《野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
：Ｓ分类号？５１２授予学位单位代码：１０４３４研究生学号：２０１３１１０２０５山東農業大學硕士学位论文‘Ｄ’野生二粒小麦ＩＣ４７９抗白粉病基因的定位及应用ＭａｐｐｉｎｇａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＰｏｗｄｅｒｙＭｉｌｄｅｗＲｅｓｉｓｔａｎｃｅ‘’ＧｅｎｅｉｎＴｒｉｔｉｃｕｍｄｉｃｏｃｃｏｉｄｅｓＤＩＣ４７９研究生：闫百蔷学科专业：作物遗传育种学研究方向：植物生物技术及其在育种上的应用学院：农学院指导教师：付道林教授２０１６年６月１０日 分类号：S512授予学位单位代码：10434研究生学号：2013110205山東農業大學硕士学位论文野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用MappingandApplicationofthePowderyMildewResistanceGeneinTriticumdicoccoides‘DIC479’研究生：闫百蔷学科专业：作物遗传育种学研究方向：植物生物技术及其在育种上的应用学院：农学院指导教师：付道林教授2016年6月10日 论文提交日期：2016年5月13日论文答辩日期：2016年5月29日学位授予日期：2016年6月学科门类：农学答辩委员会主席：程治军 关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并向社会公众提供信息服务。保密论文在解密后应遵守此规定。丨羽Ｉ论文作者签名：导师签名：１日期： 符号说明缩写英文名称中文名称AcrAcrylamide丙烯酰胺AFLPAmplifiedfragmentlengthpolymorphism扩增片段长度多态性bpBasepair碱基对CAPSCleavedamplifiedpolymorphicsequences切割扩增长度多态性ddH2ODistilleddeionizedwater重蒸水DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸EBEthidiumbromide溴化乙锭EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸ESTExpressedsequencetag表达序列标签PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳PCRPolymerasechainreaction聚合酶链式反应PmPowderymildew白粉病QTLQuantitativetraitlocus数量性状位点RAPDRandomamplifiedpolymorphicDNA随机扩增多态性DNARFLPRestrictionfragmentlengthpolymorphism限制性片段长度多态性rpmRoundsperminute转/分钟SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基硫酸钠SNPSinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性SSRSimplesequencerepeat简单重复序列TEMEDN,N,N’,N’-tetramethylethylenediamineN，N，N’，N’-四甲基乙二胺 目录目录................................................................................................................................................7中文摘要......................................................................................................................................IAbstract...........................................................................................................................................III1前言.................................................................................................................................................11.1小麦白粉病.................................................................................................................................11.1.1小麦白粉菌..............................................................................................................................11.1.2小麦白粉病的生理学特性.....................................................................................................21.1.3小麦白粉菌的分布.................................................................................................................21.1.4小麦白粉病的传播及流行规律............................................................................................31.1.5小麦白粉病的危害及症状.....................................................................................................41.1.6小麦白粉病的防治.................................................................................................................51.2小麦抗白粉病的类型................................................................................................................61.2.1小麦抗白粉病的质量抗性.....................................................................................................61.2.2小麦抗白粉病的数量抗性.....................................................................................................71.2.3感白粉基因..............................................................................................................................81.2.4抗白粉病抑制基因.................................................................................................................81.3小麦抗白粉病基因及其定位....................................................................................................81.3.1小麦抗白粉病基因的来源.....................................................................................................81.3.2小麦抗白粉病质量抗性基因.................................................................................................91.3.3小麦抗白粉病数量性状基因..............................................................................................121.4小麦抗白粉病性状的遗传分析.............................................................................................131.4.1遗传分析................................................................................................................................131.4.2基因的染色体定位...............................................................................................................131.4.3抗病基因推导........................................................................................................................141.5基因定位的方法.......................................................................................................................151.5.1分子标记................................................................................................................................15 1.5.2比较基因组学........................................................................................................................161.5.3Goldengate技术....................................................................................................................161.6小麦抗白粉病基因的紧密连锁标记.....................................................................................171.7小麦抗白粉病基因的抗病性评价及应用.............................................................................181.8野生二粒小麦中的抗白粉病基因资源及应用....................................................................191.9目的及意义...............................................................................................................................202材料与方法..................................................................................................................................212.1试验材料...................................................................................................................................212.1.1植物材料................................................................................................................................212.1.2小麦白粉菌............................................................................................................................212.1.3生化试剂及引物...................................................................................................................222.1.4试验地点................................................................................................................................222.2试验方法...................................................................................................................................222.2.1春化处理................................................................................................................................222.2.2小麦白粉菌接种...................................................................................................................222.2.3小麦白粉病表型鉴定...........................................................................................................232.2.4群体构建................................................................................................................................242.2.5PmD479基因的分子标记辅助选择...................................................................................252.2.6常规试验方法........................................................................................................................262.2.7遗传连锁图............................................................................................................................313结果与分析..................................................................................................................................323.1抗病性鉴定...............................................................................................................................323.1.1小种特异抗病性鉴定...........................................................................................................323.1.2混合小种抗病性鉴定...........................................................................................................323.2抗病性状的遗传分析..............................................................................................................333.2.1遗传分析群体........................................................................................................................333.2.2DIC479抗白粉病的遗传分析............................................................................................333.3PmD479抗病基因的定位.......................................................................................................35 3.3.1基因定位群体........................................................................................................................353.3.2基于SNP芯片的BSA分析...............................................................................................353.3.3利用共线性定位基因...........................................................................................................373.3.4利用小麦基因组序列定位...................................................................................................393.3.5利用pop3000重组体定位PmD479...................................................................................423.4分子标记辅助选择..................................................................................................................423.4.1PmD479抗病基因供体的选择...........................................................................................423.4.2PmD479抗病基因受体亲本的选择...................................................................................443.4.3PmD479抗病基因的转移...................................................................................................444讨论...............................................................................................................................................474.1PmD479基因的抗白粉病表现及应用..................................................................................474.2PmD479是否为新型抗白粉病基因......................................................................................484.3PmD479远着丝粒端分子标记的开发..................................................................................495结论...............................................................................................................................................50参考文献...................................................................................................................................51附录..............................................................................................................................................59附录1DNA提取相关溶液配制方法..........................................................................................59附录2PCR产物检测及转化过程所需溶液配制方法.............................................................59致谢..............................................................................................................................................61攻读学位期间发表的论文............................................................................................................63 山东农业大学硕士学位论文中文摘要小麦白粉病是由布氏白粉菌小麦专化型(Blumeriagraminisf.sp.Tritici)引起的真菌性病害，主要发生在气候较为湿润的小麦种植区域。随着耕作制度和生产条件的变化，小麦白粉病逐渐成为全球小麦生产的重要病害。在众多防治小麦白粉病的方法中，培育和推广抗病品种以及抗病基因聚合育种是防治小麦白粉病最经济、安全和有效的手段。小麦抗白粉病基因的发掘和利用是选育抗病品种的先决条件。野生二粒小麦(Triticumdicoccoides.AABB,2n=4X=28)，是普通小麦A、B基因组的直接供体，携带多种抗病基因，是小麦遗传改良的重要资源。本研究基于野生二粒小麦‘DIC479’高抗小麦白粉菌的表现，围绕DIC479的白粉病抗性开展遗传分析及基因定位研究，为研究该抗病基因的功能和作用机制奠定基础，也为小麦抗病育种提供了新型种质资源。本研究利用野生二粒小麦DIC479与栽培二粒小麦（TriticumdicoccumSchrank）‘Langdon’，创制了F1植株、F2群体（pop2和pop3000）及其部分F3家系、F2:3亚群体及其F2:4家系，并利用它们对DIC479中的抗白粉病基因进行遗传分析和定位。另外利用分子标记辅助选择将DIC479的抗白粉病基因转育到普通小麦（T.aestivum）中。获得如下结果：1.在温室条件下，测试DIC479、Langdon及其杂交后代的白粉病抗性，F1植株对白粉病表现高抗；F2群体（pop2）及两个F2:3亚群体（pop731和pop2512）中单株之间抗病和感病分离明显，接近3抗:1感；相应的F3及F2:4家系中抗病株行、抗感分离株行和感病株行的比例接近1:2:1，符合单基因孟德尔遗传定律。可见DIC479的抗白粉病表现受单显性基因控制，并命名为PmD479。2.从F2群体（pop2）中选取10株感病单株分别提取基因组DNA，配合使用群体亲本DNA，开展基于小麦90KSNP芯片的群体分离分析(BulkedSegregationAnalysis,BSA)，初步确定该基因位于小麦2B染色体长臂。结合中国春缺体-四体分析、小麦与大麦、水稻和山羊草之间的共线性开发了26个与该抗病基因连锁的分子标记。最终将PmD479基因定位于sdau149和sdau148B区间，大约0.5cM距离。sdau149距PmD479基因0.17cM，可用于分子标记辅助选择。I 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用3.为了将PmD479基因用于小麦抗病育种，本研究利用DIC479及F3家系中的抗病单株与现行推广普通小麦杂交，已获得9个杂交组合，共14份杂交种（BC1F1世代）。关键词：小麦白粉病；基因定位；分子标记；抗病育种；二粒小麦II 山东农业大学硕士学位论文MappingandApplicationofthePowderyMildewResistanceGeneinTriticumdicoccoides‘DIC479’AbstractWheatpowderymildewiscausedbythefungusBlumeriagraminisf.sp.tritici.Itoccursmainlyinwheatproductionareawithhumidconditions.Alongwiththechangeoffarmingsystemandproductionconditions,powderymildewhasbecomeaseriousdiseaseforglobalwheatproduction.Pyramidingofdiseaseresistancegenes,breedingandapplicationofdisease-resistantvarietiesappeartobethemosteconomic,safeandeffectivemethodtocontrolthedisease.Explorationanddeploymentofpowderymildewresistancegenesplayaprimaryrolefordevelopingdisease-resistantvarieties.Wildemmer(Triticumdicoccoides,AABB,2n=4X=28),carryingmanydiseaseresistancegenes,isanimportantresourceforwheatgeneticimprovement.Inthisstudy,wetargetedthewildemmer'DIC479',anaccessionhighlyresistanttowheatpowderymildew,analyzeditsgeneticbasefordiseaseresistance,andmappedthegene.Thisworkfoundedfuturestudiesongenefunctionandunderlyingmechanisms,andgeneratednovelresourcesfordiseaseresistancebreedinginwheat.Inthisstudy,DIC479and‘Langdon’(TriticumdicoccumSchrank)wereusedtogeneratetheF1plants,F2populations(pop2andpop3000)andtheirF3families,F2:3subpopulationandtheirF2:4families,whichwereusedforgeneticanalysisandgenemappingforpowderymildewresistanceinDIC479.Usingmarker-assistedselection,thepowderymildewresistanceofDIC479hasbeentransferredintocommonwheat(T.aestivum).Majorresultsareasfollows:1.Ingreenhousecondition,wetestedDIC479,Langdonandtheircrossprogeniesfortheirreactiontopowderymildew.TheF1plantswerehighresistant;plantsoftheF2population(pop2)andtwoF2:3subpopulations(pop731andpop2512)segregatedforresistance(R)andsusceptibility(S)with3Rvs.1S;linesofthecorrespondingF3andF2:4familiessegregatedforhomozygousresistance(RR),hetetrozygous(RS),andhomozygousIII 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用susceptibility(SS)with1RRvs.2RSvs.1SS.Therefore,thepowderymildewresistanceinDIC479inheritsasasingledominantMendeliantrait.WetemporarilynamedtheunderlyinggeneasPmD479.2.Weperformedbulkedsegregationanalysis(BSA)ontensusceptibleF2plantsofpop2byusingthewheat90KSNPassay,andmappedthePmD479geneonthelongarmofchromosome2B.Wethendeveloped26linkedmarkerstoPmD479usingtheChinesespringnulli-tetrasomicsandcollinearinformationofAegilopstauschii,barely,andricegenomes.ThePmD479genewasmappedbetweensdau149andsdau148B,whichisaboutan0.5cMinterval.Thesdau149isonlyaoubt0.17cMawayfromPmD479,andcouldfacilitatemarker-assistedselection.3.ToutilizePmD479fordiseaseresistancebreedinginwheat,DIC479and/orF3resistantplantswereusedtocrosswithselectgedcommonwheat.FourteenBC1F1lineshasbeenobtainedwithdesirableresistancetopowderymildew.Keywords：Wheatpowderymildew;Genemapping;Molecularmarker;Diseaseresistancebreeding;EmmerwheatIV 山东农业大学硕士学位论文1前言小麦是世界上重要的粮食作物，为人类提供约20%能量，是全世界将近35%人口的重要粮食来源（Guptaetal.,2010）。在我国，小麦的栽培范围广泛，在种植面积和产量方面仅次于水稻，是我国主要粮食作物，其生产关乎我国粮食安全。小麦的生产受各种不利因素限制，例如光照、土壤、水分、病虫等，其中病虫害是威胁小麦生产的重要因素。提高小麦抗病虫害能力是小麦育种工作的一项重要任务。小麦病害多种多样，记录在案的约200种。我国小麦病害20余种，比如小麦锈病、白粉病、赤霉病等，其中小麦白粉病的危害程度最为严重（徐志，2013）。近年来，小麦白粉病的发生面积与危害程度一直保持较高的水平，这与水肥条件的改善、栽培技术的更进、矮秆品种的推广以及小麦白粉病抗源的同质化等因素具有密切联系。世界范围内，小麦白粉病也成为影响小麦生产的重要病害之一。与其它白粉病防治方法相比，培育和推广抗病品种以及抗病基因的聚合育种是防治小麦白粉病最为经济、安全和有效的手段。普通小麦（Triticumaestivum）中的抗白粉病基因资源有限，但小麦二倍体、四倍体近缘物种及其远缘物种中蕴藏着丰富的抗病基因资源。针对小麦近缘和远缘物种中的抗病基因，通过回交转育、远缘杂交、基因工程、细胞工程等方法导入栽培小麦中，可实现栽培小麦的抗病性改良和培育新型抗病品种。因此，从小麦近缘和远缘物种中挖掘新型抗病基因是小麦抗病育种工作的重要环节。小麦白粉病抗性多为垂直抗性且抗源单一，新型抗病品种释放的速度往往落后于白粉菌小种的进化，常导致小麦对白粉菌的抗性丧失。新型白粉菌抗病基因的研究及其抗病种质的创制将有利于培育持久抗病和广谱抗病的小麦新品种，加强小麦抗白粉病育种效果，对小麦抗白粉病育种具有重大意义。1.1小麦白粉病1.1.1小麦白粉菌小麦白粉病是一种严重影响小麦产量和品质的真菌性病害，它是由小麦白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.tritici)引起的。白粉菌的种类很多，1903年比利时学者Marchal首次从禾谷白粉菌中分离获得小麦专性寄生的白粉菌。该菌只能在活体组织上寄生和1 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用繁殖，其分类地位为：子囊菌亚门（Ascomycitls），核菌纲（Pyrenomycetes），白粉菌目（Erysiphaceal），白粉菌科，白粉菌属。小麦白粉菌具有很强的专化性，主要危害小麦，也危害小麦近缘种属，如一粒和二粒小麦等，但对大麦没有侵染性。反过来，大麦白粉菌对小麦及其近缘种属亦没有侵染能力。由于小麦白粉菌与寄主作物间的适应性协同进化，加上白粉菌与环境之间的相互选择，常导致白粉菌不同生理小种的形成，毒性改变。1.1.2小麦白粉病的生理学特性小麦白粉菌的分生孢子在相对湿度5%-100%的范围内都可以萌发并侵染寄主材料，但以高湿而不会形成水滴的条件最为适宜，白粉菌分生孢子的正常萌发需在98%以上的相对湿度，而在水滴中，孢子的萌发率会减小。温度在0.5-30℃范围内分生孢子均可以萌发，以10-20℃最为适宜。光照可以抑制孢子的萌发。当小麦种植密度过大导致通风性和透光度过低，或在阴雨潮湿的地区，会加重小麦白粉病的发生。在发病过程中，首先在植株下部的老叶上形成闭囊壳，以后逐渐蔓延至上部叶片。温度越高、湿度越大，其能存活的时间就越短，若将闭囊壳浸泡在水中则其寿命更短。在1-27℃范围内均能形成子囊孢子，最适温度为10-20℃，光线几乎不会影响子囊孢子的形成。湿润的环境是闭囊壳释放已形成的子囊孢子的必要条件，温度以10℃最为适宜，当温度高于25℃时将显著降低闭囊壳释放子囊孢子的数量。从开始释放子囊孢子到停止释放子囊孢子仅有2天时间。子囊孢子的萌发及侵染和分生孢子的萌发及侵染对环境中温度和湿度的要求相似，子囊孢子侵入寄主的最适温度为10-20℃。温度不同，子囊孢子完成侵染所需时间亦不相同，在最适宜温度下，子囊孢子只需要1天时间便可以完成侵染，若温度降低到5℃以下时，则需要多于两天的时间才能完成侵染（郝元峰，2008）。1.1.3小麦白粉菌的分布小麦白粉病的发生源远流长，早在1900年，欧洲已有报道，包括法国、比利时、英国、丹麦、爱尔兰、荷兰、芬兰及瑞士等国，且发病程度较重。另外在加拿大、美国和墨西哥等国家也有发生但发病程度较轻。目前，除部分热带地区外，小麦白粉菌的危害遍及世界各地小麦种植区（Bennett,1984；何家泌等，1998；宋玉立等，1998）。2 山东农业大学硕士学位论文1927年，我国江苏省首次发现了小麦白粉病，其后在气候比较湿润的中国西南各省和山东沿海地区都有发现。1970年代以来，我国农业发展速度加快，耕作制度变化很大，生产条件不断改善。为增加产量全面推行了半矮秆品种的选育，随后推广的半矮秆品种加大了小麦的种植密度和水肥施用量，并导致小麦白粉病的普遍发生。目前，我国小麦白粉病常发地已经涉及20多个省市，发病较重的地区包括：江苏、河南、湖北和安徽等地。西北和东北辽宁等地春麦区的发病程度也越来越严重（盛宝钦等，1996；刘万才等，1998；何家泌等，1998；孙黛珍等，2004；张跃进等，2009）。小麦白粉病已成为威胁我国小麦生产安全的主要病害之一，在世界各大麦区也由次要病害上升为主要病害。1.1.4小麦白粉病的传播及流行规律白粉菌对小麦的侵染具有多循环性，包括无性世代和有性世代，在小麦活体植株上主要以无性繁殖的方式产生大量的分生孢子进行侵染。随着温度的上升，亲和性交配型之间通过有性重组形成闭囊壳。分生孢子在风力作用下远距离传播，导致小麦白粉病的流行(Koltinetal.,1970；Wolfeetal.,1978；Brownetal.,2002)。在田间，小麦白粉病通常于11月下旬或12月上、中旬，首先发生在早播感病小麦品种上，病害在冬季仍然能继续缓慢发展，一般以菌丝和分生孢子的形式在秋播麦苗基部叶鞘或叶片组织上越冬。影响白粉菌越冬的主要因素是温度，其次是湿度。如果冬季温暖且比较湿润，寄主植物保持活力则有利于病原菌的越冬(刘孝坤，1989)。翌年春季，待小麦返青后，潜伏在寄主植物上的白粉菌继续产生分生孢子，利用气流传播逐渐扩大危害范围。3月底至4月初便可发展成为中心病团。4月中旬以后，温度和湿度条件适宜，病原菌不断产生分生孢子，感病植株迅速增多，导致春季病害流行。4月下旬至5月中旬，正值小麦齐穗至灌浆期，由于气温继续上升，闭囊壳开始出现于小麦植株下部叶片上，直到5月下旬，小麦接近成熟时，闭囊壳普遍形成（刘孝坤，1989；牛吉山，2007）。在我国，小麦白粉菌主要通过两种方式越夏。一是在夏季气温比较低的地区，小麦白粉菌以分生孢子的形式在自生麦苗或夏播小麦植株上继续侵染繁殖，其中自生麦苗是病原菌越夏的主要寄主植物，另外白粉菌还以潜育菌丝的形式在此地区越夏。在夏季，当平均最高气温低于23.5℃时分生孢子可以顺利越夏，在平均最高气温为3 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用24-26℃时病原菌勉强可以在荫蔽处越夏(刘逸卿等，1985；刘孝坤，1989)。二是在低温干燥的条件或地区，小麦白粉菌以闭囊壳的形式附着于种子或病残体上越夏，并成为秋苗发病的初侵染源。在黄淮麦区，由于夏季气温高，分生孢子保持侵染力的时间又很短，因此病叶上残存的菌丝不能渡过夏季，但在夏季干燥条件下，子囊可在麦残体上越夏，待秋季湿度适宜时放出子囊孢子侵染冬前麦苗。病原菌越夏后，首先导致越夏区的秋小麦幼苗发病。随后分生孢子在风力作用下传播到附近的小麦种植区，并侵染该地区的秋播麦苗。因此，种植在越夏区及其附近的秋小麦幼苗发病较早且较严重。小麦白粉菌侵染流程见示意图1.1。图1.1小麦白粉菌侵染流程图(薛飞，2009)Figure1.1Theinfectionflowchartofwheatpowderymildew1.1.5小麦白粉病的危害及症状白粉病最大的危害是造成产量损失。随着发病程度的加重，白粉病可引起小麦产量下降13%-34%，发病严重时将减产50%以上（Leathetal.,1989；Evertsetal.,1992；Griffeyetal.,1993；Kapooretal.,1993）。从幼苗到成熟植株都能被白粉菌侵染。小麦幼苗时期容易被白粉菌侵染，引起发育受阻甚至幼苗死亡。在分蘖期，白粉菌影响根发育并减少分蘖形成(Jones,1987；Parry,1990)。白粉菌是一种外部病原菌，菌丝覆盖在叶片的外表面导致光合作用降低。作为活体寄生菌，白粉菌依靠寄主提供营养物质，4 山东农业大学硕士学位论文加重了寄主组织的代谢负荷。发育晚期，白粉菌侵染则减少籽粒数、籽粒大小，导致千粒重和容重下降。小麦白粉菌可以侵染小麦叶片、叶鞘、茎秆和穗部，主要侵染小麦叶片（图1.2）。小麦白粉菌发病初期首先在叶片上产生黄色斑点，然后这些斑点逐渐扩大，形成圆形或椭圆形病斑。发病部位表面呈现灰白色粉状霉层，严重时粘连成片。通常叶片正面比背面的菌丛多，下部叶片发病较上部叶片严重。组织受到白粉菌侵染后，首先在组织表面出现白色绒絮状霉斑，以后扩大增厚为一层粉状物，即菌丝无性阶段所产生的分生孢子。菌丛初发时呈薄丝网状，严重时粉状霉层覆盖整个叶片，霉层厚度可达2mm左右。后期，在有性阶段菌丛散生灰褐色至黑褐色的闭囊壳，会导致叶片变为黄褐色或枯死，严重影响光合作用和植物的正常新陈代谢，使植物出现早衰，致使产量受到损失。小麦穗部受害会引起小麦籽粒不饱满甚至腐烂的现象，发病严重的病株矮小而柔弱，不抽穗或抽出的穗短而小（何家泌等，1998；郭小山等，2006；牛吉山，2007）。图1.2小麦白粉病表型Figure1.2Phenotypeofwheatpowderymildew1.1.6小麦白粉病的防治20世纪70年代以前，国内外很少开展小麦白粉病的大面积防治。近年来，随着病害发生的恶化，白粉病的防治工作引起了各地的重视，并相继开展了防治白粉病的研究和实践（宋玉立等，1998）。5 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用小麦白粉病的防治可以通过选育和推广抗病品种、农田栽培管理、化学药剂防治等方法来进行。第一，选育和推广抗病品种以及抗病基因聚合育种是防治小麦白粉病最为经济、安全且有效的方法。在小麦生产中应注重不断选育新的抗病品种，尤其是多抗品种的选育；在地域上合理布局抗病品种，切断病菌的循环途径，增加抗病持久性，延长抗病品种的使用年限。第二，收获后应及时翻耕，并在小麦播种前，彻底清除小麦残株、自生麦苗和带病秸秆,以消灭和降低初侵染源的数量。第三，小麦白粉病的发病程度,不仅受到气候条件的影响,还与麦田的栽培管理密切相关，尤其与磷钾肥的施用量、灌水、排涝以及植株的密度有重大关系,采用适当的农业措施将有助于小麦白粉病的防治。第四，化学药剂防治，主要是应用一些化学药剂（如：三唑酮、甲基硫菌灵、多菌灵、丙环唑、醚菌酯等单剂和各种复合制剂），处理小麦种子或直接对小麦植株进行喷雾。第五，生物防治，生物制剂如：苦皮藤、S-930-6发酵液、放线菌239菌株的发酵液等的使用对小麦白粉病的预防和治疗均有较好的效果（宋玉立等，1998；张宏伟，2009）。1.2小麦抗白粉病的类型抗病性是生物体对潜在病原攻击的防卫能力。根据小麦对白粉菌的抗病表现可以将其划分为：质量抗病性和数量抗病性两种类型。根据数量抗病性的表现特点又可以细分为部分抗性、慢粉性、成株抗性、田间抗性、持久抗性、残留抗性等。与小麦抗白粉病反应相关的还有感病基因和抗病抑制基因等。1.2.1小麦抗白粉病的质量抗性质量抗性(Qualitativeresistance)一般由一个或少数几个主效基因决定，对病原菌的抗病性在苗期开始表现，具有小种专化性，受环境影响小；作为质量性状，一般抗病性强，与感病材料杂交其后代呈现抗病和感病分离，通常符合孟德尔遗传定律（Scott,1980）。小种专化型抗病性又称为垂直抗性、全生育期抗性（All-stageresistance,ASR），在植株生长的整个阶段都表现抗病反应，这种类型的抗病性只对某一确定的白粉菌生理小种表现抗性，对其它的小种没有抗病性，即符合Flor的“基因对基因”假说（Flor，1955；Flor，1971）。小麦对白粉菌的质量抗病性多由单基因控制。培育具有这种抗病性的品种相对容易，而且所培育的品种抗病性较高，在白粉菌侵入时可产生过敏性坏死反应6 山东农业大学硕士学位论文（hypersensitivereaction,HR），使被侵染的细胞及其邻近的细胞高度敏感，并迅速坏死，形成坏死斑，将病原菌封杀在枯死组织中不能扩展，可以有效地抑制白粉菌的侵入和扩展，从而表现出高抗或免疫，能有效的防治病害的发生。因此，农业生产上广泛使用的抗病品种大多是垂直抗性品种。由于质量抗病性是具有小种专化型的垂直抗病性，如果常年大面积推广携带单一抗病性基因的作物品种，容易导致相应毒性生理小种的大量繁殖，最终上升为优势小种而导致该品种失去抗性，即质量抗性会随着病原菌生理小种的改变而失去原有的抗病性，因此这种抗病性一般不能稳定并持久的发挥作用(张秋等，2012)。历史上，我国种植的普通小麦大部分携带抗病基因Pm8，由于生理小种的变化，该基因的抗病性已经失去作用。此外，Pm1，Pm3，Pm5，Pm7，Pm2，Pm4和Pm6等抗病基因也已经或正在被新型生理小种所克服并逐渐失去抗病性（张海泉，2008）。1.2.2小麦抗白粉病的数量抗性数量抗性（Quantitativeresistance）通常指在不含有质量抗病性基因或者质量抗病性基因已经失去效应的品种中发现的。所以，数量抗病性是在品种的遗传背景下，由一个或多个未被鉴定的抗病基因控制的。对病原菌的抗性一般只在成株期表现，为数量性状；具有水平抗病性的特点，没有小种专化性或专化性较弱，受环境影响大；数量抗病性基因的作用效应小，抗性表现不完全，与感病材料杂交其后代抗病和感病分离呈正态分布或偏正态分布，呈现明显的超亲现象，偏离孟德尔的遗传定律（Scott，1980）。小麦白粉病的数量抗病性为复杂多基因控制，是多个微效基因共同作用的结果。鉴定的关键是抗病表型作用大小，一般只在成株期表现，亦称为成株抗性（adultplantresistance,APR）、慢粉性（slowmildewing）或部分抗性（partialresistance）(Robertsetal.,1970；Shaner,1973;Hautesetal.,1987；Griffeyetal.,1993；Griffeyetal.,1994)。具有数量抗病性的品种对多个或所有小种都有抗性，主要通过延缓白粉菌的侵入、扩展和繁殖而起到抗病的作用，一般表现为中度抗病，抗病性不完全。在病害发生和流行过程中，抗病基因能有效减缓病害的发生，减轻对寄主植物的侵害。使用数量抗病性品种不会由于定向选择引起病原菌生理小种的变化，使病原菌和寄主能够共存，较好地保持品种的抗病性。因而，数量抗病性品种具有较持久和稳定的抗病性。7 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用1.2.3感白粉基因Pink等发现，在小麦第5部分同源群的长臂上存在一个或几个促进感病性的基因(Pink,1983)。这样，通过消除或使这种感病基因发生突变，其所携带的抗病基因就可以表现出来。1.2.4抗白粉病抑制基因远缘杂交导入的外源基因在栽培植物中通常以两种方式表现功能：一种是外源基因在栽培品种中直接表现固有功能；二是外源基因受栽培品种遗传背景影响，通过与栽培品种遗传背景互作发挥作用（任正隆，1991）。黑麦抗白粉病基因Pm8和Pm17在普通小麦中常出现受抑制而无法发挥作用的现象。Zeller和Hsam等利用‘Caribo’单体系对Pm8和Pm17的抑制基因进行染色体定位，通过单体分析将该抑制基因定位在7D染色体（Hanuováetal.,1996；Zelleretal.,1996；Renetal.,1997；Hsametal.,1997）。1.3小麦抗白粉病基因及其定位1.3.1小麦抗白粉病基因的来源普通小麦中的抗白粉病基因有限，大多数抗病基因来源于原始和野生小麦，小麦属的其它物种中也携带各种抗白粉病基因。小麦抗白粉病基因包括如下3个主要来源（张海泉等，2003；詹海仙等，2010）。普通小麦，包括地方品种、栽培品种、外来品种及其它携带小麦AABBDD染色体组的种和亚种。由于和小麦具有相似的基因组组成，在杂交过程中染色体可正常配对，杂种可育，正常结实且无生殖隔离，基因转移容易，可以通过杂交育种、回交转育或基因工程等方法将抗病基因转移到普通小麦栽培品种中。这类抗源材料在生产上比较容易利用，可进一步将已转入外源抗病基因的小麦品种应用于栽培小麦的改良及小麦新品种的选育（詹海仙等，2010；董玉琛等，2000）。该类来源的抗白粉病基因包括已命名的：Pm1a、Pm1c、Pm1e（Pm22）、Pm3a-Pm3j、Pm4c(Pm23)、Pm5b-Pm5e、Pm9、Pm10、Pm11、Pm14、Pm15、Pm24、Pm28、Pm38、Pm29、Pm24、Pm24b、Pm28、Pm38、Pm39、Pm44、Pm45、Pm46、Pm47、Pm52、pm53。小麦近缘种，即具有1-2个与普通小麦类似基因组的物种。已命名的基因包括来自8 山东农业大学硕士学位论文一粒系的Pm1b和Pm4d(栽培一粒小麦T.monococcum)，Pm25(野生一粒小麦T.boeoticum)；来自二粒系的Pm4a、Pm5a和Pm50(栽培二粒小麦T.dicoccum)，Pm16、Pm26、Pm30、Pm31、Pm36、Pm41和Pm42(野生二粒小麦T.dicoccoides)，Pm4b和Pm33（波斯小麦T.carthlicum）；来自提莫菲维小麦（T.timopheevi)的Pm6、Pm27和Pm37；来自斯卑尔脱小麦（T.spelta）的Pm1d和来自圆锥小麦（Strangulata）的Pm36。小麦近缘属，包括山羊草属，偃麦草属，簇毛麦属，黑麦属等。已命名的基因包括山羊草属的Pm12和Pm32(拟斯卑尔脱山羊草Ae.speltoides)，Pm13(高大山羊草Ae.longissina)，Pm2、Pm19、Pm34、Pm35和Pm53(粗山羊草Ae.boeoticum)，Pm29(卵穗山羊草Aegilopsovata)；黑麦属（Secale）的Pm7、Pm8、Pm17和Pm20；簇毛麦属（Haynaldia）的Pm21和偃麦草属的Pm40、Pm43和Pm51。1.3.2小麦抗白粉病质量抗性基因依据小麦对白粉病的抗性表现，可将小麦抗白粉病基因分为质量性状抗病基因和数量性状抗病基因。控制质量抗病性的基因又分为显性和隐性基因。1930年，澳大利亚学者Waterhouse首先报道了小麦抗白粉病基因，为单显性抗白粉病基因。随后，人们在普通小麦及其近缘种属中相继发现了多个抗白粉病基因，并开始它们的遗传分析和染色体定位研究。据报道，正式命名的抗白粉病基因中除了Pm5、Pm9和Pm26是隐性抗病基因外其它的抗白粉病基因都是显性抗病基因（Lebsocketal.,1974；Schneideretal.,1991；Rongetal.,2000）。在临时命名的抗白粉病基因中，也有隐性基因。国际上，使用Pm（Powderymildew）表示正式命名的抗白粉病基因，用Ml表示临时命名的抗白粉病基因。目前，除3D、4A和4D三条染色体上未发现抗白粉病基因外，小麦其它18条染色体上都有抗白粉病基因的分布，这些基因呈现成簇分布的特点(Gilletal.,1996)。已正式命名了49个位点（Pm1-Pm53，Pm18=Pm1c，Pm22=Pm1e，Pm23=Pm4c，Pm31=Pm21，Pm46=Pm48）的71个小麦抗白粉病主效基因（表1.1），包括复等位基因。正式命名的小麦抗白粉病基因见表1.1，临时命名的抗白粉病基因见表1.2（张俊成等，2011；张明，2014；Gaoetal.,2012；McIntoshetal.,2013；McIntosh,2014）。9 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用表1.1正式命名的小麦抗白粉病基因Table1.1Officallydesignatedgenesforpowderymildewresistanceinwheat基因染色体位点来源供体品系参考文献GenesLocationsSourcesDonnervarietiesReferencesPm1a7AL普通小麦AximinsterHsametal.,1998Pm1b7AL一粒小麦MocZlatkaHsametal.,1998Pm1c(Pm18)7AL普通小麦WeihestephanMINHsametal.,1998Pm1d7AL斯卑尔脱小麦DuhamelianumHsametal.,1998Pm1e(Pm22)7AL普通小麦VirestSingrunetal.,2003Pm25DS粗山羊草Uika/XX194Lutzetal.,1995Pm3a1AS普通小麦AsosanBriggleetal.,1996Pm3b1AS普通小麦ChulSears,1996Pm3c1AS普通小麦SonoraSears,1996Pm3d1AS普通小麦KolibriZelleretal.,1993aPm3e1AS普通小麦W150Zelleretal.,1993aPm3f1AS普通小麦Miehignn,AmberZelleretal.,1993aPm3g1AS普通小麦AristideZelleretal.,1998SSR/Xpsp3000/1.2Pm3h1AS普通小麦AbessiZelleretal.,1998Pm3i1AS普通小麦N324Zelleretal.,1998Pm3j1AS普通小麦Gusl22Zelleretal.,1998Pm4a2AL二粒小麦KhapliTheetal.,1979Pm4b2AL波斯小麦ArmadaTheetal.,1979Pm4c(pm23)2AL普通小麦81-7241Pm4d2AL一粒小麦Tm27d2Schmolkeetal.,2011Pm5a7BL二粒小麦HopeLawetal.,1966Pm5b7BL普通小麦IbisHsametal.,2001Pm5c7BL普通小麦KolandiHsametal.,2001Pm5d7BL普通小麦IGVI-455Hsametal.,2001Pm5e7BL普通小麦Fuzhuang30Huangetal.,2003aMlxbd(Pm5)7BL普通小麦XiaobaidongHuangetal.,2003aPm62BL提莫菲维小麦TP114Jergensen,1973Pm74BS·4BL/2RL黑麦TransecFriebeetal.,1994Pm81RS·1BL黑麦DisponentHsametal.,1997Pm97AL普通小麦N14Hsametal.,1998Pm101D普通小麦Norin26Tosaetal.,1987Pm116BS普通小麦中国春Tosaetal.,1987Pm126BS-6SS·6SL拟斯卑尔脱山羊草Trans.line31Jiaetal.,1996Pm133BL·3SS-3S，高大山羊草Cstrans.lineCeolonietal.,19923DL·3SS-3SPm146BS普通小麦Norin10Tosaetal.,1990Pm157DS普通小麦Norin26Tosaetal.,199010 山东农业大学硕士学位论文Pm165BS野生二粒小麦Normanrec.lineChenetal.,2005Pm171RS·1AL1RS·1BL黑麦Amigo，TAM107Bennettetal.,1984Pm197D粗山羊草XX186Lutzetal.,1995Pm206BS·6RL黑麦KS93WGRC28Friebeetal.,1994Pm216VS·6AL簇毛麦扬麦5易位系Chenetal.,1995Pm241DS普通小麦齿牙糙Huangetal.,2000Pm24b1DS普通小麦baihuluPm251A野生一粒小麦NC96BGTA5Shietal.,1998Pm276B·6G提莫菲维小麦146-155-TJarveetal.,2000Pm281B普通小麦MeriPeushaetal.,2000Pm297DL卵穗山羊草PovaZelleretal.,2002Pm305BS野生二粒小麦C20Liuetal.,2002Pm31(MIG)2BL拟二粒小麦G-305-M/781//JING411*3Xieetal.,2002Pm321BL·1SS拟斯卑尔脱山羊草L501Hsametal.,2003Pm332BL波斯小麦PS5Zhuetal.,2005Pm345DL粗山羊草NC96BGTD7Mirandetal.,2006Pm355DL粗山羊草NC96BGTD3Mirandetal.,2007Pm365BL野生二粒小麦MG29896Blancoetal.,2008Pm377AL提莫菲维小麦PI427315Peruginietal.,2008Pm387DS普通小麦RL6058Spielmeyeretal.,2005Pm391BL普通小麦SarrLillemoetal.,2008Pm407BS中间偃麦草GRY19Luoetal.,2009Pm413BL野生二粒小麦Langdon/IW2SelnLietal.,2009Pm422BS野生二粒小麦G303-1MWeietal.,2009Pm432DL中间偃麦草Z1141Heetal.,2009Pm443AS普通小麦HombarChenetal.,2011Pm456DS普通小麦D57Maetal.,2011Pm46(Pm48）5DS普通小麦TabascoGaoetal.,2012Pm477BS普通小麦HongyanglaziXiaoetal.,2013Pm492BS栽培二粒小麦MG5323Piarullietal.,2012Pm502AL栽培二粒小麦M129Mohleretal.,2012Pm512BL长穗偃麦草CH7086Zhanetal.,2014Pm52(MlLX99)2BL普通小麦Liangxing99Songetal.,2014Pm535BL山羊草TAU829Petersonetal.,2014注：参照张明(2014）。表1.2暂时命名的小麦抗白粉病基因Table1.2Temporarilydesignatedgenesforpowderymildewresistanceinwheat基因位置来源供体品系参考文献GeneLocationsSourcesDonnervarietiesReferencesPm20265AL栽培一粒小麦TA2026Xuetal.,2008PmCn171BS=1BL·1RS普通小麦川农17Renetal.,200911 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用PmG167AL野生二粒小麦G18-16Ben-Davidetal.,2010PmHNK3BL普通小麦周麦22Xuetal.,2010PmHNK542AL普通小麦郑9754Xuetal.,2011PmLK9062AL普通小麦郑9754，兰考90Niuetal.,2008PmPs5A2AL四倍体小麦AM4Zhuetal.,2005PmY392U(2B)伞形山羊草Laizhou953*4/Am9Zhuetal.,2006PmYm662AL普通小麦Yumai66Huetal.,2008Ml3D325BL野生二粒小麦I222Zhangetal.,2010MlAB102BL野生二粒小麦PI471746Maxwelletal.,2010Ml-Ad普通小麦AdlungsAlemannenAmberLutzetal.,1995Ml-Br普通小麦BretonischerBartweizenLutzetal.,1995Mld4B硬质小麦Halle13471Pm2MuthukrishnanS2000PersonalcommunicationMl-Ga普通小麦GarnetLutzetal.,1995MlIw727AL野生二粒小麦IW72Jietal.,2008Mlm30337AL栽培一粒小麦TA2033Yaoetal.,2007Mlm807AL栽培一粒小麦M80Yaoetal.,2007Mljy7B普通小麦Jieyan94-1-1Pm8Huangetal.,2002Mlsy7B普通小麦Siyan94-2-1Huangetal.,2002mlRd307AL普通小麦RD30Singrunetal.,2004Mlre6AL栽培二粒小麦RE714Robeetal.,19952001Mlxbd7B普通小麦Xiaobaidong5Huangetal.,2000MlTd1055野生二粒小麦TA1055，TA1150AhmadiFirouzabadAandMooreK,2003Mlzec12BL野生二粒小麦Zecoi1Mohleretal.,20051.3.3小麦抗白粉病数量性状基因作物的水平抗病性或中等程度抗病性多为数量性状基因控制，属于微效基因遗传。抗病和感病品种杂交，F2世代抗病程度呈正态或偏正态分布，部分植株展现明显的超亲现象，其抗病性程度易受环境条件的影响。已经明确了白粉病QTL位点82个，分布于小麦的21条染色体上（何中虎等，2011；薄存瑶，2014）。许多地方品种的抗病性为多基因控制，主效和微效基因共同作用，因此地方品种的抗病性常表现广谱、持久。在抗病育种中需要加强开发和利用地方品种中的抗病性资源。现已经在多个国家的地方品种中发现抗白粉病数量性状基因，如：‘Forno’（瑞士），‘RE714’和‘RE9001’（法国），‘Massey’和‘USG3209’（北美），‘Saar’（墨西哥），‘Fukuho-Komugi’（日本），‘百农64’和‘鲁麦21’（中国）等（Lillemoetal.,2012）。12 山东农业大学硕士学位论文1.4小麦抗白粉病性状的遗传分析1.4.1遗传分析遗传分析是以孟德尔遗传规律和概率统计方法为基础的分析方法。小麦抗白粉病基因的遗传分析步骤是：首先配制抗病和感病亲本杂交组合，应配制多个杂交组合以提高结果的准确性；观察杂种F1植株的抗病性，如果抗病性是由显性单基因控制的性状，则F1代植株抗病，如果抗病性是由隐性单基因控制的性状，则F1代植株感病；统计F2代分离群体中的抗病、感病植株的分离比例，选择孟德尔遗传理论模型，采用卡方测验（2检验）等方法验证实际分离比与理论分离比之间的吻合程度，估计控制抗病性状的基因数量。如果未知抗病基因坐落在某个携带其它抗白粉病基因的染色体上，则需要通过等位性测验（allelismtest）确定未知基因与其它基因之间的关系。如果为等位基因，F2杂交后代都表现抗病，有时需要加大群体以鉴别位置较近的抗病基因。1.4.2基因的染色体定位基因的染色体定位就是将所研究的抗白粉病基因定位在小麦的某一特定染色体。基因的染色体定位方法多样，比如单体分析、三体分析和缺体分析（牛吉山，2007）。（1）单体分析。二倍体或异源多倍体生物如果缺少一条染色体（2n-1）就称为单体（monosomic）。单体分析中，将待测基因的材料，分别与全套单体材料杂交，观察其后代分离比例。如果待测基因与单体染色体吻合，其杂交后代的分离将偏离孟德尔定律，否则其杂交后代的分离符合孟德尔定律。根据杂交后代的分离比例可以推测待测基因的染色体位置。单体分析中，显性基因与隐性基因的分离情况不同（牛吉山，2007）。单体分析也会出现失误，比如Pm22和Pm24使用中国春单体系所做的染色体定位有误，人们利用分子标记纠正该错误（SingrÜnetal.,2003;Huangetal.,2000）。近年来，单体分析不再用于抗病基因的染色体定位研究，染色体特异的分子标记（SSR等）正在取代单体分析方法（Liuetal.,2002）。（2）三体分析。当生物体多出一条染色体时就称为三体（2n+1;trisomic）。三体分析的原理与单体分析类似，将待测基因材料分别与不同的三体系杂交。位于三体上13 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用的基因在杂交后代中的分离会显著偏离孟德尔定律。通过统计分析不同杂交组合后代的分离比，就可以推断待测基因所在的染色体。（3）缺体分析。二倍体或异源多倍体生物如果缺少一对染色体［2（n-1）］就称为缺体（nullisomic）。Sears于1954年创建了中国春的一套完整缺体系，包括全套缺体。缺体一般高度不育，结实率低，很难保持。目前保留下来的中国春缺体有1A，1B，1D，3A，3B，4D，6A，6D，7A和7D(刘大钧，1999)。缺体分析原理同单体分析。分析时以缺体为母体，将需要进行染色体定位的基因纯合材料分别与一套缺体系杂交，对杂交后代抗病性分离比进行分析即可将抗病基因定位在特定染色体。由于缺体系难以保持，经典的染色体定位主要以单体分析为主。（4）端体分析。目的在于将控制某一性状的基因定位在特定染色体臂。当小麦染色体组中某对染色体不完整，只保留其长臂端着丝粒染色体或短臂端着丝粒染色体时被称为端二体［2（n-1）+t；ditelosomic］。端二体可以像缺体系一样进行基因的染色体定位，而且可以将目标基因精确定位在染色体的长臂或短臂上。另外，由于端体着丝粒相当于一个标记因子，利用端体还可以确定基因与着丝粒之间的遗传距离。（5）缺体-四体分析。在小麦基因染色体定位中常用的一种方法是缺体-四体分析。小麦部分同源群染色体上的基因具补偿效应，当小麦缺少一对染色体时，其缺体的基因作用可以由同源群内其它染色体的四体补偿。小麦中已建立了全套的缺体-四体系可以进行基因、DNA序列的染色体定位和物理作图。（6）缺失系分析。缺失系是染色体组中某一对染色体的臂缺失掉一个片段。由某一染色体臂缺失不同长度片段的系组成一系列的缺失系，这种材料可以将基因定位在染色体的更加精确的区段上。（7）SSR标记定位。随着生物技术的发展，SSR标记在染色体上的密度越来越大，并且其在染色体上的精确位置是已知的。可以通过与目标基因连锁的SSR标记来确定该基因在染色体上的位置。目前，通过分子标记进行基因染色体定位已经成为基因定位的主要途径。与传统染色体定位方法相比，分子标记定位方法更加简单、准确。1.4.3抗病基因推导抗病基因推导是通过抗病谱推导抗病基因是否为新基因的方法。理论基础是Flor提出的基因对基因假说（Flor,1955;Flor,1971）。具体做法是分别使用不同的白粉病14 山东农业大学硕士学位论文生理小种接种携带有不同的抗病基因的品系，包括携带已知抗病基因的品系和携带未知抗病基因的品系。发病后，记录每一个品系对不同白粉菌生理小种的反应特点，形成一个抗病谱。根据抗病谱推导未知基因是否与已知基因相同，或为新基因。这种方法快速简便，是鉴定小麦品种抗病性的重要方法，不需要杂交就可以在较短的时间内了解所需信息，比常规的杂交方法省时省力，但推导法得出的结果不如常规遗传学方法准确（牛吉山，2007）。1.5基因定位的方法1.5.1分子标记遗传标记（geneticmarker）是可遗传的、易于识别的表现性状，可以用来明确反映遗传多态性的生物特征。遗传标记共有4类：形态学标记（morphologicalmarker），细胞学标记（cytologicalmarker），生化标记（biochemicalmarker），分子标记（molecularmarker）。其中形态学标记、细胞学标记和生化标记这3类标记都是基因表达的结果，易受环境条件的影响（黄映萍，2010）。分子标记是20世纪末发展起来的一类新的遗传标记，比其他三种遗传标记更加准确可信并且不受环境条件的影响。目前，分子标记技术已经广泛应用于遗传图谱的构建、基因定位和分子标记辅助育种（Marker-assistedselection,MAS）等领域。长期以来，应用于实验和生产的分子标记技术种类很多。根据分子标记技术的原理，可将分子标记分为三类：（1）基于核酸杂交的分子标记。例如最早期出现的RFLP技术（Grodzicker,1974），由于基因组DNA中存在限制性酶切位点的多样性，在使用限制性酶切处理后会获得长度不同的多态性片段，经琼脂糖电泳后分离不同的DNA分子，再经Southern杂交等技术后利用放射自显影等成像技术即可检测基因组多态性。（2）基于PCR反应的分子标记。PCR反应能够方便、快速、准确地扩增DNA片段，许多种分子标记技术都是利用PCR反应原理而设计的，例如：RAPD、ISSR、AFLP、SSLP、SSR、STS、CAPs、和dCAPs等。其中SSR、STS、CAPs和dCAPs这四种分子标记至今仍然广泛使用。可见，聚合酶链反应对分子标记技术的发展具有十分重要的作用。（3）基于单碱基多态性（SNP）的分子标记，包括：单核苷酸多态性（Single15 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用nucleotidepolymorphism,SNP）标记，多样性阵列技术（Diversityarraystechnology,DarT）和表达序列标签（Expressedsequencetags,EST）标记等，这是一类新型的分子标记技术，可以结合新兴的芯片技术实现高自动化、快速检测和高精度快速而准确性高的高通量分析，开启了分子标记技术的新时代（Lander,1996；刘传光等，2006；唐立群等，2012）。1.5.2比较基因组学比较基因组学就是通过比较不同作物的基因组或遗传图谱来分析不同作物之间的同源性关系，找到相对保守的区域，进而可以研究不同作物间的同源基因的结构和功能的差异。禾本科作物包括小麦、水稻、玉米、大麦等多种重要的粮食作物，虽然在基因组大小、染色体组成和数目方面存在很大差异，但它们的基因组序列间仍然存在许多高度保守的区域，尤其在基因编码区。物种之间的共线性关系为利用已知物种的基因组信息揭示未知物种的同源区段奠定了基础。随着各种作物的基因组测序的完成，如水稻、短柄草等，人们开始利用模式植物的基因组信息和遗传图谱等来定位并克隆其它作物中的功能基因。例如：小麦矮杆基因Rht-1（Pengetal.,1999）、大麦抗秆锈病基因Rpg1（Brueggemanetal.,2002）、小麦高温成株抗条锈病基因Yr36（Fuetal.,2009）等基因的克隆都参考了水稻基因组序列；抗秆锈病基因Sr35的克隆（Saintenacetal.,2013）和抗白粉病基因Pm51的定位（Zhanetal.,2014）等都利用了短柄草基因组信息。1.5.3Goldengate技术由于SNP广泛存在于真核生物基因组中，所以SNP标记被广泛应用于高密度遗传图谱的构建、基因分型、种群进化分析、基因精细定位和全基因组关联分析等。构建高密度的遗传图谱需要获得大量个体和位点的基因型。全基因组关联分析也需要分析大量个体的全部SNP的信息，这就需要一种可以高通量分析大量个体、多个位点的基因分型技术。目前有许多可以满足以上要求的基因型分析仪，例如：结合了GoldenGateAssay的IlluminaBeadArray基因分型技术和分子倒置探针（Molecularinversionprobe，MIP）技术（Oliphantetal.,2002；Hardenboletal.,2005）。16 山东农业大学硕士学位论文1.6小麦抗白粉病基因的紧密连锁标记到目前为止，已经正式命名的71个抗白粉病基因中有47个已被定位，并获得与其紧密连锁的分子标记（表1.3）。其中有些标记已经用于分子标记辅助选择育种和对于种质资源中不同抗病基因的鉴定。表1.3与小麦抗白粉病基因连锁的分子标记Table1.3Linkedmarkersforresistancegenesforwheatpowderymildew基因位置分子标记遗传距离(cM)GeneLocationsMarkersGeneticdistance(cM)Pm1a7ALXcdo347-7ACo-segregationPm1c(Pm18)7ALAFLP/18M2Pm1d7ALAFLP/18M10.9cMPm25DSXcfd81-5D，Xbcd1871-5D2.0cM，3.5cMPm3a1ASXbcd1434-1A1.3cMPm3b1ASXbcd1434-1A1.3cMPm3e1ASXwmc818-1A7.1cMPm3g1ASSSR/Xpsp2999Pm4a2ALXbcd1231-2A.2，Xcdo678-2ACo-segregation，Pm4b2ALXgbx3119b-2A4.8cMPm4d2ALSTS/ResPm4Pm5d7BLXgwm611-7B，Xgwm577-7B2.1cM，2.0cMPm5e7BLXgwm1267-7B，Xubc405628-2B6.6cM，12.6cMPm62BLNAU/STSBCD135-1，NAU/STSBCD135-20.8cM，0.8cMPm126BS-6SS.6SLXwmc105andXcau127Pm133BL.3SS-3SSTS/Xutv133DL.3SS-3SPm165BSXgwm159-5B5.3cMPm171ASXmwg68-1R7.8cMPm216VS.6ALRAPD/OPH171900Pm23(Pm4c)2ALXbarc122-2A，Xgwm356-2A1.4cM，3.5cMPm241DSXgwm789-1D/Xgwm603-1D，Xbarc229-1D2.4cM，3.6cMPm251ARAPD/OPAG0495012.8+/-4.0cMPm262BSXwg516-2BCo-segregationPm276B-6GXpsr3131-6BCo-segregationPm297DLAFLP/S26M26-261andS23M16-2461.1cMPm305BSXgwm159-5B5.6cMPm31(mlG)6ALXpsp3029.1-6A，Xpsp3071-6A0.6cM，2.5cMPm332BLXgwm536-2B，Xwmc317-2B18.1cM，1.1cMPm345DLXbarc177-5D，Xbarc144-5D5.4cM，2.6cM17 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用Pm355DLXcfd26-5D11.9cMPm365BLXcfd7-5B，ESTBJ26163610.7cM，0.8cMPm377ALXgwm332-7A，Xwmc790-7A0.5cM，0.5cMPm387DSXgwm1220-7D0.9cMPm391BLXwmc719-1BL，Xhbe248-1BL4.3cM，2.5cMPm407BSXwmc334-7B，Xgwm297-7B0.2cM，0.7cMPm413BLBE489472，Xwmc687-3B0.8cM，1.9cMPm422BSBF146221，Xgwm148-2B0.9cMPm432DLXwmc41-2D，Xbarc11-2D2.3cM，4.2cMPm456DSXcfd80，Xmag6139co-segregating，0.7cMXmag61402.7cMPm46(Pm48）5DSXgwm165-4D，Xgwm192-4DLPm477BSXgpw2097-7B，Xgwm46-7B0.9cM，3.6cMPm492BSXcau516-2B，XCA6956347.2cM，4.1cMPm502ALXgwm294-2A2.9cMPm512BLXwmc332-2B，BQ2466704.7cM，1.4cMPm52(MlLX99)2BLXBE604758，Xgwm120-2B2.9cMPm535BLXwmc759/Xgwm499-5B/IWA6024，IWA24540.7cM1.7小麦抗白粉病基因的抗病性评价及应用目前已经发现了很多小麦抗白粉病基因，但它们对小麦白粉菌的抗病性各不相同，往往由于以下几种情况而不能有效的用于小麦育种：（1）有些基因对我国的白粉病小种抗病性还有待鉴定。（2）有些抗白粉病基因对我国的白粉菌小种并没有作用或作用很小，如：Pm9没有单独的载体，含Pm1+Pm2+Pm9的‘Normindie’在欧洲地区对白粉菌表现较高的抗病性，但是对我国小麦白粉菌并不具备抗性；Pm17在美国东部麦区有效，但在我国抗谱狭窄；Pm19对我国白粉菌优势生理小种没有抗病性，不能有效地用于小麦的抗病性育种（张海泉等，2008）。（3）有些抗白粉病基因与不良性状连锁，如Pm12、Pm13、Pm16、Pm18、Pm19、Pm20、Pm21、Pm30、Pm31和Pm33，虽然对白粉病表现免疫或高抗，但是携带前6个抗病基因的品种（系）的农艺性状差，不宜直接在育种中作为亲本材料应用（张海泉等，2008；薄存瑶，2014）。（4）Pm10、Pm11、Pm14和Pm15只对冰草属白粉菌有抗病性，不抗小麦白粉菌，在小麦抗病育种和生产中并没有实际的应用价值（张海泉等，2008）。（5）由于携带单一抗病性基因材料的大面积推广，导致相应的病原菌生理小种大量繁殖并上升为优势小种，最终导致该品种在较短的时间内丧失抗病性（Järveetal.,2000），如Pm1、18 山东农业大学硕士学位论文Pm3a、Pm3b、Pm3c、Pm3f、Pm5、Pm7和Pm8等发现比较早的白粉病抗病基因在中国已经丧失抗病性（李隆业等，1991；向齐君等，1996；段霞瑜等，1998，詹海贤等，2010），另外，Pm4a也正在逐渐丧失白粉菌抗病性，所以在生产上应该谨慎使用该基因，可以通过聚合育种的方法将其与其它抗源聚合在同一品系中以提高选育品种的白粉病抗性（段霞瑜等，1998）。（6）源于小麦近缘种属的抗病基因，在转入普通小麦背景后，抗病基因的表达可能会受到一定程度的抑制。这种现象在转移小麦部分叶部病害的相关抗病性基因时有所发现，如Pm8在品种‘Disponent’中的表达受到抑制，Pm17在品种‘Helami-105’中的表达受到抑制。（7）农家品种、近缘种属中的有效抗源没有充分发掘和利用。为了解决以上问题，在实际的育种工作中应注意以下几个方面的研究：（1）转移抗病基因时应考虑选用农艺性状好、配合力高及遗传背景中不含有待转入抗病基因的抑制基因的材料为受体材料，这是抗病育种成功的一个关键条件；（2）积极拓宽小麦遗传基础，不断发掘新的抗源并培育携带新型抗病基因的品种，实现抗源轮换使用；（3）通过聚合育种的方法将不同的抗病基因聚集使用，增加抗病品种的多抗性和持久性；（4）在同一流行区的上游、中游和下游或越夏区、传播桥梁区、越冬区，分别种植不同抗病性的品种，合理分布抗源，从空间上切断病原菌的循环途径（许韬，2012）；（5）应用多系品种或混合品种相结合的策略，同时加强水平抗病性和部分抗病性材料的利用，以提高小麦抗病育种的效率和使用年限；（6）利用现代生物技术如基因工程、细胞工程、染色体工程、基因编辑等来打破远缘杂交的局限性，为抗病育种开辟新途径。1.8野生二粒小麦中的抗白粉病基因资源及应用在小麦抗白粉病基因的应用过程中，人工选择会导致小麦品种遗传多样性低，抗病基因同质化普遍。小麦近缘种属是拓宽栽培品种遗传多样性的天然基因库，目前，已从一粒小麦、野生二粒小麦、提莫菲维小麦、山羊草、黑麦、簇毛麦和中间偃麦草等小麦近缘种属材料中，发现了30多个抗白粉病基因（McIntoshetal.,2013），如：Pm25(T.boeoticum)；Pm16、Pm26、Pm30、Pm31、Pm36、Pm41和Pm42(T.dicoccoides)；Pm4b和Pm33(T.carthlicum)；Pm6、Pm27和Pm37(T.timopheevi)；Pm1b和Pm1d(T.spelta)；19 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用Pm12和pm32(Ae.speltoides)；Pm13(Ae.longissina)，Pm2、Pm19、Pm34、Pm35和Pm53(Ae.boeoticum)，pm29(Ae.ovataLinn.)，Pm7、Pm8、Pm17和Pm20(Secale)，Pm21(Haynaldia)，Pm40、Pm43和Pm51(Thinopyrumponticum)。在小麦抗病育种工作中应重视野生资源中抗白粉病基因的发掘和应用。野生二粒小麦是普通小麦的原始祖先之一，拥有丰富的遗传资源，包括广泛的抗病性、抗虫性和耐非生物胁迫（盐、干旱和高温）等。因其是普通小麦A和B基因组的直接供体，可以通过传统的杂交程序与小麦染色体发生同源重组实现抗病基因的转移，同时可减少由于染色体不平衡带来的干扰，是选育四倍体和六倍体小麦栽培品种的优良种质资源（Nevo,1995；Mujeebetal.,2002；Lietal.,2014）。20年来，已有10余个来自野生二粒小麦的抗白粉病基因被成功转移到普通小麦中（Alametal.,2013），如：Pm16(Readeretal.,1991)，Pm26(Rongetal.,2000)，Pm30(Liuetal.,2002)，Pm36(Blancoetal.,2008)，Pm41(Lietal.,2009)，Pm42(Huaetal.,2009)，MlZec1(Mohleretal.,2005)，MlIW72(Jietal.,2008)，MlAB10(Maxwelletal.,2010)和Ml3D232(Zhangetal.,2010)等。可见不断发掘野生二粒小麦中的抗白粉病基因，并将其应用于小麦抗病育种是可行且有效的。1.9目的及意义本研究旨在研究野生二粒小麦DIC479中抗白粉病基因的遗传规律，对该抗白粉病基因进行初定位，为以后该基因的精细定位及图位克隆奠定基础。通过挖掘新型抗病基因，扩充抗病种质资源库，将野生二粒小麦DIC479中的抗白粉病基因通过回交转育的方法转移到普通小麦中，实现抗病基因从四倍体小麦向六倍体小麦的转移，为以后该基因在小麦育种中的应用奠定基础。普通小麦中的抗病基因数目有限，野生资源是扩充抗病种质的一个重要源泉，发掘野生二粒小麦中的抗白粉病基因，明确抗病基因的遗传规律，定位、克隆并合理利用这些抗病基因，将有利于拓宽小麦的遗传基础，增加小麦品种的遗传多样性，对增加小麦产量和提高小麦品质都具有重要的意义，有利于促进我国粮食安全。20 山东农业大学硕士学位论文2材料与方法2.1试验材料2.1.1植物材料2.1.1.1亲本材料本研究中，亲本材料为野生二粒小麦DIC479（Triticumdicoccoides,2n=4x=28,AABB）和栽培二粒小麦Langdon（TriticumdicoccumSchrank,2n=4x=28,AABB），两者染色体组成相同，为本实验室保存。2.1.1.2群体材料（1）DIC479与Langdon杂交配制的F2群体pop2及其部分F3家系。群体pop2含有204株植株，从中随机挑选90株作为基本作图群体，为本实验室已有材料；（2）DIC479与Langdon杂交配制的F2群体pop3000及其部分F3家系。群体pop3000由8个F1植株的种子繁殖而成、含有3045株单株，为本实验室已有材料（苑翠玲，2013）；（3）从pop3000中挑选出的两个F2:3亚群体pop731和pop2512及其F2:4家系。亚群体pop731和pop2512分别含有160和136棵单株；（4）从pop3000群体中筛选到的91棵重组体。2.1.1.3其它植物材料（1）为了将DIC479中的抗白粉病基因应用于小麦育种，选取了18个普通小麦品种：‘济南17’，‘济麦19’，‘济麦20’，‘济麦21’，‘济麦22’，‘烟农19’，‘周麦16’，‘临麦2号’，‘潍麦8号’，‘泰山23’，‘泰农18’，‘泰山223’，‘泰山24’，‘周麦22’，‘矮抗58’，‘豫麦49-198’，‘郑麦9023’和‘Bobwhite’作为转移抗病基因PmD479的受体亲本；（2）‘辉县红’作为保存和繁殖白粉菌孢子的寄主材料及发病对照植株；（3）中国春缺体-四体材料：N2A-T2D，N2B-T2D和N2D-T2B。2.1.2小麦白粉菌小麦白粉菌单一菌种46-30-S2-3，E21-S2-2，52-27-S2-17，2-39-S2-1和35-27-S2-521 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用由湖北省农业科学院植保土肥所喻大昭研究员提供；混合菌种为山东省泰安市山东农业大学农学试验站田间及树木园温室自然发病条件下的孢子。2.1.3生化试剂及引物本研究中使用的2×EsTaqMasterMix（EsTaqDNAPolymerase、PCRBuffer、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂）和pUC-T载体（目录号CW0802）购于北京康为世纪生物科技有限公司；限制性内切酶购于NewEnglandBiolabs，中国北京分公司；DNA琼脂糖胶回收试剂盒（离心柱型，目录号DP209）和超薄DNA产物纯化试剂盒（离心柱型，目录号DP203）购于天根生化科技(北京)有限公司；Trans5α大肠杆菌感受态细胞（目录号CD201）购于北京全式金生物技术（TransGenBiotech）有限公司。PCR扩增引物由上海生物工程股份有限公司合成。DNA产物测序由北京华大基因完成。2.1.4试验地点室内试验在山东农业大学作物生物学国家重点实验室完成；室外试验在山东农业大学树木园温室、山东农业大学南校区试验田和山东农业大学南校温室进行。2.2试验方法2.2.1春化处理为了确保植株开花结实，在山东农业大学树木园温室种植的材料需要春化处理。具体做法为：将种子摆放在垫有滤纸的培养皿中，添加适量去离子水湿润滤纸，使用封口膜（Parafilm，USA)密封并用铝箔纸包裹后放置于4˚C冰箱中处理30-45天。2.2.2小麦白粉菌接种小麦白粉菌是活体寄生菌，应采用活体寄生的方法保存和繁殖该菌系。根据白粉病的发生规律，10月初在田间种植感病材料辉县红，翌年4月中旬当病害流行时，在花盆（直径20厘米、高18.5厘米）中种植辉县红，一叶一心期时将其放于田间白粉病发生较重的辉县红行间，待盆中幼苗发病后，将其转移至人工气候培养箱内培养（16小时光照、20℃；8小时黑暗、19℃）。同年10月初在山东农业大学树木园温室大量22 山东农业大学硕士学位论文种植辉县红，扩繁白粉菌。研究中，采用自然传播和扫拂法接种小麦白粉菌。10月中下旬将春化好的小麦幼苗种植于温室，包括辉县红，约两周后，待材料长至一叶一心期时接种白粉菌。扫拂法的具体步骤为：每天傍晚使用喷雾器喷水加湿，使小麦叶片表面形成一层水雾，有利于白粉菌孢子的粘附。然后将白粉菌孢子抖撒在待接菌的小麦叶片上。在小麦周围用竹竿搭成支架，支架上方盖上塑料薄膜并将麦苗罩在塑料棚内，以保持适合白粉菌萌发的相对湿度，第二天早上揭开塑料薄膜；重复以上步骤，待对照材料辉县红及感病亲本Langdon充分发病后（大约15天），调查性状，一周后重复调查一次。2.2.3小麦白粉病表型鉴定小麦一叶一心期时开始接菌，待对照材料辉县红和感病亲本Langdon第一叶充分发病后，依据盛宝钦建议的6级标准鉴定苗期植株反应型(Infectiontypes,ITs)（表2.1；盛宝钦，1988）。本实验中，我们依据植株第一叶的反应型将它们区分为抗病（R，ITs=0-2）和感病（S，ITs=3-4）两种类型（Chenetal.,2005)，一周后再次鉴定各个植株的反应型。表2.1.小麦白粉病苗期反应型Table2.1Infectiontypesofwheatpowderymildew级别抗性发病特征ScalesReactionInfectionphenotypes0免疫(M)植株无病斑；0’近免疫(IM)过敏性坏死，叶片有枯死斑；高抗(HR)病斑直径小于1毫米，病斑少，菌丝稀薄透绿，1偶有比较大的病斑，产孢量极少；中抗(MR)病斑直径小于1毫米，菌丝层较厚，不透绿，2能产生一定量的病菌孢子；中感(MS)病斑直径大于1毫米，菌丝层较厚，病斑较多，不连片，3产生的孢子量大；4高感(HS)病斑直径大于1毫米，病斑多，菌丝层厚而连片。23 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用2.2.4群体构建2.2.4.1亲本表型鉴定使用不同白粉菌小种接种亲本材料DIC479和Langdong。明确两亲本对不同白粉菌生理小种的抗病表型，以确定适用于本研究的白粉菌生理小种。2.2.4.2F2群体的构建使用抗病亲本DIC479与感病亲本Langdon杂交获得F1，鉴定各F1植株的抗病性后收获抗病植株种子，翌年分别种成F2群体。群体pop3000为实验室原有群体，共3045棵植株，由8棵F1植株衍生而来。编号1-831来自F1单株cross09-382-1，编号832-1019来自F1单株cross09-382-2，编号1020-1513来自F1单株cross09-382-3，编号1514-1908来自F1单株cross09-382-4，编号1909-2580来自F1单株cross09-382-5，编号2581-2793来自F1单株cross09-382-6，编号2794-2989来自F1单株cross09-382-7，编号2990-3045来自F1单株cross09-382-8（苑翠玲，2014）。该群体在种植过程中发现DIC479具有白粉病抗性。后期可使用与PmD479连锁的分子标记从中筛选重组体。2011年夏，重新使用DIC479与Langdon杂交获得杂交种；2011年10月中旬将F1种植于田间，翌年鉴定抗病表型后收获其中一株抗病植株的自交种；2012年10月在树木园温室种植F2群体，命名为pop2。群体内分别接种白粉菌、调查并记录各植株抗病表型，收获各植株自交种，并从中随机挑选90棵植株用作基本作图群体。2013年10月，分别种植以上随机挑选的90棵植株后代，即F3家系。为确保孟德尔单基因遗传分析的可靠性（Hanson,1959），我们针对每个F3家系在穴盘（5×10穴；每穴5×5厘米）中种植25棵植株，每穴约5棵单株，以确保获得17棵单株开展遗传分析。在一叶一心期时对这些植株接菌，调查各株系抗病和感病的分离情况(重复调查3次)，根据各株系的分离情况推断F2世代抗病位点纯合和杂合基因型，方便抗病基因的定位。2.2.4.3F2：3亚群体的构建F2:3亚群体从pop3000群体中衍生获得。2014年10月中旬，从3045份pop3000F3家系中选择了23份种子多于150粒的家系作为备选材料。首先，按株系将23份材料24 山东农业大学硕士学位论文种植于树木园温室穴盘，各家系种植30粒种子；苗期进行人工接菌，待对照充分发病后调查并记录性状，从中选出5个符合孟德尔单基因分离规律的株系；12月下旬，将选出的5个株系各自的植株移栽到南校温室内（可自然春化），同时将这5份材料剩余的F2:3种子春化30天后分别种植于穴盘中，于一叶一心期人工接菌，鉴定并记录各单株的抗病表型（一周后重复调查1次）；根据鉴定结果再从中选取两个抗病和感病分离比符合孟德尔单基因遗传规律的群体，即为F2:3亚群体。将亚群体移栽到花盆中（直径20厘米、高18.5厘米），每盆种植2棵单株，重复调查抗病表型，采集各单株叶片DNA用于基因型分析。开花期用网袋（50×30厘米）将各单株罩住，以应对部分单株的落穗现象，减少种子损失。2015年10月种植选定的两个F2:3亚群体的F2:4家系，调查各家系分离情况（重复调查3次），确定F2:3亚群体中各单株的表型和抗病位点的基因型。2.2.4.4F2世代重组体基于3045份pop3000F2群体，我们筛选了PmD479基因的重组体。2015年，用本研究中开发的与PmD479连锁的分子标记筛选pop3000群体，获得了F2重组体群体；同年10月在树木园温室穴盘中种植各重组体的F3家系，每穴5棵，各25棵；待植株长到一叶一心时，进行人工接菌并调查性状，确定各重组体抗病位点的基因型。为了精细定位和克隆PmD479抗病基因，从各重组体株系中随机选择6棵植株，分单株调查性状并确定PmD479侧翼标记基因型，从中鉴定纯合重组体、转移到花盆种植，提取DNA并收获种子备用。2.2.5PmD479基因的分子标记辅助选择以携带PmD479基因的抗病材料为父本，包括DIC479和在sdau135，sdau141及sdau149位点纯合抗病的F3家系。另外选取18个农艺性状较好的普通小麦品种作为PmD479抗病基因的受体材料。然后使用普通小麦回交携带PmD479基因的杂种植株4-5次。具体步骤如下：亲本选择：2014年9月，选择pop2和pop3000中高抗白粉病且在sdau135和sdau141位点纯合的单株，用作花粉供体。2014年10月按株行将候选父本和母本材料种于田间；2015年5月，各父本株行中单株分别编号，确定sdau149标记纯合的抗病单株用25 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用作父本。2014年11月在树木园温室也种植了上述18个普通小麦品种，根据苗期人工接种鉴定它们的抗病表型，据此确定2015年田间的杂交母本。杂交及抗病后代的筛选：2015年5月在田间使用选定的父、母本材料配制杂交组合；同年9月中旬，将收获的杂交种春化30天后种植于温室穴盘中，每穴4棵，苗期接菌，剔除感病植株，并将抗病植株移栽到盆中。回交：2015年9月初选取济麦20，济麦21，济麦22，泰农18，烟农19，周麦22，矮抗58，豫麦49-198和Bobwhite作为轮回父本，分批春化45天后种植于树木园温室中，间隔7天，共3批。2016年1月使用选定抗病杂种植株为母本与轮回亲本配制杂交组合。以后按上述方法选择抗病杂种植株后以普通小麦为轮回亲本逐代回交。2.2.6常规试验方法2.2.6.1DNA提取所有材料均在温室种植，分蘖较少，不宜大量取样。为保证小麦正常生长结实，苗期性状调查完毕后喷施三唑酮灭菌，待植株健康叶片较多时尽早取样，一般在起身-拔节期进行，各植株采取两份小量提取DNA所需样品。使用SDS法提取DNA，具体方法如下：（1）取新鲜叶片10cm左右，折叠后放入装有两粒钢珠（直径4mm）的2ml离心管中，立即放入冰中或超低温冰箱-80℃保存备用；（2）提取时使用液氮预冷叶片，然后使用组织研磨器（23次/秒，震荡1-2min）碾磨成粉末；（3）加入800μlDNA提取液和5μlRNaseA（10mg/ml），震荡混匀后37˚C水浴30min，期间每隔10min轻晃一次，保证提取液和研磨叶片充分反应；（4）水浴后，加入800μl三混溶液（按苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1的比例配制，混匀、静置过夜后使用），震荡混匀，12,000rpm离心10min；（5）离心完毕后，取650μl上清液转移至新的2ml离心管中，加入等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12,000rpm离心10min；（6）取上清液450μl转移至另一新的2ml离心管中，加入45μl，3M醋酸钠溶液（pH=5.2）和450μl异丙醇，轻轻颠倒混匀，出现白色絮沉淀即DNA，将离心管置于-20˚C冰箱中30min，待DNA沉淀完全；26 山东农业大学硕士学位论文（7）12,000rpm离心10min后，倒掉上清液，加入75%的乙醇溶液，洗去DNA中的杂质；（8）12,000rpm离心10min后，倒掉上清液；（9）将盛有DNA的2ml离心管，置于超净台使乙醇挥发干净；（10）各加入100μl抽滤灭菌的1×TE溶液，轻微震荡，使DNA充分溶解；（11）用分光光度计（ThermoNanoDrop2000，Thermo，USA）测定每一个样品的DNA浓度，标注之后将样品放在-20˚C冰箱保存备用。相关溶液配制方法见附录1。2.2.6.2分子标记的开发为了确定抗病基因在染色体上的位置，从群体pop2中选择10棵感病植株与亲本DIC479和Langdon一起开展90KSNP芯片分析（Wangetal.,2014）。根据SNP芯片分析结果，筛选在双亲间表现多态性的SNP探针，可以初步确定抗病基因在染色体上的位置。进一步使用多态性SNP探针比对小麦基因组序列数据库https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php中对应的基因组DNA，将SNP标记转化为PCR标记。利用中国春缺体-四体材料(N2A-T2D，N2B-T2D和N2D-T2B)确定2B染色体特异的分子标记并用于PmD479抗病基因的定位。还根据小麦与水稻、大麦、山羊草的同源性关系获得一些较保守的序列作为参考序列开发分子标记。小麦染色体2B与水稻4号染色体有很好的共线性关系（Taoetal.,2000；Sorrellsetal.,2003；Conleyetal.,2004；Jietal.,2008；Leeetal.，2010）。小麦染色体2B与大麦染色体2H和山羊草染色体2D同样共线性显著。根据抗病基因PmD479在小麦染色体上初步定位的结果，可以利用水稻基因组数据库http://gy.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/#search，大麦基因组数据库IPK或EnsemblPlantshttp://plants.ensembl.org/index.html和粗山羊草（Aegilopstauschii）数据库http://aegilops.wheat.ucdavis.edu/ATGSP/及遗传图谱（Luoetal.,2013），搜索小麦PmD479所在区段保守性较好的序列作为参考序列开发分子标记。开发分子标记时一般利用基因的内含子序列，或者基因间的非重复序列。因为基因中的外显子和重复序列比较保守，不易找到SNP(Feuilletetal.,2009)。27 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用2.2.6.3聚合酶链式反应（PCR）（1）PCR体系为20μl的混合溶液，在反应管中依次加入2×EsTaqMasterMix（EsTaqDNAPolymerase、PCRBuffer、Mg2+、dNTPs以及PCR稳定剂和增强剂），正向引物，反向引物和ddH2O。单个PCR体系中各试剂的体积如下：2×EsTaqMasterMix10μl正向引物（10μM）0.8μl反向引物（10μM）0.8μlDNA模板（100ng/μl）1.0μl加ddH2O至体积20μl（2）将PCR体系分装到PCR96孔板中；（3）将DNA模板（100ng/μl）加入各PCR体系，用硅胶盖封闭96孔板后1,000rpm离心30s；（4）使用ABI9700ThermalCycler（LifeTechnologies,GrandIsland,NY,USA）开展PCR扩增，反应条件为：预变性94˚C、5min，变性94˚C、30s，复性50˚C-65˚C、30s（具体退火温度根据所用引物确定），延伸72˚C、30s（一般按每30s延伸500bp计算延伸时间），终延伸72˚C、10min，15˚C保存，反应进行35-40个循环。2.2.6.4PCR产物的检测根据实验目的，PCR产物可以通过1%-3%琼脂糖凝胶电泳或6%聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离检测。（1）1%琼脂糖凝胶电泳：①称取2g琼脂糖凝胶粉加入250ml锥形瓶中；②在锥形瓶中加入200ml1×TAE；③放入微波炉中加热融化，中间摇晃2-3次；④充分融化后，用自来水冲洗锥形瓶加速溶胶冷却，冲洗过程中应不断摇晃锥形瓶以防止溶胶局部凝固，待温度冷却至60℃左右时加入3mlEB溶液（10mg/ml），倒入制胶模具中，插上梳子，室温静置30min；⑤拔出梳子并将琼脂糖凝胶放入电泳槽中，在电泳槽中加入适量1×TAE电泳缓冲液，点样后开始电泳（恒压160V、30-35min）；28 山东农业大学硕士学位论文⑥在紫外凝胶成像仪中观察目的条带并拍照保存。（2）6%聚丙烯酰氨凝胶电泳：①清洗玻璃板，擦干后使用橡胶条将玻璃板两边和下部的缝隙密封好；②在玻璃板两边放置垫片，紧靠橡胶条，盖好带凹槽的玻璃板，用夹子固定好玻璃板，垂直立于实验台上；③在150ml锥形瓶中依次加入：75ml5×TBE，22ml40%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（19:1），50ml去离子水，1ml10%（w/v）过硫酸铵（APS）和100μl四甲基乙二胺（TEMED），混合均匀；⑤迅速倒入固定好的玻璃板缝隙中，并将梳子插入玻璃板中间，该过程中应防止气泡的产生，静置1h，凝固后使用；⑥去除固定夹和橡胶条，将胶板放入电泳槽中，在上下两个电泳槽中分别加入适量缓冲液（0.5×TBE），在下槽缓冲液中加入20μlEB（10mg/ml），混匀后进行预电泳（恒压350V、1h）；⑦拔出梳子，点样，开始电泳（恒压350V、1.5-2h）；⑧电泳后，使用紫外凝胶成像仪观察目的条带并拍照。2.2.6.5PCR产物的回收（1）琼脂糖凝胶中的DNA片段回收（试剂盒法）电泳后，使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收琼脂糖凝胶中的DNA目的片段。①从琼脂糖凝胶中切下单一的DNA目的条带，放入干净的离心管中，称重；②向离心管中加入等体积溶液PN（将0.1g凝胶的体积视为100µl），50℃水浴融化琼脂糖凝胶，其间柔和地翻转离心管数次，至胶块充分溶解后冷却至室温；③柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500μl平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱重新放回收集管中；④将获得的琼脂糖溶液加入吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；⑤向吸附柱CA2中加入600μl漂洗液PW（使用前先加入适量无水乙醇），静置5min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中；⑥重复操作步骤⑤；29 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用⑦将吸附柱CA2放回收集管中，12,000rpm离心2min，去除漂洗液。将吸附柱CA2置于超净工作台中，室温放置至彻底晾干，约10分钟；⑧将吸附柱CA2放到一个新的离心管中，向吸附膜中间位置悬空加入30μl50℃预热过的ddH2O，室温放置2min，12,000rpm离心2min，收集DNA溶液；⑨重复步骤⑧，将收集到的DNA产物经分光光度计测定浓度后，直接用于下步实验或保存在-20℃冰箱中备用。（2）PCR产物纯化回收（试剂盒法）已知PCR产物中仅含有所需DNA目的片段时，可通过DNA产物纯化试剂盒回收。①将PCR反应产物转移到干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的结合液PB，充分混匀；②柱平衡步骤：向吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中）加入500μl的平衡液BL，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；③将第一步所得溶液加入一个吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室温放置2min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管中；④向吸附柱CB1中加入600μl漂洗液PW（使用前先加入适量无水乙醇），室温静置5min，12,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB1放入收集管；⑤重复操作步骤④；⑥12,000rpm离心2min，尽量使漂洗液去除干净。将吸附柱置于超净工作台中室温放置至彻底晾干，大约10分钟，以免残留的漂洗液影响后续实验；⑦取出吸附柱CB1，放入一个新的干净的离心管中，向吸附膜中间悬空加入30μl50℃预热过的ddH2O，室温放置2min。12,000rpm离心2min，收集DNA溶液；⑧重复步骤⑦，并将收集到的DNA溶液经分光光度计测定浓度后，直接用于下步实验或保存在-20℃冰箱中备用。2.2.6.6DNA片段的克隆及转化为了获得DNA产物的单一目的条带，将回收或纯化收集到的DNA产物连接到TA载体pUC-T中，然后转化进Trans5α大肠杆菌感受态细胞中，经菌落PCR及限制性内切酶消化指纹图谱鉴定获得含有单一DNA目的片段的阳性克隆。（1）TA载体连接反应：30 山东农业大学硕士学位论文①根据DNA产物的浓度（以10μL体系加入40ngDNA计算，DNA片段应具有A尾巴），在灭菌干净200μl离心管中依次加入以下各成分：2×Solution5μlpUC-TVector1μlDNA产物0.5-4μl加ddH2O至体积10μl②放置于金属浴温育22˚C、2h。（2）转化步骤：①将Trans5α大肠杆菌感受态细胞在冰上融化后，取50μl于灭菌的1.5ml离心管中，加入连接产物10μl，冰浴30min；②置于浮子上，水浴锅中42˚C热击45s，立即将离心管转移到冰上，静置2min；③在每个离心管中加入500μl无菌液体LB培养基（不含抗生素），混匀后置于摇床37˚C、200rpm/min培养1h，使菌体复苏；④在含有氨苄抗性的LB固体培养基上加入3-4颗玻璃珠，加入260μl菌液，盖上培养皿盖，轻轻晃动培养皿，使菌液均匀涂开，在超净工作台中晾干后，放入37˚C培养箱中倒置过夜培养；⑤使用TA载体通用引物M13(-47)、M13(-48)或克隆目的片段所用引物配制PCR反应体系，进行菌落PCR，检测阳性克隆；⑥在灭菌的2ml离心管中加入1.8ml氨苄抗性的LB液体培养基，用200μl灭菌枪头挑选待测序阳性克隆，放入离心管中，用封口膜密封后放入摇床，37˚C过夜培养，第二天送样测序。实验中用到的各种试剂以及配制方法见附录22.2.7遗传连锁图遗传连锁图使用软件JoinMap4.0（KyazmaB.V.,Wageningen,Netherlands）绘制而成。软件设置采用最大相似度计算方法（MaximumLikelihoodmappingalgorithm）和Kosambi功能。共线性关系图使用Mapchart和Fireworks绘制而成。31 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用3结果与分析3.1抗病性鉴定3.1.1小种特异抗病性鉴定为研究DIC479对白粉菌的抗病性，使用了湖北省农业科学院植保土肥研究所保存的单一孢子46-30-S2-3，E21-S2-2，52-27-S2-17，2-39-S2-1和35-27-S2-5鉴定两亲本的抗病性表现（图3.1）。LDLDLDLDLD图3.1DIC479(D)和Langdon(L)的抗白粉病测试Figure3.1PowderymildewresistanceinDIC479(D)andLangdon(L)DIC479和Langdon对小麦白粉菌不同生理小种的抗病性表现存在很大差别。DIC479对单一小种46-30-S2-3表现为免疫（ITs=0），Langdon则表现感病（ITs=4），该小种可用于本研究植物材料的接菌及各单株的抗病性鉴定。3.1.2混合小种抗病性鉴定在山东农业大学树木园温室对亲本DIC479，Langdon及感病对照辉县红接种小麦白粉菌混合孢子（田间收集），分别调查苗期和成株期的抗病表型（图3.2）。苗期接菌15天左右，待对照辉县红的第一叶充分发病时，DIC479表现免疫（ITs=0），Langdon表现感病（ITs=4）。成株期表型在植株挑旗后鉴定，DIC479表现近免疫，Langdon各叶段均严重感病，且穗部和芒上也有大量孢子堆。可见，DIC479对所试小麦白粉菌具有全生育期抗病性，而Langdon在各时期均无抗性。故本研究采用本地区收集的混合孢子开展DIC479抗白粉病遗传分析。32 山东农业大学硕士学位论文123456图3.2DIC479和Langdon苗期及成株期的白粉菌抗病性1-2为苗期表型，3-6为成株期表型；1，3，5为DIC479，2，4，6为Langdon。Figure3.2PowderymildewresistanceinseedingandadultplantsofDIC479andLangdon1-2Seedings;3-6Adultplants.1,3,5forDIC479;2,4,6forLangdon.3.2抗病性状的遗传分析3.2.1遗传分析群体遗传分析所用材料包括亲本DIC479和Langdon，以及两亲本衍生的后代，包括F1植株、F2群体和F2:3亚群体等。通过人工接菌、性状调查及群体内抗病和感病分离情况分析完成。F2群体包括pop2和pop3000，由实验室创制并保存。pop2共有204棵植株，群体pop3000包含3045棵植株。在此基础上，我们从pop3000中创制两个F2:3亚群体，并命名为pop731和pop2512，各含有160和136棵单株。3.2.2DIC479抗白粉病的遗传分析通过对F1植株、F2群体及其部分F3家系和F2：3亚群体及其F2：4家系进行人工接菌测试，完成对DIC479白粉病抗性的遗传分析。苗期接种F1植株时，发现其对小麦白粉菌表现近免疫（Its=0’），表现与DIC479一致，说明DIC479的抗病性为显性基因控制。进而对pop2、pop731和pop2512的抗病性进行了测试，发现3个群体中单株的抗病和感病分离明显（图3.3），并且抗病和感病单株的比例接近3:1（表3.1）。说明DIC479中的抗病基因符合显性单基因的遗传规律，将其暂命名为PmD479。对群体pop2中随机挑选的90株作图群体的F3家系，作图群体pop731和pop2512的F2:433 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用家系进行人工接菌并调查性状，其中pop2群体90个单株中有效株系为83个。发现3个群体中抗病株系、分离株系和感病株系的分离比都符合1:2:1（表3.2），进一步明确了DIC479中的白粉菌抗病性为显性单基因PmD479所控制。123456789图3.3群体抗白粉病的分离表现1-3来自群体pop2；4-6来自群体pop2512；7-9来自群体pop731。Figure3.3Segregationofpowderymildewresistanceinpopulations1-3frompop2;4-6frompop2512;7-9frompop731.表3.1所测试群体抗白粉病的分离表现Table3.1Segregationofpowderymildewresistanceonpopulationstested群体世代植株总数实际比值理论比值2值P值PopulationGenerationNumberObservedratioofR:SExpectedratioofR:SPvaluepop2F2204157:473:10.41820.5178Pop731F2:3160124:363:10.53330.4652Pop2512F2:3139102:343:101注：R代表Resistant，S代表Susceptible。表3.2所测试群体抗白粉病的分离表现Table3.2Segregationofpowderymildewresistanceonpopulationstested群体世代植株总数实际比值理论比值2值P值PopulationGenerationNumberObservedratioofExpectedratioofPvalueR:Seg:SR:Seg:Spop2F38323:39:211:2:10.39760.8197Pop731F2:416043:82:351:2:10.90.6376Pop2512F2:413939:63:341:2:11.10290.5761注：R代表Resistant，Seg代表Segregating，S代表Susceptible。34 山东农业大学硕士学位论文3.3PmD479抗病基因的定位3.3.1基因定位群体群体pop2共含有204棵植株，随机挑选90棵作为基本作图群体。来源于pop3000的pop731和pop2512也被用于基因定位。对于群体pop3000，利用PmD479的连锁标记sdau135和sdau162筛选得到143棵F2重组体，其中100份重组体的种子储备完善，并获得了84份F3重组体株系中的纯合重组体，为该抗病基因的精细定位和图位克隆奠定了基础。3.3.2基于SNP芯片的BSA分析我们首先从pop2的F2单株中随机挑选了10棵感病植株，分别提取它们的DNA样品，附加两个亲本DNA样品一同寄送到美国加州大学开展小麦90KSNP芯片分析（90KiSelectSNPAnalysis）。结合群体分离分析法（Bulkedsegregationanalysis,BSA），获得了12个可能与PmD479基因连锁的SNP标记，其中9个SNP标记位于小麦第二同源群长臂，包括BobWhite_c7274_333、Excalibur_c56550_71、Excalibur_c7971_1573、CAP7_c16_300、RAC875_c27102_377和RAC875_c37540_583（2L），IACX11305和BobWhite_c21827_104(2BL)，Ra_c35731_1269(2AL)。另外3个SNP标记IAV1535、Tdurum_contig9071_215和Kukri_c96357_134在染色体上的位置不清楚。DIC479为野生二粒小麦，只含有A和B基因组，因此PmD479基因可能位于小麦染色体2AL或2BL。为确定PmD479的染色体位置，根据以上结果，我们将可能与PmD479基因连锁的6个SNP标记BobWhite_c7274_333、RAC875_c37540_583、Excalibur_c56550_71、BobWhite_c21827_104、IACX11305和Kukri_c96357_134分别转化为PCR标记sdau107，sdau112，sdau121，sdau111，sdau106和sdau113(表3.4)。将以上6个分子标记在作图群体pop2中定位，遗传分析表明它们均与PmD479连锁（图3.4）。利用中国春缺体-四体材料验证其基因组特异性，发现以上6个分子标记在含有小麦2B染色体的材料N2A-T2D和N2D-T2B上能够扩增目的条带，但在缺失小麦2B染色体的材料N2B-T2D上不工作，初步说明这些标记位于小麦染色体2B（图3.5）。综上所述，可以确定PmD479抗白粉病基因位于小麦染色体2BL。35 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用在确定了PmD479基因的2BL位置后，我们利用90KSNP芯片位于小麦染色体2BL上的其它SNP开发了6个PCR标记sdau129、sdau131、sdau132、sdau134、sdau135和sdau141。在F2群体pop2中，以上6个PCR标记均与PmD479连锁并位于PmD479近着丝粒端。其中sdau141是基于SNPtplb0035c15_1515开发而来的，在遗传图谱中该标记位于2BL末端。因此，PmD479基因也应位于小麦染色体2BL末端。各标记的具体信息见表3.4。sdau112sdau121sdau132RSRSSRSegSSSSSRSRSSegDRLSegD+LSeg图3.4PCR标记在pop2群体上的表现R代表纯合抗病植株，Seg代表杂合抗病植株，S代表纯合感病植株，D代表DIC479，L代表Landong，D+L代表DIC479与Langdon混合。Figure3.4PerformanceofPCRmarkersonthepop2populationResistant(R),segregating(Seg),susceptible(S);DIC479(D),Landong(L),DIC479andLangdon(D+L).123456789sdau106sdau111sdau121sdau112图3.5PCR标记的中国春缺体-四体分析1.N2A-T2D；2.N2B-T2D；3.N2D-T2B；4.一粒小麦‘DV92’（Triticummonococcum,AA）；5.粗山羊草‘AL8/78’(Aegilopstauschii,DD)；6-7.DIC479；8-9.Langdon。Figure3.5Nulli-tetrasomicanalysisforseletedPCRmarkers1.N2A-T2D;2.N2B-T2D;3.N2D-T2B;4‘.DV92’（Triticummonococcum，AA）;5.‘AL8/78’（Aegilopstauschii,DD）;6-7.DIC479;8-9.Langdon.36 山东农业大学硕士学位论文3.3.3利用共线性定位基因为了获得PmD479基因的远着丝粒端标记，我们对比了小麦与水稻、大麦和山羊草的共线性，从中寻找较为保守的基因组片段并开发分子标记。因大麦和山羊草与小麦的亲缘关系比水稻更近，我们主要利用大麦和山羊草的已知序列作参考，共开发了7个PCR标记（表3.4）。利用sdau129、sdau131、sdau132、sdau134、sdau135和sdau141搜索水稻序列（http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml），其中sdau129与sdau141在水稻中未找到相应的同源序列，其它标记与水稻4号染色体末端序列间具有较好的共线性。sdau135对应于水稻基因LOC_Os04g59540所在区域，该基因位于水稻4号染色体末端，位于LOC_Os04g59540远着丝粒端的参考序列很少，只利用水稻基因LOC_Os04g58780开发了一个分子标记sdau114，它与PmD479基因连锁，遗传距离为18.9cM，位于PmD479近着丝粒端。利用sdau141搜索大麦基因组序列（http://plants.ensembl.org/index.html），与大麦染色体2H末端基因MLOC_629180吻合。获取大麦2H染色体末端包含该位点的基因组序列，约416kb，并开发了3个与PmD479紧密连锁的分子标记sdau144、sdau146和sdau148B（sdau148对应两个拷贝，标记sdau148A与PmD479不连锁）（图3.6）。为开发PmD479基因的远着丝粒端标记，我们还利用山羊草遗传图谱2D末端的AT2D2296和AT2D2299两个SNP标记（Luoetal.,2013），分别开发了PCR标记sdau160和sdau149（图3.6）。sdau149在pop2，pop731和pop2512三个作图群体中均与PmD479共分离。通过分析sdau149（AT2D2299）区域的山羊草基因组序列，随后开发了分子标记sdau162，它在pop2和pop2512两个群体中与PmD479共分离，在pop731-111单株上与PmD479发生交换。利用JoinMap4.0绘制所开发分子标记在pop2群体中与PmD479基因的遗传连锁图，并通过大麦和水稻基因组数据库（http://plants.ensembl.org/index.html，版本release-31）分别搜索各分子标记对应的起始位点，利用Mapchart和Fireworks绘制所开发分子标记在小麦、大麦和水稻中的共线性关系（图3.7）。37 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用sdau144sdau148BBsdau149sdau162RSRSSRSegSSSSSRSRSSegDRLSegD+LSeg图3.6PCR标记在pop2群体上的表现R代表纯合抗病植株，Seg代表杂合抗病植株，S代表纯合感病植株，D代表DIC479，L代表Landong，D+L代表DIC479与Langdon混合。Figure3.6PerformanceofPCRmarkersonthepop2populationResistant(R),segregating(Seg),susceptible(S);DIC479(D),Landong(L),DIC479andLangdon(D+L)..图3.7分子标记在小麦、大麦和水稻上的共线性关系Figure3.7Syntenicrelationshipofmolecularmarkersonwheat,barleyandrice38 山东农业大学硕士学位论文3.3.4利用小麦基因组序列定位通过以上方法开发的分子标记虽然与PmD479抗病基因紧密连锁甚至共分离，但是仍未找到其远着丝粒端标记。由于PmD479位于染色体末端，也可能发生倒位，为避免因染色体倒位造成的定位错误，我们针对小麦基因组2BL末端340,000,000-345,274,828区间约5M范围的序列开发了7个分子标记（表3.3），其中sdau171位于小麦染色体2BL末端345,250,901-bp位点，接近小麦2BL最末端。但是由于这些标记多是显性标记，它们与PmD479的关系有待明确。根据共显性标记sdau174和sdau169在小麦基因组中的位置关系及其与PmD479的遗传距离，能够确定PmD479附近区域染色体没有出现倒位。利用小麦基因组序列开发的分子标记详见表3.4。表3.3利用小麦基因组序列设计的分子标记Table3.4MolecularmarkersdevelopedfromwheatgenomesequencePCR标记标记类型染色体位置遗传距离PCRmarkersTypeChr.Location(2B)GeneticDistance(cM)sdau166显性340,066,479--sdau167显性340,062,290--sdau174共显性343,008,24011.2sdau172显性344,622,876--sdau164显性345,123,634--sdau169共显性345,164,2872.6sdau171显性345,250,901--39 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用表3.4本研究所使用的PCR标记Table3.4PCRmarkersusedincurrentstudy标记名称参照作物参考位点标记类型正向引物（5'→3'）反向引物（5'→3'）酶遗传距离MarkersCropRef.LociTypesForwardPrimers(5'→3')ReversePrimers(5'→3')EnzymesGeneticDistance(cM)sdau112小麦RAC875_c37540_583InDelACACCAAATAATCCGCATCTATAACTGTGGAGAAGGCAGGCA-47.8sdau121小麦Excalibur_c56550_71CAPsATCTAATGTGCTGGAACTTTGTTTTGTCCGCCATCCTTGGTATaqI34.6sdau106小麦IACX11305dCAPsTCATGAAGCGAGGGACAGCGACAATGGAGCGCTCCTTTGHaeII-sdau111小麦BobWhite_c21827_104InDelCCAGACTTTTTGGATGGGTGCTGCTCATGAGTTTTGTCTTC-31.0sdau129小麦BS00072840_51CAPsAGGCACTCATTCTCTGATTTAATTACAGTGAGCAGAACCTTGAATaqI17.2sdau132小麦RAC875_c3259_673InDelAATTTTTCGCTGTTTCTCAGCGCAAGTAAACAGTAAAAAGGAACAC-9.7sdau134小麦Ra_c21099_1781CAPsGTTTGAGAACATGTAGATTGTAGGCGTTACGTTTCGTGTCGGScrFI2.6sdau131小麦RAC875_c19042_2102CAPsGTAACTTCTTCTGGACCCACACCTTCCTGAGAAGGGTACGHinfI1.8sdau135小麦BS00012463_51InDelTGATTCCATGGGACAGGTTTTGCTTGACTTTCTTCAGTTCG-0.6sdau141小麦tplb0035c15_1515InDelGCCTATGAGCCTATGACTCTATGTGAAGAATGATTGCAGCG-0.6sdau114水稻LOC_Os04g58780dCAPsCAGAATAGGTTGCCATCTTATTACTATATGAGCTACAAGCCGATHaeII18.9sdau144大麦MLOC_54099dCAPsCACACTGTAAAAACACATGCACATCTCTCAGACAGAAATGCTGCTaqI0.6sdau146大麦623,932,655InDelTCATTTTGGTGCGGACAACCGCCAGATGTGGCAATAACAG-2.0sdau148大麦MLOC_60701InDelGTGCATAGACATTGATCCTTCCCAGAGAAGCTTCAGGTGCAG-0.3Bsdau149山羊草AT2D2299CAPsGTCTTGGTAAGGAAGTAATCTGTGCCTTCATATTGGTGATGCAHinfI0.17sdau160山羊草AT2D2296InDelCCAACTGCAAGACAACCCTTACGATGTCTCCGACGAGGAA-0.640 山东农业大学硕士学位论文sdau162山羊草AT2D2299CAPsCGAAAGGAACAACAGCTTGCCCTGAATGAAATGACTCCAGC-0.32sdau166小麦340,066,479显性TGTGGGGAATGCCAGTATGGCATTGCCGTTGCACGATCAG--sdau167小麦340,062,290显性GGTTCGAAGGGTACAAATTGGACCCAGATACTGTGATTGGC--sdau174小麦343,008,240InDelCGATGAGCGAGTTCCAGCATCCATGCTCCTTCCAGTACAC-11.2sdau172小麦344,622,876显性TATGAACAAGATCCGTCACCTACTTATCACCCGCGAAGACG--sdau164小麦345,123,634显性TGTGCCCATCATTTTATAGGGTCTTACAGAGAGAGAAGGATTCC--sdau169小麦345,164,287CAPsCCTTCCACAGGTAACCAACGATACAGCAAATTGCGAGCGNcoI2.6sdau171小麦345,250,901显性ATGAGCCGATGGCGTTCTCTAACCCGAGGGTGAGAGATG--41 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用3.3.5利用pop3000重组体定位PmD479使用分子标记sdau135，sdau149和sdau162筛选群体pop3000，得到sdau135和sdau162之间发生重组的F2个体143株，种植各重组体的F3家系，人工接菌，调查并记录每个重组体家系的表型，最终得到91个家系的有效表型，据此可以确定91棵重组体的抗病表型和各自的PmD479基因型。利用重组体开展连锁分析，sdau149和sdau162均为PmD479基因的远着丝粒端标记，PmD479位于sdau148B-sdau149大约0.5cM的区间。3.4分子标记辅助选择3.4.1PmD479抗病基因供体的选择除了利用DIC479作为PmD479的供体外，还使用了DIC479与Langdon杂交后代中呈现栽培小麦特性的PmD479供体材料，目的在于提高与普通小麦的种间杂交成功率。DIC479不仅抗小麦白粉病，还具有一定的条锈病抗性（苑翠玲，2014）。本研究中旨在转移PmD479，但在最初选择供体亲本时综合考虑兼抗白粉病和条锈病的植株用作供体材料，随后的回交世代以抗白粉病为主。根据抗病性从群体pop2和pop3000中选择15棵F3家系作为PmD479的供体亲本，其中6株pop2高抗白粉病的F2单株（23，47B，130，148，167和196），9株pop3000高抗条绣病的F2单株（2290，2294，2302，2325，2332，2382，2389，2392和2405）。利用分子标记sdau135和sdau141鉴定9株高抗条绣病的F2单株（图3.8），其中2302在两个标记的带型均与Langdon一致，被淘汰。将其余14棵F3家系的种子在田间按株行种植，其中pop2来源的42棵、pop3000来源的40棵。2015年春，使用分子标记sdau149鉴定所选植株的基因型（图3.8），来自pop2的42棵植株以及选自pop3000的8棵植株与DIC479基因型一致，可以用作PmD479的供体材料。以上50株含有PmD479的材料经2015年12月接菌鉴定，均表现纯合抗白粉病（图3.9），说明标记sdau149可用于小麦分子标记辅助选择。42 山东农业大学硕士学位论文Asdau135sdau141123456789101112131415Bsdau14912345678910111213D14L15D+L1617181920212223242526272829D30L31D+L31333435图3.8分子标记辅助选择(A)分子标记sdau135和sdau141筛选结果，泳道1-15分别为：2294、2302、2332、2382、2389、2392、2405、2290、2325、DIC479、DIC479、Langdon、Langdon、DIC479和Langdon、DIC479和Langdon。(B)分子标记sdau149筛选结果，泳道1-18来自群体pop2，泳道19-35来自群体pop3000，D代表DIC479；L代表Langdon；D+L代表DIC479和Langdon混合。Figure3.8Mmarker-assistedselection（A）Applicationofsdau135andsdau141.Lines1-15:1.2294;2.2302;3.2332;4.2382;5.2389;6.2392;7.2405;8.2290;9.2325;10-11.DIC479;12-13.Langdon.14-15.DIC479andLangdon.(B)Applicationofsdau149.Lines1-18areplantsfrompop2.Lines19-35areplantsfrompop3000.DIC479(D);Langdon(L);DIC479andLangdon(D+L).图3.9部分被选单株F4世代的抗白粉病表型Figure3.9PowderymildewresistanceinF4plantsofselectedlines43 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用3.4.2PmD479抗病基因受体亲本的选择本研究利用普通小麦济南17、济麦19、济麦20、济麦21、济麦22、烟农19、周麦16、临麦2号、潍麦8号、泰山23、泰农18、泰山223、泰山24、周麦22、矮抗58、豫麦49-198、郑麦9023和Bobwhite作为候选受体。以DIC479和Landon为对照，对以上18个小麦品种人工接种白粉菌混合孢子并调查性状，确定以上18个品种对白粉病均表现为高感（图3.10），可能不含有PmD479抗白粉病基因。图3.10普通小麦品种的抗白粉病鉴定Figure3.10Powderymildewresistanceincommonwheat3.4.3PmD479抗病基因的转移2015年夏，在田间以济麦21、济麦22、矮抗58、泰农18、周麦16、郑麦9023、豫麦49-198和Bobwhite为母本与前期选择的PmD479供体材料配制杂交组合，获得44份杂交组合的种子（表3.5）。当年秋天在温室种植其F1植株，苗期接菌并剔除感病植株，其中16个杂交组合得到了抗白粉病的F1植株（图3.11）。44 山东农业大学硕士学位论文表3.5F1植株信息Table3.5InformationoftheF1plants母本父本F1白粉病表型母本父本F1白粉病表型FemaleparentMaleparentPowderymildewFemaleparentMaleparentPowderymildewresistanceinF1plantsresistanceinF1plants济麦212290-4抗病矮抗58Pop2-23-7抗病济麦212332-12抗病矮抗58Pop2-23-10抗病济麦212335-3感病矮抗58DIC479抗病济麦21Pop2-148-1抗病泰农182332-7感病济麦21Pop2-148-2感病泰农182332-17感病济麦21Pop2-148-4抗病泰农18Pop2-167-6感病济麦21Pop2-196-4感病泰农18Pop2-167-10感病济麦211917-18抗病泰农18Pop2-23-9抗病济麦22109-14感病泰农18109-18感病济麦222332-10感病泰农18109-10感病济麦222332-12感病周麦162325-7感病济麦222392-3感病周麦162332-6感病济麦22Pop2-167-8感病周麦162332-8感病济麦22Pop2-130-1感病周麦162332-12感病济麦22DIC479感病周麦162332-17感病矮抗582290-1抗病周麦16Pop2-167-6抗病矮抗582290-3感病周麦16Pop2-196-8抗病矮抗582325-3感病豫麦49-1982382-2感病矮抗582325-6感病豫麦49-198Pop2-130感病矮抗582332-3抗病豫麦49-198DIC479抗病矮抗582332-17抗病郑麦90231917-15抗病矮抗582392-2感病Bobwhite109-18感病45 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用矮抗58×DIC479周麦16×pop2-167-6豫麦49-198×DIC479图3.11F1植株的抗白粉病表型Figure3.11PowderymildewresistanceinF1plants以上述16个抗白粉病的F1植株作为母本，再与普通小麦济麦20、济麦21、济麦22、矮抗58、泰农18、周麦22、豫麦49-198、烟农19和Bobwhite杂交，配制了65个杂交组合，最终获得9个回交组合的种子，共14份（表3.6），种子瘦小。表3.6回交组合种子Table3.6Backcrossseeds母本父本各回交组合收获份数FemaleparentMaleparentCopies济麦21/pop2-48-1济麦221济麦21/pop2-148-4Bobwhite4济麦21/1917-18Bobwhite2周麦16/pop2-196-8济麦221周麦16/pop2-196-8济麦211周麦16/pop2-167-6Bobwhite1矮抗58/DIC479济麦222矮抗58/2332-17矮抗581泰山18/pop2-23-9烟农19146 山东农业大学硕士学位论文4讨论4.1PmD479基因的抗白粉病表现及应用普通小麦中抗病基因数目有限，原始和野生种质中蕴藏着大量的抗白粉病基因，是拓宽栽培品种遗传多样性的天然基因库。在小麦抗病育种工作中应重视野生资源中抗白粉病基因的发掘和应用。本研究发现野生二粒小麦DIC479具有高抗白粉病的表现，并使用山东泰安地区田间混合孢子及5个单一小种E21-S2-2，46-30-S2-3，52-27-S2-17，2-39-S2-1和35-27-S2-5测试了DIC479和Langdon的抗病性反应。针对混合孢子，DIC479表现全生育期抗病性，而Langdon则表现感病；针对单一生理小种，两者的反应型各异（表4.1）。在部署PmD479抗病基因时，应该考虑该基因是否对当地白粉菌生理小种有效。表4.1DIC479和Langdon的抗白粉病表现Table4.1PowderymildewresistnceofDIC479andLangdonLinesE21-S2-246-30-S2-352-27-S2-172-39-S2-135-27-S2-5DIC479中抗，ITs=2近免疫，Its=0’近免疫，Its=0’高抗，Its=1中抗，Its=2Langdon中抗，ITs=2高感，Its=4高抗，Its=1中感，Its=3中感，Its=3此外，为了在小麦育种中利用PmD479抗白粉病基因，我们通过杂交和回交转育的方法将该抗白粉病基因转移到普通小麦中。由于亲本倍性的不同，在抗病基因转移的过程中，不同杂种植株F1的表现不同：（1）对白粉菌的抗病性不同；（2）部分F1植株矮小，幼苗期即死亡；（3）部分杂种植株在整个生育期内一直存在部分叶片枯萎的现象；（4）以不同的普通小麦为母本的杂种植株的表现亦有差异，不完全受遗传背景的影响。此外，回交所得14份BC1F1种子数量少、籽粒小、种子干瘪。上述现象可能与不同倍性材料杂交时的染色体行为有关，染色体片段的丢失及染色体组成不平衡都可能影响到杂交后代的表型。同时，在受体亲本中可能存在抗病基因抑制基因或杂种植株中存在不同于亲本的表观遗传修饰，致使抗病基因转移到普通小麦中也不能正常表达固有功能。回交所得种子少且干瘪可能还与生长环境及虫害有关，本研究回交工作在温室进行，生长条件不如田间，父本材料普通小麦的出粉量少，花粉活性可能较弱，并且杂种植株在种植期间遭受蚜虫，这些都可能与结实率及种子丰满度有关。47 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用4.2PmD479是否为新型抗白粉病基因本研究将PmD479定位于小麦2BL染色体。目前，有8个已报道的抗白粉病基因也定位于该染色体臂，包括Pm6、Pm33、PmJM22、Pm51、MlAB10、Mlzec1、MlLX99和PmCH7124。由于材料限制，本研究尚未开展等位测验及抗谱比较用以确定PmD479与其它基因的等位性关系。另外，以上抗病基因的SSR标记在DIC479与Langdon间无多态性。因此，判断PmD479是否为一个新的抗病基因位点，还缺乏更多的证据。根据现有结果，只能通过抗病基因的来源和定位情况推测PmD479与2BL染色体其它抗白粉病基因的关系。初步推测Pm6、Pm33、PmJM22、Pm51、MlLX99和PmCH7124与PmD479不同，而MlAB10和Mlzec1与PmD479的等位关系需要进一步验证。上述基因中，与PmD479具有明确不同来源的有Pm6、Pm33、Pm51和PmCH7124。其中，Pm6来自提莫菲维小麦(T.timopheevii)的2G染色体（Helmsj∅etal.,1973；Qinetal.,2011），位于小麦染色体缺失臂centromere-2BL-2(FL=0.36)，2BL-0.50-1.00区间内，与RFLP标记Xbcd307紧密连锁（Taoetal.,2000；Jietal.,2007,2008)。根据物种间的共线性关系可知，Pm6所在区域与水稻4号染色体基因组27802151-33785809bp区间同源（Qinetal.,2011），而PmD479定位区段对应水稻4号染色体基因组34596722-34693342bp区间。可见，两者的来源及定位区间不同，两者没有等位关系。Pm33来自波斯小麦（T.carthlicum），与近着丝粒端微卫星标记Xwmc317，Xgwm111和Xgwm382的遗传距离分别为1.1cM，2.2cM和4.0cM。远着丝粒端标记Xgwm526与Pm33的遗传距离为18.1cM。根据Pm33的来源及与其连锁的SSR标记在小麦染色体上的位置可推测两者为不同基因。Pm51来自长穗偃麦草（Th.ponticum），位于小麦染色体缺失臂2BL-6，2BL-0.89-1.00区间内（Zhanetal.,2014）。距该基因最近两侧标记BI479701和BQ246670对应水稻基因组33000000-34050000bp区域，不同于PmD479在水稻基因组上的位置。所以，两者也应不是同一基因。PmCH7124来源于八倍体小偃麦，距抗白粉病基因MlLX99很近，遗传距离约为12.9cM。MlLX99被定位于小麦染色体2BL-0.36-0.50区间内，PmCH7124也应位于该区间（李建波等，2015；Zhaoetal.,2013），而PmD479位于小麦染色体2BL-0.89-1.00区间内。因此，从来源和染色体定位情况可以推测PmCH7124不同于PmD479。48 山东农业大学硕士学位论文PmJM22和MlLX99是在育成品种中鉴定的抗白粉病基因，由于系谱复杂，其原始供体难以考证。其中，PmJM22来自小麦品种济麦22，距离Pm33很近（Zhuetal.,2005；殷贵鸿等，2009）。此外，本研究还鉴定了济麦22和DIC479在相同的条件下接种白粉菌混合孢子的表型，济麦22表现为高感，DIC479为免疫。结合Pm33与PmJM22的位置关系及抗病性鉴定结果，可以推测PmJM22不同于PmD479。MlLX99来自普通冬小麦品种‘良星99’，定位于小麦染色体2BL-0.36-0.50区间内（Zhaoetal.,2013），与PmD479的定位区间不同，所以两者也不相同。Mlzec1和MlAB10均来源于野生二粒小麦，并且都被定位于小麦染色体2BL-0.89-1.00区段，分别与SSR标记Xwmc356和Xwmc445连锁，遗传距离分别为2.0cM和7cM，目前未发现MlAB10远着丝粒端标记，并且已经确定Mlzec1与MlAB10不是等位基因。（Mohleretal.,2005；Maxwelletal.,2010；Zhaoetal.,2013)。根据本研究PmD479的定位情况，PmD479应该位于小麦染色体2BL的末端，与Mlzec1和MlAB10的位置很接近，推测PmD479可能与Mlzec1或MlAB10是等位基因。4.3PmD479远着丝粒端分子标记的开发染色体末端发生遗传重组和交换的概率较低，并且随着分子标记与目标基因间距离的缩小，两者间染色体区段发生交换的概率也会逐渐降低，此外，一些特殊的染色体结构等都将增加基因精细定位的难度。本研究中，在定位PmD479的过程中，由于它位于2BL染色体的末端，开发的很多分子标记与PmD479共分离，如sdau148B、sdau141、sdau144、sdau135和sdau160在群体pop2中共分离，阻碍了PmD479基因的精确定位。在开发PmD479远着丝粒端分子标记的过程中，sdau149在群体pop2、pop731和pop2512三个群体中均与PmD479基因共分离，sdau162在群体pop2和pop2512两个群体中与PmD479基因共分离。它们与PmD479基因的相对位置关系不明确。为此，我们通过扩大群体来解析它们与PmD479的位置关系。在筛选pop3000群体的3045棵F2植株时，分子标记sdau149和sdau162与PmD479基因之间出现重组，根据连锁关系确定这两个分子标记为PmD479基因的远着丝粒端分子标记。由此可见，不同定位群体以及定位群体的大小对于精细定位具有决定性作用。49 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用5结论本研究围绕DIC479的抗白粉病特性开展了遗传分析及基因定位研究，得到如下结论：1.遗传分析群体F2群体（pop2）及两个F2:3亚群体（pop731和pop2512）中抗病植株与感病植株的分离比均接近3：1，且3个群体的衍生株系中抗病株系、抗病感病分离株系及感病株系的比例均接近1:2:1。通过对抗白粉病性状的遗传分析，表明DIC479的抗白粉病表现受单显性基因控制，并暂命名为PmD479。该基因具有全生育期抗病性，对山东省泰安市的混合孢子表现免疫。2.通过基于90KSNP芯片的群体分离分析法，结合中国春缺体-四体分析及比较基因组学开发了26个与PmD479连锁的分子标记。将PmD479基因定位于sdau149和sdau148B区间，大约0.5cM距离。sdau149距PmD479基因0.17cM，可用于分子标记辅助选择。3.利用DIC479及F3家系中的抗病单株与现行推广普通小麦杂交，获得9个杂交组合的14份杂交种（BC1F1世代），为利用PmD479开展小麦抗病育种提供了基础材料。50 山东农业大学硕士学位论文参考文献薄存瑶.粗山羊草抗白粉病基因PmAe16185和PmAe2147的定位及应用.山东农业大学，2014.董玉琛,郑殿升.中国小麦遗传资源.北京:中国农业出版社,2000:129-193.段霞瑜,盛宝钦,周益林,向齐军.小麦白粉病菌生理小种的鉴定与病菌毒性的监测.植物保护学报,1998,25(1):31-36.郭小山,周长勇,熊战之,付佑胜,陈香华,李茹,赵桂东.小麦白粉病的发生与防治.现代农业科技,2010,12:156-157.何家泌,何文兰,宋玉立,张忠山.小麦白粉病及其防治Ⅱ.小麦白粉病的病原菌.河南农业科学,1998,02:18-20.何家泌,宋玉立,张忠山,何文兰.小麦白粉病及其防治Ⅰ.小麦白粉病的分布、症状和危害.河南农业科学,1998,01:18-19.何中虎，兰彩霞，陈新民，邹裕春，庄巧生，夏先春.小麦条锈病和白粉病成株抗性研究进展与展望.中国农业科学，2011,44(11):2193-2215.黄映萍.DNA分子标记研究进展.中山大学研究生学刊(自然科学.医学版),2010,02:27-36.郝元峰.小麦抗白粉病基因的分子标记定位及标记辅助选择.山东农业大学,2008.李建波,乔麟轶,李欣,张晓军,詹海仙,郭慧娟,任永康,畅志坚.小麦–中间偃麦草渗入系抗白粉病基因PmCH7124的分子定位.作物学报,2015,01:49-56.李隆业,黄元江.小麦抗源材料对白粉病菌的抗性遗传分析.作物学报,1991,01:64-69.刘传光,张桂权.水稻单核苷酸多态性及其应用.遗传,2006,06:737-744.刘大钧.细胞遗传学.北京:中国农业出版社,1999.刘孝坤.我国小麦白粉病研究进展.农牧科技情报,1989,1:1-6.刘逸卿,汤其豹.小麦白粉病菌无性世代在侵染循环中的作用.植物病理学报,1985,03:191-192.牛吉山.小麦抗白粉病遗传育种研究.北京:中国农业科学技术出版社,2007.1-94.任正隆.黑麦种质导入小麦及其在小麦育种中的利用方式.中国农业科学,1991,03:18-25.盛宝钦.用反应型记载小麦苗期白粉病.植物保护,1988,01:49.宋玉立,何文兰,何家泌,张忠山.小麦白粉病及其防治Ⅹ.小麦白粉病的综合防治.河南农业科学,1998,10:12-16.51 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山东农业大学硕士学位论文附录附录1DNA提取相关溶液配制方法（1）DNA提取液（1L）:在1L烧杯中加入转子后依次加入800ml去离子水，12.1gTrizmabase(Trisbase)，5.8gNaCl，3.2gNa2EDTA，10gSDS在恒温磁力搅拌器上完全溶解，定容至1L后使用HCl调节PH至8.5。（2）苯酚：氯仿：异戊醇（1L）：将500mlTris平衡酚，480ml氯仿，20ml异戊醇混匀后室温静置过夜后备用。（3）1×TE：依次称取1.21gTrisbase和0.372gEDTANa2溶解到500ml蒸馏水中，用1MHCl调节pH至8.0，定容至1L，过滤除菌后备用。（4）3MNaAC：依次加入300ml去离子水，123g无水乙酸钠（索莱宝），70ml冰乙酸，调节pH至5.2，定容至500ml备用。（5）Rnase（索莱宝）：将Rnase固体包装6000rpm离心1min，加入1ml去离子水溶解，全部转移至50ml离心管中，调浓度至10mg/ml，煮水中沸30min，室温下自然冷却，分装至2ml离心管中，-20℃保存备用；附录2PCR产物检测及转化过程所需溶液配制方法（1）50×TAE的配制：800ml水中加入242gTris碱，37.2gNa2EDTA.2H2O，充分溶解，加入57.1ml冰乙酸，加水定容至1L，用NaOH调PH至8.5，室温保存。（2）5×TBE的配制：Tris-base54g，硼酸55g，20ml0.5M(PH=8.0)EDTA，加水至1L，室温保存。（3）10%过硫酸铵溶液（APS）：5g过硫酸铵加入50ml离心管中，加入去离子水至50ml，待融化完毕后分装至2ml离心管中，每管1ml，存放于-20℃冰箱备用。（4）40%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺（19:1溶液）：在干净的烧杯中加入转子后先加入300ml去离子水，然后依次加入380g丙烯酰胺和20g甲叉双丙烯酰胺，在磁力搅拌器上适当加热、搅拌，待充分溶解后定容至1L，4℃保存备用；（5）氨苄（100mg/ml，50ml）：称取5g氨苄西林加入50ml离心管中，加入40mlddH2O充分混合溶解后定容至50mL，用0.22μm滤头抽滤除菌后分装入2mL离心管中，-20℃保存备用。59 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用（6）液体LB培养基：在1L锥形瓶中依次加入5g胰蛋白胨（tryptone），2.5g酵母粉（yeastextract），5g氯化钠（NaCl），用ddH2O定容至500ml，封口后灭菌。（7）固体LB培养基：在1L锥形瓶中依次加入5g胰蛋白胨（tryptone），2.5g酵母粉（yeastextract），5g氯化钠（NaCl），7.5g琼脂粉，用ddH2O定容至500ml，封口后灭菌。室温冷却至约40℃时加入抗生素混合均匀，分装至培养皿中。60 山东农业大学硕士学位论文致谢时间飞逝，白驹过隙，三年的研究生生活即将结束，而三年的点点滴滴依然历历在目。回想三年的学习和生活时光，不禁感慨万千。三年时光，我不仅收获了知识和技能，更加收获了为人处世的心得，有成功的欣喜也有失败的沮丧，幸得良师益友的帮助和家中父母的关心。三年时光不再，感恩之情犹存！首先感谢我的导师付道林教授。感谢付老师在实验和生活中曾给予我的指导和关心。从付老师身上看到了作为一名科学家的美好素质和品德。在实验和生活中，付老师一直以“为人师表”四个字标榜自己。为人正直、学识渊博、治学严谨、热爱科研、热爱祖国是付老师使我信服和崇拜的美好品质。您的美好品质也会一直影响我，是我学习的楷模。本论文的完成离不开付老师的谆谆教诲，感谢老师在实验中给予我孜孜不倦的指导，同时也感谢您给予我独立思考的空间。三年的学习生活，我逻辑思维能力、独立思考能力、和动手能力都得到了提高，同时充实的实验安排使我知道如何更加合理的安排时间。在此，由衷地向付老师表达我的感激之情。感谢吴佳洁老师在实验中提出的宝贵意见和帮助，同时感谢吴老师在生活上对我的关心。吴老师对实验室的管理使我们有了良好的实验环境和学习态度。在田间实验过程中还要特别感谢李宪斌老师给予的帮助。本研究中使用的部分材料是由苑翠玲博士创制的，在实验过程中她也给予了我很多的指导和帮助，教会我基本的实验方法和技能。衷心的感谢苑翠玲师姐对我的帮助和指导。感谢实验室博士后吕波和其他同窗倪飞、张朝中、裴洪翠、徐宗昌、王文良、刘强、齐娟、王艳、郝群群、张会飞、姜婷婷、李孟凯、冯丽君、吴竞争、韩伟，本科实习生黄德华、林萌萌、魏敏、赵培培、陈树栋，实验室工作人员王红、陈凤娟。感谢各位在实验和生活中曾给予我无私的帮助和暖心的关怀。感谢美国加州大学戴维斯分校罗明成老师、湖北省农业科学院植保土肥所喻大昭研究员和曾凡松博士对本研究提供的帮助。感谢王洪刚老师、孔令让老师、刘保申老师等在研究课题开题和中期考核过程中提出的指导意见，在此，向他们表示诚挚的谢意。61 野生二粒小麦‘DIC479’抗白粉病基因的定位及应用感谢爸爸妈妈在生活上和经济上对我的无私奉献，感谢他们对我的无限关怀、理解和支持，让我可以顺利完成学业，我不会辜负父母的殷切期盼。感谢生活中的各种困难和考验使我越来越强大。感谢自己曾失败后、沮丧后、懒惰后、进步后仍不忘初心，努力前进。最后，再次衷心地感谢给予过我帮助的人。祝福大家幸福一生!闫百蔷2016年5月于泰安62 山东农业大学硕士学位论文攻读学位期间发表的论文1.闫百蔷,苑翠玲,姜婷婷,付道林,吴佳洁.野生二粒小麦‘DIC479’中抗白粉病基因的发现与定位.中国科技论文在线（审稿中）2.苑翠玲,闫百蔷,吕波,王洪刚,付道林,吴佳洁.野生二粒小麦抗条锈病基因YrD479的定位.中国科技论文在线（审稿中）63
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