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1、神经元原代培养一、准备1•试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并加入与血清等体积的水。对照瓶内插入1〜2支温度计（保证测试温度的准确性）。将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56C时，定时30分钟。灭活后分装70ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20〜-700c保存。2）D・Hank's液（g/L）：NaCI:8,KCI:0.4,KH2Po4:0.06,NazHPO42H2O:0.06,NaHCOa：0.35;酚红：0.02,超纯水溶解，调节PH至7.2,高压灭菌（购自南方医院临床试验中
2、心）。3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤,200□或400[3l/tube分装「20度储存。母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml（购自Sigma,P2636,100mg）。配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。用时加入49ml超纯水稀释为。1mg/ml的工作液。4）50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装5013l/tube-20C保存。使用时需将终浓度调整为25讪（购自Sigma,G8415,100g，分子量：147.13）。配制方法：电子天平称量谷氨酸1.47139,即0.01!71。1=100101。1,溶于20。0
3、11超纯水中「配制为50mM的谷氨酸母液。例：500ml的NeurobasalMedium中力口人Glutamate母液（50mM）250P，此时终浓度约为25八M。5）胰蛋白酶：0.25%（购自Hyclone,SH30042.01,100ml）。6）阿糖胞甘（AraC）母液：10mM,（阿糖胞甘，1：1000稀释用）（购自Sigma,C1768,100mg，分子量：243.22）;配制方法：100mg/243.22~0.41mM、加入41ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。AraC工作液：10八M（半量换液，终浓度5八M）;7）DNAsel（）（
4、购自ROCHE,,100mg,1mg=2000U,用dWO配成10mg/ml母液，过滤分装100p/tube每次使用50-100pl）Q拉餐甘7）培养基FBSDMEM/F12：购自Hyclone，SH30023.01B，500ml双抗：购自GIBCO-100mlNeurobasalMedium-A：购自G旧CO,（新生鼠）或（孕鼠）500mlB27：购自GIBCO,17504-044,10mlGlutamax-100X：购自GIBCO,3505061,100ml①分离培养基：10%FBS+DMEM/F12+双抗②培养用StartMedium：Neuroba
5、salMedium-A500ml+B2710ml+Glutamax-100X5ml+Glutamate25③换液用CultureMedium：NeurobasalMedium-A500ml+B2710ml+Glutamax100X5ml2.耗材1）EMS盖玻片：膜片钳和激光共聚焦检测试验时才需要使用。2）各型枪头：10d、100pl、1000pl、5ml3）细胞培养皿：4）细胞培养瓶：5）离心管：二、步骤1.手术器械消毒:直头眼科剪、直头、弯头显微银各1把为一套器械，准备两套并分别置于50ml烧瓶中，70%酒精浸泡30min。2.动物：出生24小时内的SD大
6、鼠（下称乳鼠）约10只；3.海马组织分离：①培养皿2个，分别加入冰冻D・Hank，液约5ml，至于冰盘上；②取乳鼠，用左手拇指和食指固定乳鼠头部，酒精棉球皮肤消毒3遍，直头眼科剪酒精灯火焰消毒后（下同）剪开皮肤，换第二把直头眼科剪剪开颅骨,弯头显微镜向两侧牵拉开颅骨暴露乳鼠大脑，换第二把弯头显微镶由颅底部分离乳鼠大脑，然后置入冰冻的D・Hank液中。②用直头显微镣固定乳鼠大脑，将两大脑半球分离后，用弯头显微镶分离脑干后，以直头显微镣固定并敞开皮质，最后用弯头显微镣由海马游离端仔细分离海马组织，并剔除血管及脑膜。③将分离好的海马组织至于加有冰冻D-Hanks液
7、的青霉素瓶中，用直头眼科剪剪碎组织至约1mr^的小块，加入约5倍组织体积的0.25%胰蛋白酶37C消化10min，加入分离培养基终止消化。⑤机械吹打分散细胞，40叩筛网过滤，制成单细胞悬液，1000rpm室温离心6min,弃去上清液，加Startingmedium，尖嘴吸管吹打分散细胞后，制成4X105个/ml的单细胞悬液，接种在预先包被有多聚赖氨酸（PLL）的培养板内。⑥在通以95%空气、5%CO2,37C细胞培养箱中培养。接种72h后，加入含10讪阿糖胞音的CultureMedium作用48h，以抑制胶质细胞的过度增殖。之后每隔两天用CultureMed
8、ium换液，每次更换的量为原体积的1/2，培养12天
