流感病毒实验室PCR检测技术

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流感病毒实验室PCR检测技术佳木斯市疾病预防控制中心流感病毒实验室PCR检测技术 标本采集应遵循标准的流感检测方案应采集鼻拭子和/或咽拭子，和/或依据标准操作来进行采集。对标本采集者应采取适当的防护。对于标本的处理、储存和运输应遵照流感病毒AH5N1的操作指南来进行。流感病毒实验室PCR检测技术 标本采集（一）主要采集上呼吸道标本鼻咽拭子：将棉签平行于上颚插入鼻孔，保持几秒吸收分泌物。口咽拭子：拭抹咽后壁和扁桃体部位，避免触及舌部；迅速将棉签放入无菌、内装3-5ml样本运送液及带垫圈的螺口塑料管中，在靠近顶端处折断，旋紧管盖并密封。气管分泌液：收集气管吸取液或支气管灌溉液5-10ml放入无菌、带垫圈的50ml螺口塑料管中，立即密封。流感病毒实验室PCR检测技术 标本采集（二）血清：采集5-10ml全血放入带垫圈的螺口管中，不加抗凝剂，待血液凝固分离血清，-20℃保存，血凝块灭菌处理后弃掉；采集时间：入院后24小时；14-28天或出院当日。流感病毒实验室PCR检测技术 采样液的要求标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存采样液应包含有一定量的蛋白质和抗菌素最佳采样液：Hank’s液，Eagel’s液,生理盐水BD15ML采样管拭子是聚脂纤维杆可折断，不推荐棉拭和木杆流感病毒实验室PCR检测技术 临床样本收集的注意事项操作要细心，严防标本间交叉污染，要做好自我保护采集标本要有一定力度标本采集后应迅速至于冰上或者4℃以下保存，因为流感病毒对热很敏感标本管上写明：医院名称，标本号，患者姓名，性别，采样日期标本采集后4℃保存，尽量在24小时内送到实验室进行检测，未能及时进行检测的应放-70℃或以下保存，放置4℃不应超过4天流感病毒实验室PCR检测技术 临床标本运输临床标本应按照A类包装要求运送，并用干冰运输。所有标本应标示清楚。疑似病例标本运送应包含的信息请参照禽流感标本运输。流感病毒实验室PCR检测技术 A类感染性物质指在运输过程中与之接触能对健康人或动物造成永久性残疾或致命疾病的感染性物质。此处“接触”系指感染性物质离开保护性包装与人或动物的身体接触或经呼吸道吸入的情况。A类感染性物质使人染病或使人和动物都染病者联合国编号为UN2814，其运输专用名称为危害人的感染性物质；仅使动物染病者联合国编号为UN2900，其运输专用名称为仅危害动物的感染性物质。流感病毒实验室PCR检测技术 A类感染性物质的包装与标签流感病毒实验室PCR检测技术 临床标本的包装（1）标本必须放在大小适合的带螺旋盖内有橡及圈的塑料管里，拧紧。（2）将密闭后的标本放入大小适合的塑料袋密封；每袋装一份标本。（3）在采样管上用油性记号笔做好标记用塑料袋密封。同时填写人感染猪流感监测病例标本原始登记表，用另一塑料袋密封。（4）将标本密封袋放入专用运输箱内，放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具有吸水和缓冲能力的材料。同一患者2份以上的密封标本，可以放在同一塑料袋内再次做密封。所有容器必须有生物危险标识。流感病毒实验室PCR检测技术 临床标本运送、接收和保存根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》（国务院424号令）的有关规定，人禽流感标本应当由不少于两人的专人护送，并采取相应的防护措施，不得通过公共电（汽）车和城市铁路运输。标本接受不少于两人，做好记录，办理相关接受手续。标本保存应设立专库或专柜单独保存流感病毒实验室PCR检测技术 实验室检测决策流行早期阶段重点在于控制和预防，此时高灵敏度的检测手段（如流行株特异性核酸检测）实优先被选择的，目的在于发现起始病例或病例群，以便能够及时地进行抗病毒治疗和制定相应的预防策略。流感病毒实验室PCR检测技术 实验室检测决策流感已经广泛流行期间此时的重点在于临床病例的确认，进而防止在医院内进一步传播扩散，因而此时实验室检测可以采用免疫荧光、快速抗原检测（快诊）等技术进行病理诊断，并且在有可能的情况下进行耐药性检测。流感病毒实验室PCR检测技术 禽流感(H5N1)病毒的检测方法核酸检测抗体检测病毒分离抗原检测HIMNSRH细胞分离鸡胚分离PCRMDDNASBAIFAELISA胶体金诊断快速；特异度高；灵敏度低；诊断快速；特异度高；灵敏度高；得不到病毒；特异度高；无法进行早期诊断；金标准；病毒可用于其它研究；需要较严格的实验条件；流感病毒实验室PCR检测技术 实验室检测方法推荐的检测方法用Real-timeRT-PCR方法检测猪流行性感冒（H1N1病毒）病毒。检测A型流感病毒的M基因、Swine（H1N1）的HA基因和NP基因，以及质控对照RNP基因确诊猪流感病毒A/H1N1的唯一可靠的方法是进行病毒分离（病毒分离应在BSL-3实验室进行），并且进行部分/全基因测序。流感病毒实验室PCR检测技术 其他检测方法快速流感抗原检测可以区分A和B型流感病毒，不能区分亚型快速检测实验A型流感阳性的病例符合可能病例的标准但由于和其它检测方法相比灵敏度较低，因此，快速检测阴性结果可能是假阴性，不能作为猪流感感染的最后诊断。流感病毒实验室PCR检测技术 快诊方法的特点操作简单快速（＜30min）教过容易判断和解释无仪器设备需求，可用于疫情现场检测FluA和FluB不能进行亚型的鉴别流感病毒实验室PCR检测技术 快诊的应用价值感染病例的处理：辅助流感病例的临床治疗策略和医院处理方案的制定。爆发疫情的处理：有助于对爆发疫情的预防控制制度的建立。公共健康：在流感爆发期间，对于公共场所（如商业区、旅游区）的人群健康，快速诊断将提供有效的信息以供控制方案的制定，提供有效的公共健康建议。流感病毒实验室PCR检测技术 快诊的应用价值监测：为社会公众提供流感活动情况的“早期预警”系统。在一些国家快速检测已经被应用流感的监测形成制度，被用于病毒分离前的标本筛选。但是WHO要求对流感进行抗原分析，不推荐把快速检测作为监测的单一手段。流感病毒实验室PCR检测技术 免疫荧光法免疫荧光试验可以区分A和B型流感病毒。结果取决于临床标本的质量，操作技能由于免疫荧光和其他免疫检测方法中使用的抗体可能不会和该病毒的靶位点结合，因此会产生假阴性结果，不能作为猪流感感染的最后诊断。流感病毒实验室PCR检测技术 PCR虽然在PCR方法中检测流感基因的高度保守片段和确诊A型流感的引物也许还可以使用，但目前PCR诊断试验中用于A型流感病毒分型的引物可能不能检测非人类病毒。流感病毒实验室PCR检测技术 Real-TimePCR基本原理:指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法.荧光基团主要有TaqMan荧光探针和SYBR荧光染料TaqMan荧光探针工作原理:PCR扩增时,在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,探针两端分别标记一个报告荧光基团和淬灭荧光基团.探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,探针被酶切降解,报告基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统接到荧光信号,每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步流感病毒实验室PCR检测技术 流感病毒实验室PCR检测技术 流感病毒实验室PCR检测技术 流感病毒实验室PCR检测技术 步骤1.病毒核酸提取:QIAGENRNeasyMiniKit(74104)1.100ul样品+500ulRLT,混匀静置5-10分钟2.加入5UL巯基乙醇和600UL70℅的乙醇充分混匀3将Rnedsyminispin柱子置于干净的2ML收集管，吸出600UL液体加入柱子中，12000rpm,离心15秒，弃液。4吸出600UL液体加入柱子中，12000rpm,离心15秒，弃液。5向柱子中加入700ULWashBufferRW1，12000rpm,离心15秒6从Kit中取一支干净的2ml收集管，将离心后的柱子移到新的收集管上，加入500ulWashBufferRPE（加入44ml无水乙醇），12000rpm,离心15秒7弃液，加入500ulWashBufferRPE液，13000-14000rpm,离心2分8将柱子移到1.5ml的EP管，加入50ulRnase—freeWater，静置2分912000rpm,离心1分，收集离心液为提取的RNA，立即做实验或-20℃保存流感病毒实验室PCR检测技术 组分体积(ul)2xMasterMix12.5x(n+4)上游引物0.5x(n+4)下游引物0.5x(n+4)QuantiTectRTMix0.5x(n+4)probe0.5x(n+4)RNA5.0x(n+4)RNasefreewaterUpto25x(n+4)引物和探针4对：InfA，swInfA，swH1，RP反应体系的配置实验步骤流感病毒实验室PCR检测技术 反应程序50℃30分钟95℃2分钟95℃15秒55℃30秒回到第3步,45个循环72℃作用10分钟4℃保存结果分析流感病毒实验室PCR检测技术 结果判定NTC应无扩增曲线所有样品的RP反应曲线CT值小于37，表示采样合格HSCCT值大于40PTCCT值小于40InfA，swInfA，swH1均（+），表示人感染猪流感流感病毒实验室PCR检测技术 流感病毒实验室PCR检测技术 谢谢流感病毒实验室PCR检测技术 此课件下载可自行编辑修改，供参考！感谢你的支持，我们会努力做得更好！