DB37∕T 3128.3—2020 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术　第3部分：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染间接ELISA诊断技术(山东省)

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1、TCS65.020.30B41DB37东ET山巳山省且，万标准DB37/T3128.3一-2020群禽腺病毒感染诊断技术第3部分:血清4型群禽腺病毒感染间接ELISA诊断技术Diagnostictechniquesforfowladenovirusgroup1infectionPart3:AnindirectELISAfordetectionofantibodyagainstfowladenovirusgroup1serotype42020-06-08发布2020-07-08实施山东省市场监督管理局发布DB37

2、/T3128.3--2020目IJ1=1本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准白山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准白山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东农业大学。本标准主要起草人:刁有祥、唐熠、杨晶、王j鸣志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。IDB37/T3128.3--2020群禽腺病毒感染诊断技术第3部分:血清4型群禽腺病毒感染间接ELISA诊断技术1范围本标准规定了间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测鸡血清4型I群禽腺病毒抗体的技术规范。本标准所规定间接酶联免疫吸

3、附试验(E口SA)适用于鸡血清4型I群禽腺病毒感染抗体的特异性检验。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1血清4型l群禽腺病毒FowIadenovirusgroupISerotype4是引起鸡心包积水肝炎综合征的

4、病原，主要造成3周龄~5周龄鸡突然死亡，并伴随有心包积水和肝炎。3.2一抗Primaryantibodies第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。本标准的一抗为经离心后分离后鸡的血清待检样口口口。3.3酶标二抗HRP-Iabeledsecondaryantibodies二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白，同时用辣根过氧化物酶进行标记的抗体。本标准中的酶标二抗为兔抗鸡辣根过氧化物酶标记的IgG，其效价应在1:32以上。3.4血清

5、标准品DB37/T3128.3--2020SPF鸡接种血清4型I群禽腺病毒经PCR检测为阳性后，制备的血清为阳性血清;SPF鸡的血清作为标准阴性血洁，PCR检测结果为阴性。4实验室要求4.1环境4.1.1实验室符合GB19489和GB!T27401要求，实验室必须为生物安全H级CBSL-2级)及以上实验室。4.1.2生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品(血液)收集高压灭菌后，送有资质的医用垃坡处理公司做最终处理。4.2人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理和血清学实验室检测技术培训。

6、熟悉生物样品处理以及熟悉间接ELISA检测结果的判断方法。4.3仪器设备4.3.1台式高速离心机(最大转速为15000rpm)。4.3.2酶标仪。4.3.3微量移液器:最大量程分别为10μL、20!JL、100!lL、1000μL。4.3.4聚苯乙烯板。4.3.5水平振荡器。4.3.6恒温培养箱。4.4试剂或材料除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合GB!T6682规定的一级水。4.4.1阳性血洁，SPF鸡接种血清4型I群禽腺病毒经PCR检测为阳性后，制备的血洁。4.4.2阴性血洁，SPF鸡血洁，PCR检

7、测结果应为阴性。4.4.3血清4型I群禽腺病毒抗原:经浓缩纯化灭活后的全病毒，浓度为4.68mg/mL。4.4.4酶标二抗:兔抗鸡辣、根过氧化物酶标记的IgG，效价应在1:32以上。4.4.5磷酸盐缓冲液CPBS)，见附录A.1o4.4.6包被液，见附录A.2。4.4.7洗涤液，见附录A.304.4.8样品稀释液(封闭液)，见附录A.404.4.9底物溶液，TMB底物显色液。4.4.10终止液(浓度为2酌，见附录A.505样品5.1样品的准备与处理2DB37/T3128.3--20205.1.1持检禽血清样品，

8、每份不少于200μL，无溶血。5.1.2用样品稀释液4.4.8将被检血清样品稀释10倍C1:10，如10μL血清加入90μL稀释液中)。注意:不要稀释对照血洁。5.1.3确保每个样品换一个吸头，做好样品的标记。稀释的样品血清充分泪匀后，加入包被孔。5.2样晶保存样品应尽快处理。5.3操作步骤5.3.1将试验试剂预温到20"C~25"C。5.3.2将全病毒抗原按照浓度为4.68μg/μL