中62 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[25]的代谢和能量稳态。参与葡萄糖代谢的激素的昼夜节律与葡萄糖耐量和胰岛[26]素作用有关，最近研究表明，这些昼夜节律的改变可导致代谢综合征，甚至2型糖尿病的发作，特别体现在夜间生活方式者，轮班工作人员等。4.2.3血糖波动对糖尿病大血管的影响及机制随着人们对血糖波动的逐渐重视，诸多研究发现，波动性高血糖造成的糖尿病血管并发症比慢性高血糖更大。对血管造成损伤，加快引起动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）。血糖波动能增加冠心病的发生率，被认为是除了血脂异常之外的危险因素。4.2.3.1血糖波动加重胰岛β细胞功能缺陷血糖波动是糖尿病并发症强有力的预测因素和胰岛β细胞的关键影响因素。长期慢性高血糖可引起机体内产生过量氧自由基，可引起氧化应激反应，使内皮细胞受损，引起胰腺β细胞凋亡；因慢性糖毒性引起的多元醇通路活性增强，蛋白激酶C（PKC）激活，以及糖化终末产物（AGEs）增加，均可引起胰岛β细[27]胞功能损伤。波动性高血糖被认为是胰岛β细胞损伤的主要原因，胰岛β细胞由于胰岛内在的抗氧化酶水平低，特别容易受到ROS的影响。血糖波动主要通过氧化应激（ROS水平升高），使胰岛素信号传导受抑制，导致β细胞功能的[28损伤，诱导β细胞凋亡]。血糖波动引起的危害不亚于长期高糖蓄积造成的危害，随着血糖波动加大，患者基础C肽及HOMA-β指数减低，表明血糖波动可损[29]害胰岛β细胞功能。有学者以INS-1（大鼠胰岛瘤细胞株）细胞作为研究对象，研究在间歇性高血糖对胰岛β细胞凋亡和对细胞活力的毒性作用，结果发现，波动性高血糖能诱发更严重的细胞凋亡；显著增高细胞内ROS和黄嘌呤氧化酶（XOD）水平；降低细胞活性；明显降低细胞周期相关蛋白（如D1和Skp2）；显著增加p27和p21的表达。说明细胞氧化应激的过度活化和细胞周期蛋白的调控[30]可能是波动性高血糖诱导INS-1细胞损伤的可能机制。4.2.3.2血糖波动引起的氧化应激、炎症反应与血管内皮功能障碍及内皮细胞凋亡相关氧化应激是指活性.分.子.例如活.性.氧.簇（.Reactive.oxygen.species.，RO.S）.以及活.性.氮.簇.（Reactive.nitrogenspecies，RNS.）等的过度生成和/或清除减少，从而.[31]造.成.体.内.活性氧类生.成.与.抗.氧.化.防御.功.能之间.平.衡的紊.乱。Qin-MinGe等发63 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文现波动性高血糖使猪髋动脉内皮细胞（PIECs）诱导产生更多的ROS，这种效应[32][33]至少部分与NADPH氧化酶的活性增强有关。Ting-songLiu等研究发现，波动性高血糖能明显降低人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）的细胞活力，使MDA水平增加，谷胱甘肽（GSH）浓度降低，ROS的产生增加，细胞凋亡增加，HO-1和Nrf2的表达抑制更明显，Nrf2/HO-1被认为是细胞内最重要的抗氧化应激机制[34]之一。说明波动性高血糖通过抑制Nrf2/HO-1通路在频繁血糖波动的诱导下引起氧化应激和细胞凋亡的增强，因此以Nrf2/HO-1通路为研究对象，可为防治血糖波动造成的血管损伤提供新的探索思路。目前已知，内皮细胞的凋亡可能是导致糖尿病慢性血管疾病发展期间动脉粥[35]样硬化的重要原因之一。NaWu等研究发现，波动性高血糖能诱导主动脉血管内皮细胞凋亡和功能障碍，减少细胞凋亡相关基因B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）水平，提高B细胞淋巴瘤相关蛋白X（Bax）线粒体易位和caspase-3p17蛋白水平；升高血清中MDA和8-iso前列腺素（8-isoprostaglandin）的水平、血清和血管内皮细胞中的炎症因子；并诱发β细胞功能障碍和胰岛素抵抗。说明内皮细胞凋亡和功能障碍可能是由于氧化应激和炎症反应所引起，但是也有可能是继发于胰岛素抵抗和β细胞功能障碍等。4.2.4血糖波动的药物治疗和局限性目前，针对血糖波动的管理主要针对降低餐后高血糖、减少低血糖，提高血糖稳定性。主要包括饮食控制、口服降糖药物和胰岛素治疗。①治疗血糖波动的第一策略是从饮食做起。摄入大量纤维，减少糖的吸收，优先摄取低升糖指数的碳水化合物，是控制血糖变化的最主要方法。②阿卡波糖能减少T1DM患者的MAGE，显著减少葡萄糖波动，这一结果在T2DM中表现得更为明显。当与格列本脲联合使用时，不仅改善了餐后血糖波峰，而且更大程度地改善血糖波动，这些结果的改善比单用格列本脲效果更为明显。③二肽基肽酶-4抑制剂，钠-葡萄糖协同转运蛋白2抑制剂和胰高血糖素样肽-1受体激动剂已经证实在诸如葡萄糖漂移的平均幅度和CGM的标准偏差等方面有显着的改善[36]。西格列汀降低葡萄糖波动的更大影响可能与葡萄糖依赖性降低作用机制有关，而对血糖浓度不敏感的磺酰脲增加血糖波动的风险。④关于胰岛素的应用，超短效人胰岛素类似物，包括赖脯胰岛素和门冬胰岛素，以其“起效快，达峰早，64 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文峰值高，作用持续时间短”的特点，能更好地模拟正常生理性餐时胰岛素分泌，能更好控制餐后血糖波动。长效.胰.岛.素.类.似物.，如.甘精.胰岛.素，由.于.皮下注.射吸收缓慢，.作用.平.稳.且持久.，模.拟.了生理.基.础胰岛.素.的.分.泌.，因此.能.更好地控.制.空腹高血糖.，.显.著.降.低血糖.波动.。超长效胰岛素类似物，德谷胰岛素，在T1DM和T2DM患者中表现出平稳降糖的作用，与胰岛素的其他替代物相比，其胰岛[37]素作用的变异性较低，这可能对血糖控制的稳定性具有临床优势。应用胰岛素泵持续皮下胰岛素输注（CSII）在控制血糖波动方面效果显著，基础率设置较为灵活和可调节的餐前大剂量，能更..好.地..模..拟..正..常.人..体胰..腺..的..胰..岛.素.分.泌..模式[38]。常规西药降糖虽然在一定程度上能达到降低血糖波动幅度的作用，但是存在血糖控制越严格，低血糖事件的发生率越高，并且存在胃肠道不适、致敏性等不良反应。甚则血糖波动虽得到控制，而糖尿病的血管并发症依然存在持续性进展。而中药的调节作用有异于西药降糖的强制性，其特点在于整体调节，通过纠正各种病理因素而达到机体内环境的平衡，并且在防治糖尿病血管并发症有其优势作用。4.3本实验动物模型的评价4.3.1动物种属的选择实验动物模型是根据具体实验要求而选择，本实验对模型动物的要求要同时具备糖尿病和动脉粥样硬化。符合2型糖尿病血糖不稳定的特点，且满足较多的取血量与主动脉取材。从与人类心血管和内分泌系统发育相似的角度，Yorkshire猪、尤卡坦小猪、贵州小香猪和恒河猴都是研究糖尿病大血管病变的良好模型种[39-41]属。由于这些动物价格偏高，个头大，不便管理。家兔不易自发性产生动脉粥样硬化，小鼠体积较小，其主动脉样本无法满足所需检测。目前常选择大鼠作为在糖尿病大血管病变的研究对象。综上所述，所以本实验选择大鼠为研究对象。4.3.2动物模型的选择建立糖尿病动物模型的方法分为以下几种：①化学药物所致糖尿病动物模型：链脲佐菌素诱导建立2型糖尿病模型：链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）是一种药效强大的烷基化剂，能干扰葡萄糖的转运，影响葡萄糖激酶功能，诱导DNA双链的断裂。四氧嘧啶（alloxan，ALX）65 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文是胰岛β细胞毒剂，可通过氧化-SH基团，抑制葡萄糖激酶，产生自由基，干扰[42]细胞内钙稳态，选择性损伤胰岛β细胞，导致胰岛素缺乏。四氧嘧啶和STZ被认为是目前用于糖尿病研究的最有效的糖尿病药物。这两种化学物质都被用作细胞毒性葡萄糖类似物，倾向于通过葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）积累在胰腺β细胞中。高脂饲料加小剂量STZ联合诱发是最常用的造模方法。化学药物诱导法致死率较低，造模成本相对降低，耗时短，操作方法液容易掌握。但此法直接对胰岛β细胞造成损伤，导致胰岛素分泌相对不足，不是造成胰岛素敏感性不足的模型，且由于动物长期自发再生胰岛β细胞可导致模型不够稳定，不适于长期实验，且所用试剂对主要脏器有一定毒性。②饮食所致糖尿病动物模型：给予实验动物过量的高脂、高糖和高蛋白饮食，使动物的β细胞负荷过重而出现萎缩，从而出现以胰岛素抵抗为特征的2型糖尿病动物模型。高脂饮食诱导建立的2型糖尿病模型既能较好的表现出与人类相似的发病症状，又不会因化学试剂诱导而导致体内重要器官受损，被广泛用于多种病因病理，特别是因营养过[43]剩导致的2型糖尿病。高脂饮食符合饱和脂肪，通过扩大白色脂肪组织（WAT）促进体重增加，改变脂质体内平衡，脂肪细胞分化和存活。WAT扩张促进了炎症状态和白细胞浸润。慢性暴露于高脂肪饮食（HFD）会引起肝损伤，葡萄糖稳态受损，代偿性高胰岛素血糖以维持初期正常血糖，晚期胰岛β细胞分泌胰岛素缺乏归因于胰岛β细胞衰竭和伴随的高血糖症，这正是T2DM的主要特征。但是可能由于饲料配比以及实验动物品系不同，成模特征及成模时间不尽相同，会[44]有造模不成功达不到T2DM的可能。④自发性糖尿病动物模型：.自发性糖尿病动物模型，是指动物自然发生的或通过遗传育种培养而保留下来的较理想糖尿病动物模型，减少人为因素干预，其发病过程和临床特征更接近于人类疾病，常见的有GK大鼠和ZDF大鼠（ZuckerDiabeticFattyrats）。Zucker大鼠发现于1961年在Merck（M-菌）和Sherman鼠交叉后。其特征[45]是突变的瘦素受体，诱导过度食欲，大鼠在4周龄时肥胖。这些大鼠存在高[46]胰岛素血症，高脂血症和高血压，并显示葡萄糖耐量受损。瘦素受体的纯合变（fa/fa）导致雄性大鼠在喂食高能量啮齿动物饮食时发展为2型糖尿病。66 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文GK大鼠是1975年Goto等人在日本仙台，从211个Wistar大鼠中经口服糖耐量实验（OGTT）选出18个轻度糖尿病减退鼠，经10代左右反复选择高血糖鼠交配，形成了与人类2型糖尿病近似的自发性非肥胖2型糖尿病鼠种，简称GK大鼠（Goto-KakizakiRat）。该鼠种主要表现为葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损，[47]β细胞分泌受损，血糖轻度升高，胰腺β细胞团块量减少，肝糖原生成增多，肝脏、肌肉和脂肪组织中度胰岛素抵抗等特点，长期患病后，出现各种并发症和[48]神经系统疾病。实验表明，GK大鼠保持了轻度升高的血糖，空腹血糖水平在6~8mmol/L，非空腹血糖（包括23周龄时1日内多点非空腹血糖及34～35周龄期间进食后血糖）约在9~16mmol/L波动。葡萄糖刺激的胰岛素分泌曲线示早期相分泌基本消失，晚期相分泌代偿性增加，具有2型糖尿病特点。GK大鼠具有稳定的生物学特性，较高的存活率，及其血糖升高与胰岛素分泌特点使其成为研[49]究人类2型糖尿病的良好模型。GK大鼠模型暴露于慢性高血糖（葡萄糖毒性）可能进一步损害β细胞功能和胰岛素作用，并有助于高血糖的发展。GK大鼠胰岛可能发展成所谓的海星状胰岛，其特征在于具有明显纤维化的内分泌细胞链分离的结构被破坏，使得胰岛类似于海星的外观。这些改变不存在于年轻GK大鼠的胰腺中，但随着衰老的发[50]生率增加。在成年GK大鼠中，总胰腺β细胞量和胰岛素储存量同样下降60％[51-52]。在断奶后，GKβ细胞对葡萄糖刺激的胰岛素分泌的显着改变发生与暴露于糖尿病环境相关。胰岛功能的这些变化可能至少部分是由于长期暴露于甚至轻度慢性高血糖症和升高的血浆非酯化脂肪酸的β细胞的分化丧失，这一过程被称为“糖脂毒性”。GK大鼠呈现了T2DM的所有典型特征，例如胰岛素抵抗，胰岛素分泌不足，[53]空腹高血糖/高胰岛素血症和血脂异常，具有波动性高血糖的特点。采用自发性2型糖尿病动物GK大鼠的基础上，饲喂高脂饲料，模拟2型糖尿病过食肥甘厚味之病因，建立模型，该模型与为研究2型糖尿病血糖波动的可靠模型。4.3.3糖尿病大血管病变模型糖尿病动脉粥样硬化的造模方法主要有：机械损伤法、饮食诱导法、药物诱导法、免疫法。机械损伤法：是指用机械方法损伤血管内皮后，导致一系列炎症级联反应，动脉粥样硬化的发生具备了条件，加高脂饮食饲喂，可以大大加快动67 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文脉硬化的形成。但手术创伤较大，容易导致动物死亡。饮食诱导法：用猪油、猪胆盐、胆固醇等原料制成高脂饮食，为了促进病变形成，还可以加用抗甲状腺素[54]药物及维生素D等，喂养一段时间后造成动脉粥样硬化模型。此法简单易行，且与人类动脉粥样硬化高脂高胆固醇饮食的病因相类似。药物诱发法：是将胆固醇-脂肪乳剂、同型半胱氨酸或N-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）等注射或加入饮用水等方法进入动物体内后产生动脉粥样硬化。免疫法：用注射血清、经鼻腔感染肺炎衣原体、注射卵白蛋白、注射VEGF165等免疫手段建立动物模型。本实验采用高脂饮食诱导法，利用长期高脂饲料喂养加重GK大鼠的胰岛素抵抗，造成血糖的不稳定状态，并促进血管病变的形成。符合T2DM存在内在基因易感性和外在高脂饮食诱导而发病的特点。4.3.4本实验动物模型的评价自发性糖尿病GK大鼠进行适应性喂养4周，给予高脂饲料，测两次随机血糖≥11.1mmol/L纳入本实验，后在药物干预的同时，持续给予高脂饲料，建立糖尿病大血管病变模型。给予高脂饲料后，模型组GK大鼠饮水量明显高于Wista正常组大鼠，体重低于正常组。饲喂高脂饲料12周后（其中后8周同时给予药物干预），总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）明显高于正常组；胰岛素水平下降，胰高血糖素水平升高，超敏C反应蛋白（CRP）高于正常组。同时在高脂饲料饲喂8周，12周后，平均血糖水平（MBG）、平均血糖的标准差（SDBG）、最大血糖波动幅度（LAGE）均高于正常组，血糖波动较为明显。通过病理观察：模型组腹主动脉出现内膜不光滑，内皮细胞部分破坏，可见少量附壁细胞；中膜弹力纤维层及其细胞核均排列紊乱，血管壁变薄（总厚度）；胰腺组织病理形态：胰岛分布与胰腺周界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积），可见胰岛含铁血黄素沉积。通过腹主动脉和胰腺组织病理学形态观察，可见腹主动脉存在内皮细胞损伤，结构发生变化，胰腺组织胰岛有炎症反应和损伤。综合以上论述，说明GK大鼠结合高脂饲料喂养成功建立了2型糖尿病同时伴有血糖波动的大血管病变模型。4.3.5阳性对照药的选择阳性对照药物的选择原则要在了解药物安全性、有效性的前提下，根据实验目的及要求，遵照实验对照选出公认有效的药物。本实验所选择的是应用较为广68 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文泛的DPP-IV抑制剂西格列汀。二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂通过抑制体内GLP-1分解代谢而起到降糖的作用，已经成为治疗T2DM的重要措施。西格.列汀.通过.选择性抑制.DPP-4的活性.，减少胰.高血糖素样肽.1（GLP-1）.在体内的.失活.，进而增.加患者.体内的.GLP-1水平.，后.者通过葡.萄糖浓度.依赖.的.方式促进胰岛.β细胞分.泌胰岛素.，同时抑制α细胞.对胰.高血糖.素的.分泌.。西格.列.汀.用.于.本.实验.研.究中，.除了.能.降低.血糖，而无体重增加和低血糖风险以外，还具有以下几个特点。4.3.5.1减少血糖波动临床实验研究发现，西格列汀或维格列汀治疗均可显著减低颈动脉内膜中层厚度（IMT）。IMT的降低与平均血糖波动幅度（MAGE）的变化显著相关，而与HbA1c的变化不相关。.还.发.现.M.A.G.E.、.I.M.T.和.空.腹.、餐.间.炎症.评.分.和.血.浆.硝.基酪.氨.酸.水.平.之.间.显著.相.关。因此.，可以.得出.结论，.DPP-4抑.制.剂.可.降低.血糖.波动，并.且很.可能..通过.减轻.炎症和..氧化应.激.预防T2DM患者.动脉粥样硬化的.[55]进展..。4.3.5.2改善胰岛细胞功能胰岛β细胞功能障碍是T2DM发病的主要原因，一些报道显示DPP-4抑制[56]剂对β细胞功能有保护作用。YuyaTsurutani等评估西格列汀在日本2型糖尿病患者中对动脉粥样硬化，β细胞功能和血糖控制的临床疗效和安全性。研究表明，西格列汀显著改善日本新诊断或控制不良的T2DM糖尿病患者的血糖水平，降低血管特异性炎症标志物正五聚素-3（pentraxin-3（PTX3）水平和β细胞功能标志物胰岛素原/胰岛素（PI/I）比率，升高的PI/I比率反映了β细胞功能障碍。表明西他列汀可能对日本2型糖尿病患者的血管炎症和β细胞功能有益。[57]Maiztegui等研究发现，西格列汀具有双重激素调控作用，通过.延缓.胰岛.β细胞的凋亡.来上调.其在胰岛.中的.比例，同时抑.制.胰岛α细胞.的增.殖，从而延.缓糖尿病的.进展。4.3.5.3减少氧化应激高血糖状态下，过多内源性活性氧（ROS）长时间的积累，导致葡萄糖毒性，又由于胰岛内在的抗氧化酶水平低，特别容易受到ROS的影响，导致胰岛素基因表达.的异常.以及.胰岛.素含.量和.胰岛素.分泌.的降.低，导致胰岛β细胞功能下降，69 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[58]细胞凋亡增加，胰岛素水平不足，血糖调节能力下降，容易导致血糖波动。研究表明长期使用西格列汀能干扰.氧.化.应.激.信号转导.途.径.，抑.制.糖.尿.病.大.鼠.胰[59]腺.组.织.氧.化.应激反应.，.减少.氧.化.应激.对.胰岛.β的.损伤.，改善.胰.岛功能。4.3.5.4降低炎症反应目前的文献认识到慢性低度亚临床炎症是胰岛素抵抗的一部分，并且与代谢[60]综合征的特征密切相关。炎症过程参与了糖尿病微血管并发症包括糖尿病肾病和视网膜病变，炎症因子在动脉粥样硬化血栓形成中发挥重要作用。纠正炎症可能阻止和改善糖尿病及其相关并发症。西格列汀显著降低的低度炎症：血浆C反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-18（IL-18）、分泌型磷脂酶-A2（sPLA2）和细胞粘附分子，包括可溶性细胞间粘附分子-1和E-选择素[61]（E-selectin）的标记物的血浆水平。4.3.5.5改善动脉粥样硬化DPP-4抑制剂可以发挥抗动脉粥样硬化作用，包括降低收缩压，改善餐后血脂参数，减轻沉默性炎症，降低氧化应激和改善内皮功能障碍。DPP-4抑制剂对[62]动脉粥样硬化和炎症的作用是通过抑制单核细胞活化和趋化作用。T2DM是心血管疾病（CVD）的危险因素。颈动脉内膜中层厚度（IMT）及其发展被认为是动脉粥样硬化进展的标志。最近的研究已经对严格血糖控制对晚期动脉粥样硬化或长期T2DM患者的CVD的益处产生怀疑。特别是使用强化胰岛素严格控制血糖会增加低血糖和体重增加的风险，这可能会降低其有益效果。因此，通过刺激内源性葡萄糖反应性胰岛素分泌而降低胰岛素剂量，并使用口服降糖药（OHA）增加胰岛素敏感性可减少胰岛素疗法的不良反应，并且是预防动脉粥样硬化进展的有前途的策略。TomoyaMita等报道，与常规治疗相比，在使用胰岛素的T2DM患者中添加DPP-4抑制剂西格列汀，结果与传统治疗（非西格列汀组）相比，西格列汀具有更强的降糖作用，而没有增加低血糖发展和体重增加，同时减少了[63]患者颈部IMT的进展。综上，西格列汀能减少血糖波动，而无体重增加和低血糖风险，安全性较好。在减少氧化应激和炎症反应，保护胰岛功能，改善内皮功能障碍，改善动脉粥样硬化等方面都有突出表现，故选择西格列汀为阳性对照药物，符合本次实验目的和要求。70 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文4.4参芪复方减少血糖波动改善糖尿病大血管病变的配伍思想参芪复方是导师谢春光教授经多年实践并行之有效的经验方，具有养阴益气活血之功，经前期临床及实验研究，已经证明参芪复方具有减少血糖波动、平稳降糖的特点，能减轻糖尿病大鼠动脉粥样硬化的病理改变程度，有效防止糖尿病大血管病变及其并发症的发生发展。该方.由.人.参.、黄.芪.、山.药.、山.茱萸.、生.地.、天.花粉.、丹.参.、制.大.黄.组成.，.现将其中医机理分析如下。4.4.1大补元气，助脾散精本方采用人参、黄芪为君，大补元气，助脾散精，促进水谷精微及津液布散，并能推动血液运行。人参，甘，微苦，平，归脾、肺、心经，能大补元气，补脾益肺，生津，安神益智。人参既能补益肺脾肾之气，又能生津止渴，故治疗消渴方中常用。张锡纯《医学衷中参西录》中云：“盖人参之性.，大能补气.，元气旺而上升.，自无下陷之虞……助元气以生津液.。”“故用人参以大补元气，扶正即以胜邪也”。本方以黄芪为君，一则扶正祛邪，符合消渴病本虚标实的根本病机；二则气对津液的作用，气能生津，气化作用是津液生成的动力，气能行津，也是津液在体内正常输布运行的动力，气能摄津，能控制津液的排泄，防止其无故流失，包括消渴病之尿频量多，尿糖，尿如脂膏；三则补益脾气，助脾散精，“治脾即是治胰”，恢复“血糖”的正常布散；四则大补元气，元气足则阴火消，则精微能升举，阴火自消除。可见人参在此方当中的重要地位。黄芪，甘，微温。归脾、肺经。《神农本草经》将其列为“上品”，为补药之长，《本草备要》言其：“益元气，壮脾胃。”现代很多的糖尿病病人，初始发现糖尿病时，并无明显“三多一少”症状，而是有体型肥胖，疲倦倦怠，懒言少动，大便稀溏，舌质淡胖，脉弱无力等一派脾虚表现。在本方中的作用，黄芪补益元气之力不及人参，但长于补中益气，升阳举陷。《医学衷中参西录》中言：“人参、黄芪皆补气兼能升气者也，然人参补气之力胜于黄芪；黄芪升气之力胜于人参。故大气陷而气分之根柢犹未伤者，当用黄芪；大气陷而气分之根柢兼伤损者，当用人参。”人参与黄芪配伍，相辅相成，共同补益元气，升阳举陷。黄芪更着重补益肺脾之虚，从根本上改善肥胖型2型糖尿病一派的脾虚症状，亦能大补肺气以益肾水之上源，使气旺而津液生。自糖尿病发病之始，因水谷精微不能被充分利用，化为“糖浊”，阻碍血行，致血行不畅，日久成瘀，黄芪可71 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文助气行血，减缓糖尿病并发症的发生发展。《.医.学.衷.中.参.西录.》“.滋.膵.饮”中就“.以.黄.芪.为.主.药，.为.其.能.助.脾气.上升.，还..其.散.精.达.肺.之.旧.也”。4.4.2养阴生津，清热润燥山药、山茱萸、生地、天花粉共为臣药。山药，甘，平，归脾、肺、肾经。具有补脾益胃，生津益肺，补肾涩精之功。《神农本草经》记载.山药“补中，益气力.，长肌肉。”《本草纲目》记载，其“益肾气，健脾胃”。张锡纯谓其“色白入肺，味甘归脾，液浓益肾。”补益肺脾肾之气，滋养肺脾肾之阴，“滋膵饮”中，论山药“以其能补脾固肾，以止小便频数，而所含之蛋白质，又能滋补膵脏，使其散膏充足，且又色白入肺，能润肺生水，即以止渴也。”山茱萸，酸，涩，微温。归肝、肾经。具有补益肝肾，收敛固涩之功效。山茱萸在本方中中的作用，①作收敛封藏之功，张锡纯谓“山茱萸味酸性温，大能收敛元气，振作精神，固涩化脱”，其固涩滑脱之功，远过于参芪。“参、芪、术诸药皆补助后天气化之品，故元气之将脱，但服补气药不足恃，惟以收敛之药为主，若萸肉、龙骨、牡蛎之类，而以补气之药辅之。”“滋膵饮”中以干生地助肾中之真阴，上潮以润肺，协同山萸肉以封固肾关。②具条畅之性，《医学衷中参西录》中有“山萸肉……因得木气得厚，收涩之中兼具条畅之性，故又通利九窍，流通血脉……”，“山茱萸得木气最厚，酸收之中，大具开通之力，以木性喜条达故也，《神农本草经》谓主寒湿痹，诸家本草多谓其能通利九窍，其性不但补肝，而兼能利通气血可知。”山茱萸不仅能补肝肾以治消渴之本，更能收敛元气，封藏肾精，以消阴火，固精微，还能通利九窍，流通气血。生地，甘，苦，寒。归心、肝、肾经。能清热凉血，养阴生津。甘寒质润能养阴生津止渴，苦寒泄热，入肾经而滋阴降火，养阴津而泄伏热，治疗阴虚内热之消渴。天花粉，甘，微苦，微寒，归肺、胃经，能清热泻火，生津止渴，消肿排脓。《本草汇言》云：“其性甘寒，善能治渴，从补药而治虚渴，从凉药而治火渴，从气药而治郁渴，从血药而治烦渴，乃治渴之要药也。”《神农本草经》云其“主消渴，身热，烦满大热，补虚，安中，续绝伤。”天花粉清肺胃二经实热，生津润肺燥，治疗积热内蕴，化燥伤津之消渴。4.4.3活血通脉，祛瘀生新72 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文丹参，苦，微寒，归心、心包、肝经。具活血调经，祛瘀止痛，凉血消痈，除烦安神之功。《本草便读》云：“丹参，功同四物，能祛瘀以生新，善疗风以散结，性平和而走血……为调理血分之要药。”瘀血是贯穿糖尿病发病始终的重要病机，水谷精微不能被正常利用，反流入血，积于脉、络之中，阻碍血行，易滞为瘀；气虚推动无力易成瘀；阴虚内热，耗伤津液，亦使血行不畅而为瘀；阴损及阳，痰湿阻滞而成瘀；糖尿病病血管并发症的中医病机是以血脉涩滞，瘀血痹阻为核心，因此丹参走血分，活血行血，延缓糖尿病并发症的发生发展。大黄，苦，寒，归脾、胃、大肠、心包经，有泻下攻积，清热泻火，凉血解毒，逐瘀通经之功。大黄生用泻下力强，入汤剂应后下，酒制后泻下力较弱，活血作用较好。本方所用为制大黄。《神农本草经》谓其：“下瘀血，血闭寒热，破.㿂瘕积聚，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新。”制大黄，性苦寒，用于糖尿病能清中焦郁热，并能通腑泻浊，推陈出新，活血化瘀。临床上多用于“浊[64]毒内停”的糖尿病肾病的治疗。药对分析：大黄配人参：攻补兼施，益气活血。大黄清泻为功，既能泄热通肠，又能凉血止血，破瘀行血。人参大补元气，益血生津，为虚劳内伤第一要药。大黄泻下通便以攻邪，人参益气生津以培其本。二药合用，相反相成，攻补兼施，益气活血，泻浊解毒。其特点如徐灵胎所言：“如大黄与人参同用，大黄必然逐去坚积，决不反伤正气，人参自然充盈心气，决不反补邪气。”适用于消渴病，本虚标实，阴虚内热，浊毒内蕴的病机特点。大黄配丹参：大黄破瘀消积，荡涤瘀热，丹参活血化瘀，二药均性善走，一破一化，相得益彰，其破血化瘀之功益著。大黄配地黄：大黄苦寒直折，藉涤荡以祛瘀。善清泻血分实热，凉血止血，祛瘀止血。地黄甘寒毓阴，凭凉营以止血，养阴以清热。两者相伍：地黄守而不走，大黄走而不守。地黄补其虚，大黄泻其实。两者配用，奏养阴清热，逐瘀泻热之功。大黄配黄芪：大黄荡涤胃肠之积滞，凉血解毒，活血化瘀。黄芪补益脾肺元气，益气升阳，托毒运毒。二药攻补兼施，[65]振奋肾气，益气摄精，升清降浊。黄芪配山药：黄芪甘温，补气升阳，利水消肿，既能鼓舞胃津上升，又能统摄下元气化，故善治消渴，偏于补脾阳；山药甘.平，补脾养肺，养阴生津，益肾固精，而侧重于补脾阴。二药伍用，一阳一阴，阴阳相合，相互促进，相互转化，共收健脾胃、促运化，敛脾精、止漏浊，消除尿糖之功。此配伍为施今墨73 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[66]先生临证经验所得。纵观全方，药味不多，但配伍紧凑，各司其职，能补益能收敛，能滋阴亦能降火，能活血而不伤正。参芪复方以补益脾气为根本，使脾气得运，精微得布，恢复中焦升清降浊之功，扶正以祛邪；同时养脾肺肾之阴，清热以润燥，生津以助血行；辅以活血化瘀，祛瘀以生新。实为临床治疗糖尿病及其并发症加减运用之良方。4.5养阴益气活血法减少GK大鼠血糖波动的机制探讨4.5.1养阴益气活血法发挥作用的宏观指标评价4.5.1.1改善GK大鼠的一般状态GK大鼠躯干部分浅棕黄色，头部、四肢白色，Wistar大鼠毛色较白且更有光泽。适应性饲养一周，GK大鼠精神状态较好，皮毛光亮，反应敏捷。造模开始，与正常Wistar对照组相比，GK大鼠饮水量偏多，摄食量偏少，体重偏低。各组GK大鼠，随周龄增长，出现精神萎靡，反应迟缓，动作缓慢的现象。GK大鼠随着造模时间的延长，一般状况较差，比如毛色变黄、无光泽、精神萎靡，动作缓慢，而中药组大鼠毛色色泽及精神状态较模型组为佳。各组GK大鼠体重呈逐渐增长趋势。参芪复方中剂量组摄食量较模型组低，说明中药中剂量组可改善GK大鼠的多食表现。模型组大鼠的饮水量较大，中药组能改善GK大鼠的多饮表现。4.5.1.2改善脂质代谢模型组大鼠伴有胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的升高，中药组能明显改善GK大鼠的血脂水平。脂代谢和糖代谢密切相关，T2DM大约有50%的患者合并有血脂异常，其典型的血脂异常表现为.甘.油.三.酯.水平.升高.、.高密度脂蛋白.胆固醇.水平.降.低.、.小.而.密.低.密.度.脂蛋.白.水平.升.高，此即糖尿病脂质三联征（lipidtriad），又称动脉粥样硬化血脂谱。血甘油三酯和小而密低密度脂蛋白水平的异常升高会改变细胞内L.-.精.氨.酸.通路.或.N.O.释放.，.使.e.NOS.产生.过氧化.自.由基.，.导致.NO.失活，造成.明.显.的.内.皮.依.赖.性.血管舒张.功能.受.损.，从而参与动脉粥样硬化[67]的形成。4.5.1.3调节胰岛素、胰高血糖素分泌、胰高血糖素样肽-174 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文模型组GK大鼠血清胰岛素（INS）水平下降，胰高血糖素（GC）水平明显升高，中药组的血清胰岛素高于模型组，但是统计学上不明显，西药组具有更高的胰岛素水平。中药高剂量组及西药组均能降低胰高血糖素水平。说明中药组和西药组能调控GK大鼠胰岛素、胰高血糖素分泌。T2DM血糖代谢紊乱的重要原因是胰岛β细胞胰岛素分泌缺陷和α细胞胰高血糖素分泌增加，即“双激素异常”学说。胰岛素和胰高血糖素是一对相互拮抗对立的激素，两者相互协同共同调节血糖水平，任何因素造成的二者比例失衡，均可促进糖尿病的发生。胰高血糖素样肽-1（GLP-1）可促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌、抑制胰高血糖素释放，是目前备受关注的“肠-胰岛轴”中调节血糖平衡、减少血糖波动的重要激素。GLP-1还可促进胰岛β细胞增殖，并抑制其凋亡，并增加胰岛β细胞的数量，改善胰岛[68]功能。本实验证实了作为DPP-4抑制剂的西格列汀具有双向调节胰岛素和胰高血糖素水平，提高GLP-1水平，发挥其减少血糖波动的功效，同时参芪复方组也具有该作用，而功效不如西格列汀组明显。4.5.1.4降低血中CRP水平模型组GK大鼠出现血清CRP水平升高，中药组及西药组能明显降低GK大鼠的炎症反应。CRP为代表性的炎症细胞因子，能损伤血管内皮细胞（VECs），能通过多种生物活性促进动脉粥样硬化的发生发展。CRP不仅是一个代表性的炎症细胞因子，还是AS发生发展活性介导剂，它通过上调上皮细胞通透性，促进内皮细.胞.粘.附.分子.表.达.，.固.定.补.体.，.募.集.单.核.细.胞.和.巨噬细胞.到.血管.内皮.炎症.中心.，.以及.激活.局部.血小板.和.血.栓.形成，.C.RP.也参与泡沫细胞..形，它.具有.高.的.亲和性.与.Ox-L.D.L结.合.，由此形成..CRP.-LDL聚.合.物.，在体.外.被.巨噬细胞.主动吸收。总之，.这些发现..说明.C.R.P.能.通过.放大.和.加重.局部.炎症.过程.，在斑块..水平[69]上直接.介.导.血管.组织.损伤，因此，有.文献.报道.靶.向.C.RP.可以.预防.和治疗.AS。可见中药组和西药组都能在一定程度上降低血中CRP，从而减低血管炎症反应，减缓糖尿病血管并发症。4.5.1.5减少血糖波动在未给予药物干预之前，GK大鼠的血糖波动幅度较为明显。经药物干预4周后，GK大鼠各组的平均血糖水平（MBG）、平均血糖的标准差（SDBG）、最大血糖波动幅度（LAGE）均较正常组较高，说明血糖波动幅度较大。中药高剂75 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文量组的MBG低于模型组，中药中剂量组、高剂量组的SDBG低于模型组，中药各剂量组的LAGE低于模型组。表明参芪复方组和西格列汀组均能减少血糖波动。4.5.1.6改善大鼠腹主动脉内皮损伤从大鼠腹主动脉病理形态学的观察，参高组、参中组发挥了改善血管内皮损伤的良好作用，西药组次之，参低组血管内皮损伤的程度较参高组、参中组、西药组重，较模型组轻。综合表明，参芪复方高、中剂量组、西药组在改善主动脉病理形态方面效果较佳。4.5.1.7改善大鼠胰腺组织损伤从大鼠胰腺组织的病理形态学观察，模型组大鼠胰腺分布与胰腺周界不清，少量淋巴细胞浸润，及大部分胰岛细胞均一红染（玻璃样变，糖原沉积）。说明模型组有胰岛炎症反应和胰岛损伤。参高组和参中组能减轻胰岛炎症反应和损伤。从宏观评价指标上可见，养阴益气活血法具有改善糖尿病GK大鼠多饮、多食表现，能降低血糖波动，调节血清胰岛素、胰高血糖素水平，提高GLP-1的分泌，降低血中CRP水平，减轻胰腺组织胰岛炎症反应和损伤，减轻腹主动脉血管内皮损伤。综合以上宏观指标的改变，本实验通过基因芯片技术对大鼠胰腺组织的基因表达结果进行分析，以探索养阴益气活血法通过对胰岛细胞的保护作用以减少血糖波动的基因机制。4.5.2养阴益气活血法减少血糖波动的微观机制分析糖.尿.病.是.一.种.遗.传.因素.和.环境因素.共同.作用.，使.胰岛素.绝对.或.相对.分泌.不足.，临.床.上.以.高血糖.为.主要.表现.的.全身.代谢.紊乱性.疾病.。基.因.芯片.技术.以其..高.通量、并行性.以.及.样本.消耗量.少的..优点，.为.糖尿病.的.中医药.研究.提供.了.一.种先进的.研究.方法。应用基因芯片技术，将宏观的外在体现与微观的机理结合起来，通过对糖尿病GK大鼠基因表达谱的分析，在多基因基.础.上.对.中.医药.干.预.前.后.做.深入.的.研究.和.分析.。以下从两个方面分析养阴益气活血法改善胰岛细胞功能减少血糖波动的基因机制。4.5.2.1mTOR信号通路与糖尿病胰岛β细胞功能的相关性分析通过对参芪复方中剂量组VS模型组的pathway富集分析结果分析，差异基76 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文因富集的主要pathway有mTOR信号通路，富集的差异基因Pik3r1、Ddit4表达上调。富集的GO：TOR信号的负调控、调节磷脂酰肌醇3-激酶活性。又根据mTOR是细胞在适应生理条件和环境压力过程中调控生长和自噬平衡的关键组分，mTOR信号通路与细胞自噬有着非常密切的关系。可推理得出，Pik3r1、Ddit4通过抑制mTOR，激活自噬，从而对胰岛β的功能发挥保护机制，现分析如下，4.5.2.1.1氧化应激导致糖尿病胰岛β细胞功能障碍模型组VS空白的GO分析可见，涉及的生物学过程有白细胞增殖、单核细胞增殖、白细胞细胞黏附、细胞迁移、对硒离子的反应、谷氨酰胺家族氨基酸分解代谢过程等。结合胰腺组织病理形态分析，模型组VS空白组胰岛分布与胰腺界限不清，可见少量淋巴细胞浸润，并有玻璃样变和胰岛含铁血黄素沉积，均为炎症损伤的表现。宏观病理分析与基因芯片的GO分析可得，模型组大鼠的胰腺组织存在波动性高血糖、高脂造成的氧化应激损伤。氧化.应.激（oxidativestress）是.机体.在.遭受.各.种.有.害.刺激.时，体.内.高.活性分子.，如ROS产生.过.多，氧化.程度.超过.氧化物.的.清除.，氧化.系统.和.抗.氧化.细.胞失衡，从而.导.致组织.损伤。胰腺β细胞是人体中代谢活性最旺盛的组织，高度依赖于对三磷酸腺苷（ATP）合成氧化代谢，特别是在升高的葡萄糖浓度中，事实上，[70]在高葡萄糖水平时升高的氧消耗量也是刺激胰岛素分泌的关键。因此，胰岛[71]被有效地灌注血液，胰岛虽然只占据了胰腺体积的1-2%，但却接收了胰腺血[72][73]液供应的15%，每个胰岛β细胞都与内皮细胞直接接触。高血糖状态下，葡萄糖刺激过程中线粒体呼吸产生过多的内源性活性氧（ROS），导致葡萄糖毒性，又由于胰岛内在的抗氧化酶水平低，特别容易受到ROS的影响，导致胰岛基因表达的异常以及胰岛素含量和胰岛素分泌的降低，导致胰岛β细胞功能下降，细胞凋亡增加，胰岛素水平不足，血糖调节能力下降，容易导致血糖波动。同时高浓度的游离脂肪酸（FFA）也会诱导胰腺组织中ROS的产生。抗氧化策略[74]可以保护β细胞免受糖脂毒性的影响。如下图胰腺β细胞内ROS产生的一般[75]机制，77 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图28胰腺β细胞内ROS产生的一般机制如上图所示：胰腺β细胞内ROS的主要来源是线粒体呼吸链，位于线粒体[76]膜内的复合物I和III通过分子氧的单电子还原产生高反应性的超氧化物（O2-）离子，超氧化物由超氧化物歧化酶（SOD）同工酶转化成活性较低的过氧化氢（H2O2）。H2O2可通过水孔蛋白跨膜扩散并转化为高活性羟基（HO）。此外，过[77]氧亚硝酸盐（ONO2-）的形成是由于超氧化物与自由基一氧化氮（NO）的反应所致。除了线粒体生产外，ROS也由细胞质膜和质膜氧化还原酶产生，氧化[78]NAD(P)H并通过还原分子氧直接产生ROS。Superoxide：超氧化物；mitochondrial线粒体；superoxidedismutase：超氧化物歧化酶；glutathioneperoxidase：谷胱甘肽过氧化物酶。与营养过剩引起的氧化应激的高度敏感性相似，胰腺β细胞也容易产生缺氧[79]胁迫，这也矛盾地导致ROS产生和氧化应激的其他标志物。比较不同胰岛细胞类型对缺氧的敏感性表明缺氧导致β和α细胞中的严重功能异常，但与β细[80]胞的强烈凋亡损伤相比，α细胞显示出显着较低的凋亡率。在糖尿病前期Zucker肥胖大鼠胰岛中的基因表达谱显示缺氧相关基因的表达增加，并且进一步[81]调查显示胰岛血管内皮完整性的严重紊乱可能是缺氧发展的一个可能原因。[82]长时间的缺氧导致胰岛β细胞死亡，通常是坏死。氧化应激可造成DNA损伤，线粒体和细胞器的损伤，蛋白质错误折叠和神[83-86]经元突触功能障碍。氧化应激也导致T2DM小鼠动物模型中谷胱甘肽水平升[87]高和脂质过氧化增加。晚期糖基化终产物（AGEs），促进糖尿病并发症的发展，[88]导致ROS的释放和半胱氨酸蛋白酶激的活化。减轻ROS损伤的保护途径涉及78 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文维生素，辅酶Q10、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化歧化酶等。通过“自噬”可以消除错误折叠的蛋白质和无功能的线粒体以避免胰岛β细胞功能障碍和DM的发[89]作，通过对胰岛β的保护性机制减缓胰岛细胞功能障碍。4.5.2.1.2自噬对胰岛功能的保护性机制最早的研究证明自噬是一种应..激.应答.机制，通.过.回收.内.源.性.物.质.为.细.胞.提供.营.养.和.能量。根据.细.胞.内.底.物.运.送到溶.酶.体腔方式.的.不同，哺.乳.动物细胞自.噬.可分为巨.自噬（.macr.oautophagy.）.、微自.噬（mi.c.roautophagy.）和分.子.伴侣介导的.自.噬（chaperone-mediatedautophagy，CMA）三种主要方式，目前研究最广泛的是巨自噬。细胞自噬是细胞存活的双刃剑，是维持细胞生理和促进细胞存活的分子机制，当刺激超过阈值时，当刺激在一定阈值时，自噬促进细胞存活，当[90]刺激超过阈值时，促进细胞死亡。如下图所示。图29自噬的双向调节作用T2DM是以胰岛素抵抗和胰岛.β细胞分泌胰岛素不足为特征。在T2DM中，自噬不仅提供营养物质以在禁食期间维持细胞能量，而且还去除受损的细胞器，脂质和错误折叠蛋白质，使胰.岛.β细胞..免.受.糖.脂.毒性.等.有害.应.激.所.诱导.的.细胞凋亡.，.保持.胰岛.β.细胞.数量.上.的.稳定，.同.时.维持.胰岛.β.细胞.分.泌.能力.及.内环境.的稳定.，在胰岛.β.细胞.功能障碍和胰岛素抵抗中其重要作用，是胰岛β细胞的一种自我保护机制。已有研究报道证明，胰岛素抵抗状态下自噬的上调，当8周龄对照组和β细胞特异性自噬基因Atg7敲除小鼠高脂饲料喂食12周，在自噬基因敲除的小鼠79 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文中检测到更高的非空腹血糖水平和严重的葡萄糖耐量降低，同时伴有β细胞增殖[91]减少和凋亡增加，退行性空泡增加和p62免疫反应性增加。更重要的是，缺乏β细胞自噬的肥胖小鼠产生了严重糖尿病。这些研究揭示了自噬缺乏导致胰岛素抵抗状态下β细胞存活和功能恶化，并可能加速从高血糖状态进展至糖尿病。这就产生了一种假设，即自噬作为一种保护性机制在胰岛素抵抗状态下上调。又有实验证明，由mTOR抑制的自噬增强能改善FFAs诱导的细胞凋亡。从而得出结论，自噬可能对FFAs诱导的细胞死亡具有保护作用。在喂食高脂饲料的小鼠中，自噬显著上调，与非糖尿病小鼠对比，糖尿病小鼠的B细胞含有大量的自[92]噬体。更有证据支持，已经观察到高浓度下处理的大鼠胰岛增加的自噬流量，[93]阻断自噬降解增加了高糖诱导的细胞凋亡以上总结可得，自噬对于正常的胰[94]岛β细胞稳态，特别是β增殖/存活具有关键作用；自噬通过降解不必要的细胞成分对于维持β细胞的功能和结构是必不可少的；自噬可以在应激环境下（如胰岛素抵抗性条件下）诱导以保存胰岛β细胞；自噬的失调导致正常条件下β细胞增殖/存活和功能受损；自噬的失调加剧应激状态下B细胞功能障碍和死亡[95]。4.5.2.1.3mTOR信号通路与细胞自噬密切相关结合本实验，参芪复方中剂量组VS模型组的pathway富集分析结果分析，差异基因富集的主要通路有mTOR信号通路，差异基因为Pik3r1、Ddit4。mTOR是细胞在适应生理条件和环境压力过程中调控生长和自噬平衡的关键组分。mTOR信号通路与细胞自噬有着非常密切的关系。80 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图30mTOR信号通路图[96-97]mTOR是负责调解自噬的关键酶之一。mTOR主要通过激活蛋白质合成和响应包括生长因子，营养物质，能量状态和氧气水平在内的多种刺激物以调节[98]多种细胞功能的主要激酶。以两种复合物存在（mTORC1和mTORC2），迄今为止数据显示mTORC1参与自噬调节。在正常状态下，如足够的营养，mTORC1复合物（mTOR/GpL/Raptor/PRAS40）与ULK1复合物（ULK1/2－Atg13－FIP200－Atg101）相互作用以抑制自噬。当mTORC1复合物感受到来自缺氧、饥饿或低能量水平的基因毒性应激时，mTORC1从ULK1复合物解离并引发自噬。mTORC1复合物也受PI3K-1/Akt，MAPK/ERK和AMPK信号通路的调节。活化[99-100]的AMPK磷酸化Raptor并抑制mTOR，从而导致自噬的激活。PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）是细胞内重要的信号转导分子，它是脂质激酶家族的成员。根据结构性亚基、底物特异性的不同哺乳动物的PI3K家族可以分为I型、II型、III型。I型PI3K是由调节亚基p85α/β/γ和催化亚基p110α/β/δ/γ组成的异源二聚体，其中PI3K的两种不同型的调节亚基p85α和p85β是由基因pik3r1和pik3r2编码的。这些异构体显示不同的功能差异，影响和控制PI3K活性和信号传导。在静息状态下，PI3K的p85调节亚基用于稳定和灭活p110催化[101]亚基，能调节PI3K的活性。研究表明，p85α调节亚基可以通过对PI3K活性81 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文的直接作用以及间接机制抑制一些下游信号传导，即使与p110α共表达时，依然存在这种抑制，而与PI3K的活性无关。可能是由于调节亚基通过亚细胞定位于催化亚基或其他信号分子的相互作用而调节PI3K介导的信号，而不依赖于激酶[102]活性。因此，本实验pik3r1表达的上调，结合参芪复方组VS模型组差异基因富集的GO：TOR信号的负调控、调节磷脂酰肌醇3-激酶活性，分析可得通过pik3r1表达的上调，使p85α调节亚基表达上调，抑制PI3K/AKT通路，从而导致mTOR抑制，激活自噬对胰岛β细胞的保护性机制。REDD1（RegulatedindevelopmentandDNAdamageresponse1）被认为是缺氧、细胞铁损耗，DNA损伤等响应细胞多种应激物的关键应力调节蛋白。REDD1是线粒体氧化能力和脂肪生成的关键调节剂，调节胰岛素产生和分泌，特别是在肥胖和糖尿病状态中。REDD1在调节胰岛素敏感性和影响能量稳态的过程中发挥[103]重要作用。REDD1是mTORC1的有效抑制剂，通过TSC1-TSC2负调控mTORC1[104]复合体。REDD1也参与mTORC1的调控和内质网应激引起的自噬。综上，pik3r1、Ddit4在参中组VS模型组中表达上调，二者在mTOR通路上共同抑制mTOR，可以推测通过抑制mTOR，从而激活自噬，通过自噬可以消除错误折叠的蛋白质和无功能的线粒体，减轻氧化应激对胰岛β细胞的损伤，从而达到保护胰岛细胞功能性的作用。经定量PCR验证，pik3r1、Ddit4在参中组VS模型组中表达上调，且有统计学意义。4.5.2.2生物钟节律与糖尿病血糖波动有相关性根据本实验差异基因的GO分析，模型组VS空白组、参中组VS模型组、西药组VS模型组涉及的生物学过程均有昼夜节律，可见血糖波动有其昼夜节律性。4.5.2.2.1生物钟包括中央和外周生物钟几乎所有的生物都存在生命活动的昼夜节律（circadianrhythms），.这.是.机体.受.到.授时因子.（Zeitgeber，ZT，即可被生.物体.感知.的.有.节.律的环.境.信号，包括明.-暗..周期光信号..、环境.温度.、社交.刺激.、身体.运动.、饮食.等.因素）作用.而.与.环境.同步所致。我们将这.种.设定.并.调控.机体昼.夜.周期，乃.至.月周期、年.周期.[105]的生物..内源性系统..成为“生物钟”..，将这.些.周期性现象.称为.生物钟现象.。哺乳动物..的.生物钟系.统.主要包括.两类，中.央.和.外.周生物钟：位于.下.丘脑的.视交叉82 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文上核.（suprachiasmaticnucleus，SCN）的母钟（masterclocks）和存.在于.外周..组[106]织和.器.官的..外.周生.物钟（peripheralclocks），也叫子钟。SCN作为起搏器的[107]活动中心控制行为规律和包括激素分泌在内的生理功能。最新的证据表明，昼夜节律和新陈代谢是紧密交织在一起的生理过程。生物钟在SCN和外周时钟的水平上调节葡萄糖稳态，在血糖水平、葡萄糖耐量、胰岛素敏感性和大脑、骨骼肌和脂肪组织对葡萄糖的摄取方面都能观察到每日节律。此外，人体昼夜节律性和睡眠-觉醒周期中的紊乱，例如轮班工作人员，与糖尿病，代谢综合征，低瘦素血症、食欲增加、肥胖有关。在动物模型中几种典型时钟基因的遗传破坏导[108-110]致多种代谢紊乱，表明时钟基因参与葡萄糖稳态。如图21所示：核心昼夜节律钟的反馈回路。图31核心昼夜节律钟的反馈回路如上图所示：时钟机器由不同的反馈回路组成。在主循环中，BMAL1和CLOCK通过激活E-box增强子来驱动PER和CRY的转录表达。PER和CRY蛋白形成的异源二聚体易位至细胞核，通过与CLOCK:BMAL1复合物相互作用来抑制其自身的转录。PER和CRY的转录也受蛋白质酪蛋白激酶1和AMP激酶的调节，它们磷酸化这些蛋白质，通过26S蛋白酶体复合物诱导它们在胞质溶胶中的降解。在24小时内主回路中发生反馈，然后开始一个新的循环。在另一个环83 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文路中，CLOCK:BMAL1异二聚体驱动REV-ERB和ROR的表达，其抑制和激活BMAL1表达。一些参与代谢途径的时钟控制基因（CCGs）也受时钟机制的调制。缩写：BMAL1，brainandmuscleARNT-like1；CLOCK，昼夜运动输出循环蛋白质；PER，时间同源物果蝇；CRY，隐花色素；REV-ERB，reverse-eritroblastosisvirus；ROR，视黄酸受体相关的孤儿受体；RORE，ROR响应元素。除了在大脑中的中央时钟，具有类似分子成分的外设时钟存在于几个外周器官中，如肝、肾、心脏、脂肪组织和胰腺。这些外周时钟的昼夜节律活动主要通过自主神经支配、激素信号（即糖皮质激素）和与摄食有关的线索。外周时钟有助于全身能量代谢，但也参与局部代谢功能，例如葡萄糖和脂质的体内平衡等。昼夜节律的改变和/或外周钟与中央时钟的错位可能与不同的代谢性疾病的发病[111]相关，包括T2DM。4.5.2.2.2昼夜节律在胰腺β细胞功能中的作用T2DM是复杂的代谢疾病，由于遗传易感性和环境触发因素之间相互作用而出现。环境触发因素包括，膳食结构的改变，快节奏生活方式、静态的久坐生活方式等，最近描述的与T2DM发展相关的环境触发因素是由于轮班工作，睡眠不足或夜间生活方式导致的昼夜节律紊乱。并有多种证据支持昼夜节律紊乱和T2DM易感性之间的关系。如持续的轮班工作，昼夜失调加速了代谢综合征的发[112][113]展，可能会增加糖尿病风险和炎症，睡眠不足和昼夜节律失调造成的肠道[114]微生物组成和功能的变化，对能量平衡造成不利影响，从而增加肥胖的风险。连续暴露于夜间光线引起体内明暗周期的变化，破坏胰岛昼夜节律钟功能振荡，[115]胰岛分泌脉冲质量减少，导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌减少。同时生物钟混乱和饮食引起的肥胖协同促进胰岛β细胞衰竭，这可能是胰岛时钟功能受损的后[116]果。胰腺根据生理需要分泌胰岛素和胰高血糖素参与调节葡萄糖稳态。血浆胰岛素和胰高血糖素的水平显示出24小时的节律振荡，在大鼠胰脏中发现了一种控[117]制胰岛素分泌的内在昼夜节律振荡器。如下图所示：调节胰岛β细胞功能的时钟基因。84 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文图32调节胰岛β细胞功能的时钟基因如上图所示：葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白2（GLUT2）进入胰腺β细胞并被+线粒体代谢，导致ATP的快速生成以及ATP敏感的K(KATP)通道的随后关闭。2+这些通道的关闭导致质膜去极化（ΔVm），打开电压门控Ca通道（VOCC）。随2+之而来的Ca流入通过胰岛素分泌颗粒的胞吐作用触发胰岛素释放。时钟基因调节胰腺β细胞可能涉及多个过程和机制。在CLOCK，BMAL1或REV-ERB缺陷的胰岛中已显示葡萄糖诱导的胰岛素分泌（glucose-stimulatedinsulinsecretion，GSIS）受损。CLOCK和REV-ERB可通过调节参与胞吐作用的基因（Vamp3，Syntaxin1，Munc18，Snap25）的表达来调节胰岛素分泌。此外，CLOCK和REV-ERB可能通过调节涉及β细胞存活和生长的不同基因（CyclinD1，Hnf4α，InsR，Pdx1）85 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文来调节β细胞增殖。通过减少UCP2介导的线粒体解偶联和氧化应激以及通过增加抗氧化剂防御，正常β细胞GSIS也需要BMAL1。后者的作用是通过BMAL1直接转录调节Nrf2介导的。时钟控制的输出蛋白TEF和DBP也显示出分别直接调节葡萄糖转运蛋白2（Glut2）和Arnt的转录活性。后者基因在β细胞代谢和GSIS中起关键作用。缩写：BMAL1，脑和肌肉ARNT样1；CLOCK，昼夜运动输出循环蛋白质；CRY，隐花色素；DBP，d结合蛋白；PER，时间同源物果蝇；REV-ERBALPHA，反向eritroblastosis病毒α;TEF，甲状腺激素胚胎因子；UCP2，解偶联蛋白2。结合本实验的结果，模型组VS空白组筛选的与节律相关的基因为：Cry1，在西药组VS模型组筛选的与节律相关的基因为：Usp2、Id2、Nr1d2、Dbp、Tef，其中其中Nr1d2（Rev-ERBβ）与Nr1d1（Rev-ERBα）和Bmall合作协同调节时[118]钟和时钟输出基因。参芪复方中剂量组VS模型组筛选的与节律相关的基因为：Usp2、Id2。说明糖尿病GK大鼠的血糖波动与胰腺组织中昼夜节律的基因表达具有相关性。DNA结合抑制剂2（Id2）是在许多哺乳动物组织中节律性表达的螺旋-环-螺旋转录阻遏物。实验研究证明了Id2在小鼠昼夜节律系统的输入途径、核心时[119,120]钟功能和输出途径中的作用。Id2基因缺失（Id2-/-）小鼠表现出改变的摄食和运动节律，如表现出自发活动水平较低，喂养和运动活动时间延长，空腹低血糖，性别和年龄依赖性增强的葡萄糖耐量和胰岛素敏感性，以及骨骼肌和棕色[121]脂肪组织中性别依赖性升高的葡萄糖摄取，主要表现在雄性Id2-/-小鼠。泛素特异性蛋白酶（USPs）构成去泛素化酶的主要家族，其作为多种生物过程的多功能调节剂，包括细胞周期调控，信号传导，转录调节和线粒体动力学。经研究，Usp2被鉴定为空腹诱导型和时钟调节型去泛素化酶。在动物试验中，Usp2缺陷型小鼠在昼夜变化时对光更敏感，Usp2与时钟蛋白复合物相关联，并且稳定BMAL1，BMAL1通过其对CLOCK/BMAL1调节基因的转录作用调节对傍晚光照[122]的敏感性。USP2与时钟蛋白和去泛素PERIOD1（PER1）相关，通过门控其[123]核进入和积累来调节PER1功能，Usp2缺失的小鼠在时钟功能上显示缺陷。经USP2刺激肝脏糖异生维持正常葡萄糖稳态。Usp2通过诱导肝脏11β-羟基类固醇脱氢酶1（HSD1）表达和糖皮质激素信号传导来调节饮食诱导的肥胖症的86 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[124]全身葡萄糖耐量。本实验参芪复方中剂量组VS模型组、西药组VS模型组均表现出Id2的表达下调和Usp2的表达上调（P＜0.05），并通过定量PCR，Id2表达下调，Usp2的表达上调且有统计学意义。可以推测，本实验的GK大鼠出现血糖波动幅度较大，分析可能跟GK大鼠在喂食或运动活动，食欲过盛，高脂血症，高血糖症和低胰岛素血症中扰乱了昼夜节律有相关性，从而出现昼夜节律基因的表达改变，反之，昼夜节律基因表达的改变又影响胰岛素分泌，从而加重血糖波动。参芪复方中剂量组、西药组通过对生物钟剂节律相关基因进行调控，能调节胰岛素的分泌，起到减少血糖波动的作用。4.5.2.2.3中医理论的“子午流注”与“生物钟节律”用中医理论分析，中医传统针灸学有“子午流注”的特色理论体系，它是建立在《内经》天人相应、经脉气血流注和针灸候气逢时等学说基础上的，“子午”是时间的代号，“流注”是气血运行的形象，“气血”是人体生命活动的基本物质，起于中焦，根据经络起止循行交会的运行规律，由经络输送至人体四肢百骸，所谓“经脉者，所以行气血而营阴阳”。如元∙滑伯仁在《十四经发挥》中有言：“经脉者，所以行气血，通阴阳以荣于身者也......昼夜流行，与天同度，终而复始也。”可见中国传统中医理论“子午流注”与现代的“生物钟”学说交相呼应，共同印[125]证了“天人相应”的整体观。从宏观中医角度可以推测参芪复方可能通过益气养阴活血之法，养阴津，补元气，祛阴火，平衡气血阴阳，能帮助机体调控能量代谢，减少血糖的波动性。5创新性及特色（一）本课题以“脾胰同源”为理论依据，以“血糖波动”为立足点，运用临床有效经验方参芪复方以“养阴益气活血法”减少血糖波动，改善糖尿病大血管病变，具有中医理论特色，同时发挥中医平稳血糖，减缓并发症的优势。（二）本课题应用“基因芯片”技术对GK大鼠的胰腺组织进行差异基因检测，从全基因组的宏观角度探索养阴益气活血法减少血糖波动的微观机制。对下一步研究奠定基础，提供思路与方向。87 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文6结论（一）参芪复方可以改善胰岛细胞功能，减少血糖波动，延缓糖尿病GK大鼠大血管病变的发展；（二）参芪复方通过调节基因Pik3r1、Ddit4表达上调，影响mTOR信号通路，推测参芪复方可能通过抑制mTOR，激活自噬对胰岛β功能的保护。（三）糖尿病GK大鼠的血糖波动与胰腺组织中昼夜节律的基因表达具有相关性。养阴益气活血法可能通过调控胰腺Id2、Usp2基因的表达，发挥其稳定血糖波动的作用。（四）模型组/空白组、参芪复方组与模型组、西格列汀组/模型组的基因芯片结果比较分析，三个比较组筛选出的差异基因分析，参芪复方组与模型组基因表达上调者偏多，并且富集的pathway也较西药组偏多，体现了参芪复方多靶点、多途径的治疗特点。7问题与展望（一）基因芯片技术虽然有高通量信息大，高灵敏性的特点，但是也存在外在干扰因素造成的误差，需要增加样本量，以减少误差的干扰；（二）基因芯片数据信息量大，需要进一步对数据结果进行深入的挖掘；（三）因实验经费的限制，没有对相关基因和信号通路进行进一步验证，将在下一阶段对筛选出的相关关键基因和信号通路进行多角度、多层面的验证。88 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文致谢三年的博士生涯即将接近尾声，这也意味着即将真正告别学生时代，然而学习之路却一直不会中断，也不能中断。回望10余年学医之路，不禁感慨万千，这是一条负重前行的艰辛之路，作为一名医生，一名中医，时刻以治病救人为己责，只有不断鞭笞自己不断攀登，从来不敢松懈。但在前行的路上，并不孤单，有指引道路的恩师，有支持前行的亲人，有志同道合的朋友，有不断攀登路上的风景，有苦有甜，有痛苦亦有收获，心中没有遗憾，更只留不悔！在此，首先感谢我的恩师谢春光教授，感谢老师给我学业上的指导，给予我学习进步的良好平台，老师严谨的治学，精湛的医术深刻影响着我，指引我以后的工作和学习，老师平易近人，待人谦和，温和的笑容如父亲般和蔼，鼓舞我不断上进，追求更完美的自己，老师的敦敦教诲和言传身教，让我终身受益！感谢刘桠师姐、高泓师姐、龚光明老师、由凤鸣老师，袁海泼师兄、谢红艳师姐、富晓旭师姐、侯天舒师姐、覃海知师姐、李海洋师兄、朱海燕师姐等等师兄师姐在论文上的指导和生活上的指导帮助，感谢张翕宇师妹、刘晓瑞师妹在实验过程中的协助，感谢钟文、方传明在学习和生活上的帮助，感谢周秀娟师妹、杨婵师妹、雷远洪师弟、张愿师妹、刘晓可师弟、方俪娟师妹、杜青营师妹、赵雪慧师妹等等师妹师弟的帮助和关心，我们是同门也是亲人！感谢刘宏伟老师、赵春阳老师在实验上的指导和帮助，感谢徐思老师在实验数据分析上给予的指导和帮助，我将铭记于心！感谢给予我帮助，给予我指点的老师，我会不负期望！感谢我的朋友白俊、肖钦文、罗芯怡以及远方不在身边的挚友，是你们的相伴和支持，让我的生活充满幸福和阳光！感谢我的爸爸妈妈不辞辛苦的栽培，请岁月慢下脚步，让他们眼角的纹路、发间的斑白少一点，笑容再多一点；感谢我的亲人们给予我无私的爱！感谢我的挚爱丁麒锦，对我学业的有力支持，愿初心不忘，相伴永远！最后，谨向所有参与论文评阅、答辩指导的各位专家致以我衷心的感谢！89 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文参考文献[1]CentersforDiseaseControlandPrevention.DiabetesReportCard2014.Atlanta,GA:CentersforDiseaseControlandPrevention,USDeptofHealthandHumanServices;2015.[2]XuY,WangL,HeJ,etal.PrevalenceandcontrolofdiabetesinChineseadul-ts[J].JAMA,2013,310(9):948-959.[3]ChenL,MaglianoDJ,ZimmetPZ.Theworldwideepidemiologyoftype2d-iabetesmellitus—presentandfutureperspectives.NatRevEndocrinol.2011;8(4):228–36.[4]卫生部疾病控制司,中华医学会糖尿病学分会.《中国糖尿病防治指南》试行本节选[J].中国慢性病预防与控制2004,12(6):283-285.[5]DuckworthW,AbrairaC,MoritzT,RedaD,EmanueleN,ReavenPD,etal.Glucosecontrolandvascularcomplicationsinveteranswithtype2diabetes.NEnglJMed2009;360:129–39.[6]CaprndaM，MesarosovaD，OrtegaPF，et.GlycemicVariabilityandVascularComplicationsinPatientswithType2DiabetesMellitus.FoliaMed(Plovdiv).2017Sep1;59(3):270-278.[7]GaleEA.glucosecontrolintheUKPDS：whatdidwelearn？[J].DiabetMed,2008,25(suppl2):9-12.[8]李辉,朱天民,张卫华,谢春光.参芪复方对2型糖尿病GK大鼠胰岛β细胞凋亡及Caspase-3表达的影响[J].中国老年学杂志,2008,12(28):2414-2413.[9]刘桠,谢春光,陈敏,庄灿,高泓.参芪复方调控GK大鼠血管PTEN/PI3K通路的实验研究[J].中国中西医结合杂志,2010,30(6):640-644.[10]何绍奇,关于糖尿病的若干问题答读者问[N].中国中医药办,2003-2-10.[11]沈桂祥.何绍奇谈糖尿病的中医治疗[J].中医药通报,2006,5(6):25-26.[12]高阳,廉廷廷,王婷婷,等.从肝脾论治血糖波动[J].亚太传统医药,2017,13(20):99-100.[13]周博文.从李东垣阴火理论辨治脾瘅[J].亚太传统医药,2016.12(14):110-111.[14]王进波,李能娟,胡江.“阴火论”探析脆性糖尿病中医证治[J].浙江中医药大学90 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成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[122]ScomaHD,HumbyM,YadavG,etal.TheDe-ubiquitinylatingenzyme,USP2,isassociatedwiththecircadianclockworkandregulatesitssensitivitytolight[J].PLoSOne,2011,6(9):e25382.[123]YangY,DuguayD,FahrenkrugJ,CermakianN,WingSS.USP2regulatestheintracellularlocalizationofPER1andcircadiangeneexpression.JBiolRhythms.2014,29(4):243-256.[124]MatthewM.Molusky,SimingLi,DiMa,etal.Ubiquitin-SpecificProtease2RegulatesHepaticGluconeogenesisandDiurnalGlucoseMetabolismThrough11β-HydroxysteroidDehydrogenase1.Diabetes.2012May;61(5):1025–1035.[125]孙家壁.子午流注与生物钟[J]湖北中医杂志.54.101 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文综述血糖波动的中西医研究及治疗进展由于饮食习惯的改变以及久坐的生活方式，中国已经成为世界上患糖尿病（diabetesmellitus，DM）数量最多的国家之一。最近两次全国性糖尿病患者的调查表明，2型糖尿病病人的患病率已达9.7%和11.6%，分别为9240万和11390[1-2]万中国患者。1995年糖尿病控制和并发症试验（DiabetesControlandComplicationsTrial，DCCT）的研究显示，强化治疗组和常规治疗组的HbA1c相同的情况下，随着时间的推移，常规治疗组的视网膜病变发生率高于强化治疗[3][4]组。这表明除了平均HbA1c有其他因素影响增长的视网膜病变发生率。现在，血糖变异性正在成为血糖控制的一种可能的附加测量方法，与平均血糖测量相比，这可能是并发症更好的预测指标。2009年Monnier等提出”血糖四分体”的概念，即糖化血红蛋白（HbA1c）、空腹血糖、餐后血糖和血糖波动，人们对血糖波动日益重视，糖尿病中的餐后血糖升高以及低血糖事件被认为是心血管事件增加的主要原因，因此，使血糖变异最小化可以预防心血管事件。大量临床及实验研究证明，波动性高血糖比持续性高血糖更能引起严重的氧化应激、炎症反应、血管内皮功能障碍以及胰岛功能下降等，从而加速糖尿病血管并发症的发生和发展。1血糖波动的概念、重要性及其衡量方法血糖波动（glucosefluctuation）又称血糖变异性（GlycemicVariability）、血糖漂移性，指血糖水平在低值和高值之间波动的非稳定状态。变异性在人体的所有主要控制系统中起着基础性的作用，参与糖代谢的激素的昼夜节律与葡萄糖耐[5]量和胰岛素作用的变化有关，因此，血糖变异性不总是负面的，因为血糖的变化不仅是生理学结果，还涉及控制糖代谢的激素的昼夜节律，还涉及碳水化合物的摄入。由于正常人在神经、内分泌及肝组织等的精密调节下波动的幅度不大，血糖相对平稳。空腹血糖通常保持在3.9～5.6mmol/L，一般进餐后1h内血糖浓度达高峰，但不超过7.8mmol/L，并于2～3h内恢复至餐前水平，日内血糖波动幅度在2～3mmol/L，频率为5次/d。但是由于糖尿病病人胰岛功能的下降和胰岛素抵抗，饮食控制不佳，降糖方案不当，患者依从性差等问题，导致血糖水平102 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文升高以及血糖波动幅度大。主要表现为整体血糖水平升高、日内及日间血糖波动幅度大、餐后急性高血糖，以早餐最为明显，低血糖次数多等。这些都是血糖波动的特征。近年来，随着连续动态血糖监测系统（CGMS）评估技术的发展，CGMS通过记录24h血糖的动态变化，可精确评估DM患者血糖漂移的特征。目前临床[6]上将平均血糖波动幅度（MAGE）作为反映血糖波动的金标准。为了精确量化血糖波动的程度，从以下几个方面进行评估：（1）日内血糖波动：血糖水平的标准差（SDBG）、血糖波动于某一范围的时间百分比、曲线下面积或频数分布、最大血糖波动幅度（LAGE）、M-值、平均血糖波动幅度（MAGE）；（2）日间血糖波动：空腹血糖变异系数（FPG-CV）、日间血糖平均绝对差（MODD）；（3）进餐相关性血糖波动：平均进餐波动指数（MME）、餐后血糖的时间与曲线下面积增值（IAUC）；（4）严重低血糖风险：低血糖指数（LBGI）。临床上应根据各[7-8]参数特点和评估目的进行合理选择。2血糖波动的影响因素糖尿病患者血糖波动的主要原因包括胰岛β细胞功能状态、饮食、运动和药[9]物等。胰岛β细胞功能：糖尿病患者自身β细胞功能减退甚至衰竭，导致体内胰岛素水平不足，血糖调节能力低下，导致血糖容易波动。并且β细胞功能越差，[10]血糖波动幅度越大。饮食：饮食的“质”和“量”均可影响血糖波动，摄入高升糖指数(glycemicindex，GI)食物以及食物摄入量过多均可引起餐后血糖迅速升高，导致血糖波动的幅度增加。药物：应用降糖药物所带来的低血糖也是血糖[11]波动增加的诱因之一。如促进胰岛素分泌的药物或者胰岛素本身等均会增加患者的低血糖风险，增加血糖波动。睡眠障碍：睡眠障碍使T2DM糖尿病患者空腹血糖、三餐后2小时血糖、糖化血红蛋白升高，且增加血糖波动，应关注对[12]T2DM患者的睡眠质量管理和血糖控制。糖尿病伴睡眠障碍患者血糖波动可能与胰岛素分泌缺陷密切相关，血糖高波动性大，胰岛β细胞功能损害严重，促进[13]糖尿病慢性并发症的发生发展。此外，饮食和运动不规律、治疗依从性差、情绪因素、酗酒、感染、胰岛素不规范注射等多种因素也可增加血糖波动，而应对餐后血糖的药物作用不足也是导致血糖波动的原因之一。以前的研究表明，血糖波动与氧化应激和糖尿病并发症密切相关。然而，迄今为止，仅有少数研究评估了T2DM患者血糖变异性（GV）的影响因素。在基103 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文于自我血糖监测（SMBG）的胰岛素治疗T2DM研究中，作者发现胰岛素治疗持[14]续时间较长与GV较高相关。然而，另一项使用口服降糖药或单独饮食控制的T2DM研究发现，餐后B细胞功能和口服葡萄糖降低药物是GV的独立贡献者，然而临床因素如年龄，性别，糖尿病持续时间，胰岛素敏感性和碳水化合物摄入[15][16]量未能导致GV。最近在韩国进行的一项研究显示，在胰岛素治疗的T2DM中，空腹C肽水平与GV呈负相关，而HbA1c和糖尿病病程与GV呈正相关。他们的研究还显示，在没有进行胰岛素治疗的T2DM中，年龄，BMI，HbA1c，HDL-c，TG水平以及使用磺酰脲与GV呈正相关，而LDL-c水平与GV呈负相关。与以前的研究一致，发现胰腺B细胞功能障碍（以较低的血清C-肽水平测量）与日内和日间的GV有关。相似的，在一项评估T2DM患者血糖变异性（GV）的影响因素的临床研究中，发现糖尿病病程较长和HbA1c水平较高与使用胰岛素注射治疗的T2DM患者GV较高有关。除此之外，还发现糖尿病家族史，天冬氨酸转氨酶（AST）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平升高与GV参数呈正相关。C肽的血清水平，预混胰岛素注射剂、心血管疾病史和血尿酸浓度与GV参数呈负相关。结果表明，胰岛B细胞功能障碍和更高的胰岛素敏感性是血糖波动的独立影响因素，此外，预混胰岛素治疗可以获得更好的血糖控制，降低[17]中国T2DM患者胰岛素治疗患者的日内和日间血糖变异性。3血糖波动对糖尿病血管并发症的影响及其机制3.1血糖波动对糖尿病血管并发症的影响作为衡量血糖控制情况的血糖变异性，可能是糖尿病并发症的可靠预测指标。血糖变异性与血糖波动有关，短期血糖波动是指个体内部或日间波动，并包括多种评估方法。长期血糖波动是指几周或几个月的波动，最常见的是通过HbA1c变异性来评估。临床的回顾性研究发现，微血管和大血管并发症和死亡率与HbA1c变异性呈正相关，与HbA1c水平无关，并可能在临床风险评估中发[18]挥预测作用。3.2.1血糖波动对糖尿病大血管病变的影响波动性高血糖有独立于血糖水平之外的血管损伤作用，可通过急、慢性作用加重血管损害。急性作用为瞬时葡萄糖高峰与血糖波动引起内皮细胞结构和功能的急性损害或经氧化应激的直接毒性作用；慢性作用通过升高糖化血红蛋白104 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文（HbA1c）和糖基化终末产物（AGEs）水平，引起动脉粥样硬化（Atherosclerosis，[19]AS）。研究表明，血糖波动的指标MAGE与T2DM患者的大血管并发症相关[20]。血糖波动越大，颈动脉内膜中层厚度（CIMT）越厚，AS血管病变发生率[21]越高，即血糖波动大的DM患者发生AS大血管并发症的危险性高。血糖波动能增加冠心病的发生率，被认为是冠心病形成的除了血脂异常之外的剩余风险。临床研究发现，发生冠状动脉狭窄的T2DM患者血糖波动幅度更高，MAGE是[22][23]T2DM患者发生冠状动脉狭窄的独立危险因素。MasaruKuroda等观察血糖波动与进行降脂治疗的患者冠状动脉斑块形态之间的关系，研究显示：血糖波动和低血糖可能对进行降脂治疗的患者富含脂质斑块和薄的纤维冒的形成有影响。[24]ChangjiangYing等研究发现，葡萄糖变异性大鼠心肌组织中心肌纤维化和氧化应激较为明显，磷酸化的Ser/Thr蛋白激酶和磷酸化的GSK-3β的表达水平显著降低，NF-κB和caspase-3显著升高。血糖变异性可加重心脏组织纤维化，可能涉及通过抑制AKT信号传导途径引起的氧化应激。对于T2DM下肢血管病变患者，慢性血糖波动是HbA1c控制良好的T2DM患者下肢血管病变的重要危险因素，糖尿病病程是影响血糖波动水平的重要因[25]素。研究显示，MAGE与下肢血管病变评分呈相关，原因可能为血糖波动较[26]持续性高血糖对血管内皮的结构和功能损伤更严重。JiaoXM等研究显示下肢血管疾病与缺血修饰白蛋白（IMA）、血管性血友病因子（vWF）、MAGE相关，表明2型糖尿病患者的血糖波动可通过加重血管内皮损伤来促进下肢血管疾病的发生和发展。3.2.2血糖波动对糖尿病微血管病变的影响血糖水平不稳定对糖尿病微血管危险性的作用可能超过血糖绝对水平的作2+用，血糖波动可以增加蛋白激酶C活性，激活氧化应激反应，激活Ca通道，促进内皮细胞、肾系膜细胞、视网膜血管细胞的凋亡，从而导致血管慢性病变的发［27-28］展。即使HbA1c控制较理想的2型糖尿病患者，在血压正常的情况下，血糖波动及糖尿病病程是糖尿病肾病的重要危险因素，对糖尿病肾病微量白蛋白也有[29]一定影响，可促进糖尿病肾病的发生发展。波动性高血糖能引发肾脏氧化应激反应，降低肾脏氧自由基清除剂超氧化物歧化酶（SOD）活性，增加脂质过氧化产物丙二醛（MDA）含量。通过激活JNK，增加肾小管上皮细胞Nox4表达，[30]进而促进细胞凋亡。血糖波动使大鼠肾小球体积增大，纤维化更为明显，IV105 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文型胶原（CollagenIV，COLⅣ）的表达量增加，均提示血糖波动对糖尿病大鼠[31]的肾损害更严重。血糖波动能通过参与糖尿病大鼠AKT信号通路加速肾损伤，研究发现，血糖波动使尿素氮（BUN）和肌酐（SCR）升高，肌酐清除率（CCr）降低；加剧Ccr的变化；在血糖波动之下肾组织超微结构也严重损失；血糖波动增加肾组织的氧化应激；并使磷酸化苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶（p-AKT）（phosphor-473）和B细胞淋巴瘤/白血病-2（BCL-2）水平降低；磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK-3β）（phosphor-Ser9）、Bcl相关的X蛋白（BAX）、cleaved-caspase-3水平以及BAX/BCL-2的比率升高；结果表明：血糖波动加快肾脏损失的原因至[32]少是由于其氧化应激和抑制糖尿病大鼠的AKT信号通路。JiazhongSun等研究发现，间歇性高血糖通过人类视网膜内皮细胞（HRECs）中线粒体运输链水平中活性氧（ROS）过量产生，以增强血管内皮生长因子（VEGF）的增殖和过度表达。从而表明血糖波动对依赖于线粒体ROS的糖尿病视网膜病变的发展有重要的病理学影响。抗氧化剂MnTBAP或TTFA可有效防止持续或波动高血糖诱导的HRECs中VEGF的增殖和过度表达，线粒体ROS，硝基酪氨酸，和8-脱氧羟基脲[33]苷（8-OHdG）的过量产生。然而并非所有的临床研究都表明血糖波动与血管并发症的相关性，Martin[34Caprnda等]研究结果并没有显示MAGE指数与T2DM患者存在大血管和微血管并发症的相关性。但是，该阴性结果并不一定反驳糖尿病并发症中血糖变异性的重要性。3.2血糖波动对糖尿病血管并发症影响的机制根据各种研究，糖尿病中各种微血管和大血管并发症的发生归因于高血糖和血糖波动。统一几种病理生理机制，统一起来主要有两种：过量的蛋白质糖基化[35]终产物和激活血管并发症的氧化应激。在动物研究中，血糖波动对心血管风[36]险的参数（内皮功能障碍）显示出更有害的影响；血糖波动与低血糖发生率[37]增加之间存在显著相关性，低血糖可能通过诱导炎性细胞因子的释放引起炎[38]症；内皮功能障碍导致血管舒张减少可能导致心血管疾病风险。总体而言，病理生理学证据似乎高度提示血糖波动是血管损伤的重要决定因素。血糖波动通过引起氧化应激，炎症反应诱导血糖内皮的损伤，另外血糖波动还能引起胰岛β细胞功能障碍，从而加速糖尿病血管并发症的发生发展。3.2.1血糖波动引起氧化应激、炎症反应与细胞凋亡106 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文氧化应激和炎症的恶性循环可能会损坏细胞，越来越多的证据表明急性餐后[39]血糖波动可能会诱导体内的氧化应激。氧化与抗氧化作用失衡所致氧化应激损伤是高血糖和高血脂状态下引起胰岛β细胞损伤的重要机制，糖尿病患者存在[40]明显的氧化应激损伤。证据证明，FPG、日内和日间葡萄糖变异性的改善，与[41]T2DM患者氧化应激减少相关。研究数据表明，间歇性高血糖诱导单核细胞中[42]更多细胞因子的表达，包括肿瘤坏死因子(TNF)-α，白介素(IL)-6和CD11b等。[43]NaWu等研究发现，波动性高血糖能诱导主动脉血管内皮细胞凋亡和功能障碍，减少细胞凋亡相关基因B细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）和半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3）水平，提高B细胞淋巴瘤相关蛋白X（Bax）线粒体易位和caspase-3p17蛋白水平。波动性高血糖组（AFG组）和持续性高血糖组（CHG组）都能诱发β细胞功能障碍和胰岛素抵抗，AFG组升高了血清中丙二醛（MDA）和8-iso前列腺素（8-isoprostaglandin）的水平、血清和血管内皮细胞中的炎症因子。[44]Quagliaro等培养人脐静脉内皮细胞，结果发现，与持续性高血糖或正常葡萄糖环境相比，当细胞处于间断高葡萄糖环境（类似于糖尿病患者的波动性高血糖）时，会产生大量的硝基酪氨酸和8-OHdG。Bcl-2水平明显下降，caspase-3[45]表达水平和活性显著上升，提示细胞凋亡增加。Quagliaro等进一步研究发现，波动性高血糖比稳定性高血糖细胞间黏附因子（ICAM）-1、血管细胞黏附分子（VCAM）-1、E-选择素含量和mRNA表达增加，蛋白激酶c（PKc）活性亚型高表达，表示波动性高血糖较稳定性高血糖更能增加PKc的表达，改变丝裂原活化[46]蛋白激酶（MAPK）通路，促使细胞凋亡及DNA氧化损伤。Qin-MinGe等将猪髋动脉内皮细胞（PIECs）暴露于间断性高血糖或持续性高血糖环境中3天或6天，结果发现，波动性高血糖比持续性高血糖诱导产生更多的ROS，这种效应至少部分与NADPH氧化酶的活性增强有关。将人冠状动脉内皮细胞（HCAECs）在波动性高血糖与持续性高血糖中培养，结果发现，OHG比PHG更有害于HCAECs，这可能是由于通过抑制Nrf2/HO-1通[47]路在频繁血糖波动的诱导下引起氧化应激和细胞凋亡的增强。因此以Nrf2/HO-1通路为研究对象，可为防治血糖波动造成的血管损伤提供新的探索思[48]路。3.2.2血糖波动加重胰岛β细胞功能障碍胰岛β细胞功能损害和胰岛素敏感性下降是糖尿病发生、发展最关键的两个107 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文病理生理因素。血糖波动是糖尿病并发症强有力的预测因素和胰岛β细胞的关键影响因素。长期慢性高血糖可引起机体内产生过量氧自由基，引起自由基体系清除功能失衡，产生大量反应性氧自由基（ROS），其可加重氧化应激，损伤内皮细胞，引起胰腺β细胞凋亡；另一方面，慢性糖毒性亦可增强多元醇通路活性，激活蛋白激酶C（PKC），增加糖化终末产物（AGEs），上述均可引起胰岛β细胞[49]功能损伤。葡萄糖和脂肪酸在内的营养素供应过剩以及随后的β细胞过度刺激[50]被认为是T2DM胰岛素分泌减少的重要原因，缺氧也参与了胰岛β细胞损伤。有学者提出“氧化应激放大学说”，即长期高糖状态下，细胞形成慢性保护性适应，引起机体慢性氧化应激状态，处于瞬时葡萄糖高峰抑或血糖波动时，可引起内在氧化应激级联性放大，其产生的毒性损害作用，尤其对于胰腺β细胞功能要远比慢性高糖毒性更为严重。放大下的氧化应激可激活多种细胞因子，进而启动和调节多种炎性因子基因转录，损伤血管内皮细胞，引起血管收缩、血栓形[51]成、血管炎症，影响β细胞增殖、分化。血糖波动加重胰岛β分泌胰岛素缺乏是机体糖耐量减退更加恶化的重要原因。随着血糖波动增大，患者基础C肽及HOMA-β指数减低，提示血糖波动可损害胰岛β细胞功能，其危害不亚于长期高[52]糖蓄积。波动性高血糖比持续性高血糖诱发更严重的胰岛β细胞凋亡和细胞细胞活力的毒性作用。长期暴露于波动性高血糖不仅通过激活XOD活性细胞内氧化应激诱导更显著地细胞凋亡，也通过改变细胞周期调控的表达抑制细胞活力和阻断细胞周期进展。说明细胞氧化应激的过度活化和细胞周期蛋白的调控可能是[53]波动性高血糖诱导INS-1细胞损伤的可能机制。通过蛋白质印迹分析PTEN表达升高和AKT磷酸化水平降低，表明间歇性高血糖对胰岛β细胞中胰岛素信号传导具有负调节作用。胰岛β细胞凋亡的增加可能是由于胰岛素信号受抑制所致，这[54]是由于高糖导致的ROS水平升高所致。4减少血糖波动及其并发症的西药治疗4.1胰岛素泵《中国胰岛素泵强化治疗指南》中明确指出：胰岛素泵对于血糖波动性大、[55]频发低血糖、无感知低血糖、无法按时就餐等患者，往往治疗效果更为理想。[56]焦秀敏用短期胰岛素泵强化治疗T2DM合并下肢血管病变（LEAD）的患者，治疗后FPG、2hPG明显改善，同型半胱氨酸（Hcy）、vWF、IMA也明显下降，108 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文强化治疗组较每日2次胰岛素注射上述各项指标下降更为明显。胰岛素泵（CSII）治疗初诊2型糖尿病患者，与多次皮下注射胰岛素（MDI）强化治疗相比，24h血糖波动均值（GM）、血糖波动系数（GV）均明显低于MDI组。证明了胰岛素泵强化治疗更安全、有效控制血糖，且血糖波动较小，降低低血糖不良事件的发[57]生率。分析其可能机制为胰岛素泵能够模拟生理性胰岛素分泌，保护胰岛功能，减少血糖波动，进而影响机体的氧化应激水平，保护血管内皮功能，对糖尿[58]病大血管病变产生有利影响。目前胰岛素“3C”整合管理系统在临床上应用广泛，胰岛素“3C”整合管理系统包括动态血糖监测系统(CGM)、持续皮下胰岛素注射(CSII)和DM管理软件(Carelink)，根据CGM的监测结果，调整胰岛素的输注，使血糖的调整控制更加快速、安全、精准。3C胰岛素泵对血糖波动幅度及提高脆性糖尿病患者的生活质量效果更佳,所需要的胰岛素量更少，低血糖风险更低[59]。4.2GLP-1类似物与DPP-4抑制剂近年来陆续被研发出的二肽基肽酶4（DDP-4）抑制剂、耐受DPP-4酶的胰升糖素样肽1（GLP-1）受体激动剂和GLP-1类似物（3类GLP-1相关降糖药），对血糖波动的控制有积极意义。它们可以提供与其他药物（如磺胺脲类）等效的血糖[60]控制，但是能减少低血糖的风险。GLP-1可通过多途径参与机体血糖稳态调节，改善胰岛功能，延缓甚至逆转2型糖尿病病程进展。但内源性GLP-1在被分泌释放入血后会被DPP-4快速裂解而失去活性，DPP-4抑制剂可选择性抑制DPP-4的活性，阻止GLP-1裂解失活，提高GLP-1水平，降低2型糖尿病患者的GHbA1c、空腹及餐后血糖水平。胰升血糖素样肽-1（GLP-1）类似物利拉鲁肽是一种新型的降血糖药物，临[61]床研究发现，胰岛素联合口服降糖药物（OADS）治疗血糖控制不佳的T2DM患者加用利拉鲁肽，日内、日间血糖波动减少，治疗12周后，FC-P、2hC-P、HOMA-β均较治疗前升高，进一步证实了利拉鲁肽可有效平稳降糖，改善胰岛β细胞功能。对于血糖控制不佳的T2DM伴肥胖患者中，以门冬胰岛素30作为对照组，利拉鲁[62]肽组在平稳降糖、减轻体质量、调脂等方面具有一定的疗效。在原有治疗基础上加用利拉鲁肽稳定血糖，降低血糖波动幅度，同时还可以有效减少胰岛素用[63]量，大幅改善胰岛β细胞的功能。二肽基肽酶-4（DPP-4）抑制剂是近年来出现的一种新的治疗2型糖尿病的药物，目前全球范围内上市的DPP-4抑制剂包括[64]西格列汀，维格列汀，沙格列汀，替格列汀等。对于使用磺脲类药物治疗效109 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[65]果不佳的，采用西格列汀能有限控制血糖，减少血糖波动，且不增加体重。[66]且能减轻T2DM患者体内的氧化应激水平。二甲双胍联合维格列汀治疗初诊T2DM患者，与二甲双胍联合格列美脲相比，具有更好降糖效果，可保护胰岛β[67]细胞，且血糖波动小。沙格列汀联合甘精胰岛素治疗血糖控制不佳的T2DM，可有效控制血糖，改善血糖波动，稳定性好，临床疗效显著，且未见明显低血糖[68]时间发生，有很高的临床推广价值。利格列汀和替格列汀都可以控制2型糖尿[69]病肾病患者的MAGE。对于空服2种以上降糖药物血糖控制不佳的老年T2DM，换用利格列汀联合地特胰岛素或单用门冬胰岛素30均能有效控制血糖,但前种方案日均胰岛素用量少，低血糖反应发生率低,安全性更高,更适合老年T2DM患者[70]。4.3其他平稳血糖的药物2型糖尿病患者血糖的波动变化很大程度上归因于餐后的急性高血糖和各种原因引起的低血糖，目前临床上针对餐后血糖的药物有，α-葡萄糖苷酶抑制剂、格列奈类胰岛素促泌剂、速效胰岛素类似物等。长效胰岛素类似物如甘精胰岛素、地特胰岛素能通过更稳定的吸收达到平稳的血糖控制，减轻血糖波动。甘精胰岛素及预混胰岛素（联用或不联用口服降糖药）降糖效果均较好，但甘精胰岛素在控制空腹血糖的稳定性方面具有优势，且有较低的低血糖发生率[71]。甘精胰岛素和二甲双胍联合治疗初诊2型糖尿病患者，能更有效控制血糖及[72]血糖波动，具有较好的安全性。α-糖苷酶抑制剂对肠道葡萄糖苷酶进行竞争性抑制，使肠道葡萄糖的吸收减少、延缓，达到降低、平稳餐后血糖的治疗目的，成为临床控制餐后血糖最常用药物。对于已接受预混门冬胰岛素治疗的2型糖尿病患者加用阿卡波糖，能够减少血糖变异性和胰岛素用量，降低低血糖发生率，[73]值得临床推广。又有研究发现，将阿卡波糖或维格列波糖换成米格列醇，能降低血糖波动及心血管疾病疾病风险因子（单核细胞趋化蛋白-1，MCP-1；血清[74]可溶性选择素E，sE-selectin）的循环浓度，同时不良反应少。4.4抗氧化保护血管内皮的药物硫辛酸是高效抗氧化剂，清除自由基和活性氧，再生体内谷胱甘肽等其他抗氧化剂，减弱氧化应激，减弱多种糖尿病微血管并发症的诱发因素，并干预多元[75]醇通路与己糖胺通路，对糖尿病微血管并发症中的相应靶器官有保护作用。110 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文硫辛酸联合胰岛素强化治疗较单独胰岛素强化治疗能后更好地恢复胰岛β细胞功[76]能。2型糖尿病患者，在常规降糖药物/胰岛素治疗的基础上，加用α-硫辛酸，治疗后，血清SOD、MDA、超敏C反应蛋白（hs-CRP）较对照组明显改善，说明α-硫酸锌在2型糖尿病的治疗中有利于改善机体氧化应激反应、降低炎性递质[77]水平，对于改善预后、延缓相关并发症的发生发展有重要意义。姜黄素能抗氧化保护血管内皮，清除氧自由基，改善血脂和血糖代谢，抑制晚期糖基化终产物形成，增强抗氧化酶活性，姜黄素抗氧化作用肯定、低毒价廉，随着剂型改进、作用靶点和药效浓度等研究的深入，有望成为有效防治DM及其血管并发症的药[78]物。α-亚麻酸（ALA）是一种植物来源的n-3必需脂肪酸，可显著改善T2DM模型大鼠的血管内皮舒张功能障碍，其机制可能与减轻血管组织的氧化应激有关，对预防DM的多种血管并发症（包括AS）有着重要的临床意义，可谓DM心[79]血管并发症的防治提供一种可选择的非药物性治疗方案。循环内皮祖细胞（EPCs）是能够在成熟内皮细胞中分化的骨髓干细胞，参与血管损伤的平衡和[80][81-82]修复。有研究认为，EPCs的数量和功能是糖尿病周围血管并发症的标志。增加EPCs的数量与功能，具有改善内皮细胞与预防心血管疾病的作用。针对EPCs的治疗能预防甚至逆转并发症，可见EPCs在糖尿病的并发症发病机制中占有一席之地，也是十分有前景的治疗靶点。银杏叶提取物（GBE）对T2DM患者EPCs[83]有保护作用，其机制可能与抗氧化和减少自由基生成有关。5中医药对血糖波动的认识和辨治现代医学对血糖波动的机制研究较为深入和复杂，传统中医学重视辨证论治，并非以单纯某项指标达到正常作为治疗目标，而是整体调理脏腑功能，恢。复机体阴阳平衡，维持机体稳态，从而使血糖平稳。5.1中医对血糖波动的病机认识[84]岳仁宋认为血糖波动是由于“脾气散精”功能失常而引起，出现水谷津液输布和利用上的不平衡及代谢紊乱状态。故临床上应重视从脾论治，通过养脾阴、益脾气、化脾湿、泄脾热、温脾阳等方法，辨病与辨证相结合，标本兼治，[85]使脾运得健，散精功能得复。刘学兰等也强调了脾主运化理论在糖尿病治疗的重要性，运化者，代谢也，脾胃功能失调，不能将胃中腐熟的水谷精微散步全身，从而造成水谷精微聚集成浊壅滞为害，因此，调理脾胃，脾升胃降，水谷精111 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文[86]微散而不滞，机体代谢得到维持，血糖也归于正常。刘桠认为2型糖尿病血糖波动与“脾胰”关系密切，中医之脾，包括胰与脾的功能，从“脾胰同源”的理论辨治血糖波动，脾胰功能失常，导致脾不散精，气化不足，脾病及肾，膀胱开阖失司，固摄无权，精微不藏而泄，故脾（胰）肾亏虚，致气化失司，升清降浊功能失常引起血糖波动。治疗上应扶正祛邪、脾（胰）肾兼顾，以健脾益气、养阴生津为基本法则，达升清降浊、水谷精微转输与利用恢复正常之目的。陆源源[87]从肝论治糖尿病及变证中的作用，认为气机逆乱从疾病初期影响津液的正常布散，郁久化火随经扰动，到后期致浊瘀互结并随经窜乱，是消渴变证丛生的重要诱因，其中气机逆乱导致的血糖波动是浊瘀形成、加速的重要因素。临床中通过疏法先行，协调肝用及润养打底，固护肝体之法，达到减少血糖的目的，每获[88]良效。高阳等从肝脾论治血糖波动，认为血糖波动的基本病机是情志失调致肝脾疏泄失常，饮食不节致肝脾运化失司，从疏肝脾之气，滋肝脾之阴，泄肝脾[89]之热几个方面协调肝脾二脏，从而减少血糖波动。王进波等应用“阴火论”探讨脆性糖尿病，认为脾胃元气不足是消渴形成的始动原因，阴火是血糖波动的重要原因，脆性糖尿病治宜补中益气、升举精微、泻阴火，自拟十味平糖方，由李东垣清暑益气汤化裁而来。为治疗“元气不足，阴火困脾”脆性糖尿病而设。吕雄教授在采用气血及脏腑理论进行指导，临证上注重气血，强调肝脾，认为“肝脾不和”是现代糖尿病发病的重要病因，并自拟舒和胶囊（柴胡、蒲公英、救必应、甘草等）治疗以肝脾不和为主证的糖尿病前期及早期，在改善血糖波动指标[90]上有明显优势。5.2中医减少血糖波动的临床研究关于中医辨治糖尿病患者血糖波动的研究，均为在传统降糖药物的基础上予中医辨治，均能在改善症状的基础上，平稳血糖，减少低血糖反应，提高胰岛素敏感性，改善胰岛素细胞早相分泌功能等。如半夏泻心汤治疗脾虚胃热型消渴病，[91]可减少血糖波动；加味二阴煎，投中医消渴阴虚燥热的病机，平稳降糖，减[92]轻氧化应激和血管内皮损伤；健脾清化方（党参、黄芪、山药、黄精、黄连、黄芩、卫矛、葛根等），可有效减少血糖波动，并能改善胰岛细胞早相分泌功能[93][94-95]。七味白术散加减、玉泉丸治疗气阴两虚型T2DM血糖波动疗效显著。湿热中阻型糖尿病，在西药基础上加用清热理气化浊之方，不仅有稳定血糖波动的[96]效果，同时对整体血糖情况有明显改善。化瘀解毒方联合胰岛素治疗2型糖尿112 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文病的应激状态（如急性心脑血管事件或急性感染），明显缩短血糖达标时间，减[97]少日胰岛素使用剂量，降低低血糖发生率及缩小血糖波动幅度。降糖通络汤[98]减少日内血糖波动、稳定血糖。具有益气养阴活血的丹蛭降糖胶囊能够明显升高糖尿病血糖波动状态下的大鼠的血清SOD活力和空腹血清胰岛素（FINS），[99]以及胰岛明显增大和数量增多。糖脉康颗粒是中药复方制剂，其中的黄芪、生地、麦冬能改善受损的β细胞功能，降低或拮抗升糖激素，提高周围组织对血[100]糖的利用度，改善胰岛素的敏感性；而方中用丹参、赤芍、牛膝活血化瘀，降脂降血黏度以增加胰岛细胞敏感性，从而达到降糖的目的。糖脉康颗粒结合常规胰岛素治疗糖尿病患者可使其血糖波动幅度更小，说明糖脉康颗粒对糖尿病患[101]者有稳定血糖的作用。中成药津力达颗粒具有养阴益气，健脾运津之功，是目前临床常用的降糖中成药之一，具有胰岛功能的作用，临床研究采用津力达联[102]合门冬胰岛素30及二甲双胍治疗T2DM，具有减低平均血糖漂移幅度的作用。5.3中医药减少血糖波动的机制研究研究表明，中医药通过改善胰岛β细胞功能、促进胰岛素分泌、提高对胰岛素的敏感性等机制，从而减少血糖波动。中医药对胰岛β细胞的保护作用作用涉及多种靶点及机制，包括促进胰岛β细胞增殖，减少胰岛β细胞凋亡，并且可以通过改善血清及胰腺组织氧化应激，改善胰岛细胞胰岛素抵抗、提高血清、肝脏及肠道组织胰高血糖素样肽-1（GLP-1）水平、改善胰岛微循环，调节胰岛β细胞自[103]噬水平等途径保护胰岛β细胞。葛根素是葛根中的主要活性成分之一，实验证[104]明，葛根素能明显提高胰腺的胰岛细胞内PDX-1的表达水平，提示葛根素可能通过上调胰岛细胞PDX-1的表达促进胰岛β细胞的增殖。葛根素能抑制葡萄糖波动引起的凋亡相关蛋白PARP和caspase-3的活性，下调bcl-2，上调细胞内bax从[105]细胞质到线粒体的分布。此外，葛根素能抑制葡萄糖波动引起的细胞内ROS升高和线粒体去极化。这些结果表明，葛根素可以通过抑制细胞凋亡以及氧化应[106]激来保护因葡萄糖波动引起的细胞损伤。张茜等通过研究发现天麦消渴片可以上调糖尿病大鼠胰腺miR-375、miR-124a、miR-107和miR-30d的水平，其中miR-375可以刺激胰岛β细胞增殖，抑制胰岛α细胞增殖从而降低血糖。多项研究[107]表明，某些中药有效成分、单味中药及中药复方均可通过提高体内GLP-1水平，达到保护胰岛β细胞，从而发挥调节血糖稳定的作用。113 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文5.4中医证型与血糖波动的相关性研究目前对于血糖波动的中医辨治，尚无统一的中医辨证分型标准，通过临床观察发现，血糖波动与中医证型有相关性。[108]许宋超等把糖尿病的中医证型按照一下几个证型发展：阴虚热盛证、痰湿困脾证、气阴两虚证、阴阳两虚证。发现证候发展与年龄、病程、血糖波动相关：年龄越大，病程越长，血糖波动大者一般表现为气阴两虚证渐进至阴阳两虚[109]证，阴阳两虚往往是糖尿病发展至后期严重阶段的中医证型。张沛然等发现2型糖尿病患者血糖波动与平均血糖无关，而与中医证候具有相关性，虚证类证候[110]血糖波动性较大，阴阳两虚证血糖波动性最大。王志强等运用血糖监测系统（CGMS）研究血糖波动与中医证型规律的关系，发现中医辨证以阴虚火旺为主的糖尿病患者，72小时血糖水平波动偏大；中医辨证以肺胃热盛为主的糖尿病患者，早餐后2小时血糖水平较高；中医辨证以气阴两虚、阴阳两虚为主的糖尿病患者，72小时血糖水平波动较小。此项研究与前两者存在一定差异，需要以后临[111]床进一步验证。卢昉等分析研究T2DM动态血糖谱与证型的关系，发现气阴两虚证患者呈一日三餐特征，并且白天高血糖明显，夜间稍好，且有黎明现象；而脾虚痰湿证多无一日三餐特征。提示脾虚痰湿证患者血糖谱无典型的特征，其原因与痰湿致病广泛，变化多端的特点相关。6总结综上所述，在西医研究方面，人们逐渐认识到防治糖尿病血管并发症的根本不仅仅在于降低血糖及HbA1c，还要控制血糖波动。血糖波动对糖尿病血管并发症影响比持续性高血糖带来的危害更大，血糖波动引起血管并发症的机制研究较多，可总结为加重氧化应激和炎症反应，引起血管内皮功能障碍、细胞凋亡，加重胰岛β细胞功能缺陷、胰岛素抵抗和胰岛细胞凋亡。但关于血糖波动的影响因素研究不多，以及西药减少血糖波动的机制研究较少，应该在以后的研究当中，就血糖波动的影响因素及其对应措施，以及减少血糖波动的机制进一步探索。在中医研究方面，中医在辨治血糖波动能整体调节，增强脾气健运功能，使水谷精微布散正常；疏肝理气，调畅气机，活血通络化瘀；补肾气，使脏腑功能调和，通过整体调整脏腑阴阳，减少血糖的波动性，同时联合西药降糖药能缩短治疗时间，使血糖更趋于平稳，同时在糖尿病血管并发症的防治中具有明显优势。114 成都中医药大学2018届博士研究生学位论文中医药中医对血糖波动的临床研究及基础研究相对较少，缺乏对中医药辨治血糖波动公认的辨证体系，运用动态血糖监测系统（CGMS）研究血糖波动与中医证型的相关性需要进一步扩大样本量，进行深入研究，为中医临床诊治通过依据，中医药减少血糖波动的机制也需要进行深一步探索，为中医药平稳降糖提供理论支撑。参考文献：[1]YangW,LuJ,WengJ,JiaW,JiL,XiaoJ,etal.PrevalenceofdiabetesamongmenandwomeninChina.NEnglJMed.2010;362:1090–101.[2]XuY,WangL,HeJ,BiY,LiM,WangL,etal.PrevalenceandcontrolofdiabetesinChineseadults.JAMA.2013;310:948–59.[3]TheDiabetesControlandComplicationsTrialResearchGroup.Therelations-hipofglycemicexposure(HbA1c)totheriskofdevelopmentandprogres-sionofretinopathyintheDiabetesControlandComplicationsTrial.Diabetes1995;44:968–983[4]BrownleeM,HirschIB.Glycemicvariability:ahemoglobinA1c-independentriskfactorfordiabeticcomplications.JAMA2006;295:1707–1708[5]FrontoniS,DiBartoloP,AvogaroA,BosiE,PaolissoG,CerielloA.Glucosevariability:anemergingtargetforthetreatmentofdiabetesmellitus.DiabetesResClinPract.2013;102:86–95.[6]MonnierL,ColetteC.GlycemicVariability:shouldweandcanwepreventit？Diabetescare,2008,31:S150-S154.[7]周健,贾伟平.血糖波动的评估方法及研究进展[J].中华内分泌代谢杂志.2010,26(3):261-264.[8]李强,李鹏杰.血糖波动的意义及临床评估方法[J].中国实用内科杂志,2009,876-878.[9]中华医学会内分泌学分会.糖尿病患者血糖波动管理专家共识[1].药品评价,2017,14(17):5-14.[10]KohnertKD,AugsteinP,ZanderE,etal.Glycemicvariabilitycorrelatesstronglywithpostprandialbeta-celldysfunctioninasegmentoftype2diabeticpatientsusingoralhypoglycemicagents[J].DiabetesCare,2009,32(6):1058-1062.[11]CandidoR.Whichpatientsshouldbeevaluatedforbloodglucosevariability?[J].115 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成都中医药大学2018届博士研究生学位论文在读期间公开发表的学术论文序成果（论文、专著、获奖项目）成果鉴定、颁奖部门及奖本人署名号名称励类别、等级或发表刊物次序与出版单位、时间1从限食疗法改善脾主散精功能探《中医杂志》2018年4月第一作者讨2型糖尿病的防治2基于“脾胰同源”理论从脾论治《中医杂志》2017年9月第一作者糖尿病3从“伏邪”理论探讨糖尿病大血《吉林中医药》2016年11第一作者管病变的防治月124 成都中医药大学２０１８届博士研究生学位论文独创性声明本人郑重申明：所呈交的学位论文是本人在成都中医药大学攻读博士学位期间在导师指导下独立进行研宄工作所取得的成果，无抄。据我所知，袭及编造行为，除了文中特别加以标注和致谢的地方外一本论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。ＩＶＶ＿＿学位论文作者签名（亲笔年４月丨日学位论文使用授权书根据国家相关规定。本人同，己通过的学位论文应当公开发表意、复印等手段汇编学位论文予以保：成都中医药大学有权通过影印存，并提供査阅和借阅；有权向国家有关部门、其他相关机构送交论文及电子版（或刊登）论文内容。，公布保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者签名（亲笔）：年《月丨日指导教师签名（亲笔以年６月丨日＊．１２５
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