ttc根系活力测定方法

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时间:2018-03-07

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1、TTC溶液的配制:取3gTTC溶于1L蒸馏水或冷开水中,配制成01%的TTC溶液。药液PH应在65~75,以PH试纸试之(如不易溶解,可先加少量酒精,使其溶解后再加水)。【方法】1将玉米、小麦等作物的新种子、陈种子或死种子,用温水(30℃)浸泡2~6H,使种子充分吸胀。2随机取种子2份,每份50粒,沿种胚中央准确切开,取每粒种子的一半备用。3把切好的种子分别放在培养皿中,加TTC溶液,以浸没种子为度。4放入30~35℃的恒温箱内保温30Min。也可在20℃左右的室温下放置40~60Min。5保温后,倾出

2、药液,用自来水冲洗2~3次,立即观察种胚着色情况,判断种子有无生活力植物根系活力的测定(TTC法)一、原理  氯化三苯基四氮唑(TTC)是标准氧化电位为80mV的氧化还原色素,溶于水中成为无色溶液,但还原后即生成红色而不溶于水的三苯甲(TTF),如下式:生成的三苯甲(TTF)比较稳定,不会被空气中的氧自动氧化,所以TTC被广泛用作酶试验的氢受体,植物根系中脱氢酶所引起的TTC还原,可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到增强,而被丙二酸、碘乙酸所抑制。所以TTC还原量能表示脱氢酶活性,并作为根系活力的指标。  二、实验材料

3、、试剂与仪器设备  (一)实验材料  水培或砂培小麦、玉米等植物根系。  (二)试剂1.乙酸乙酯(分析纯)。2.次硫酸钠(Na2S2O4,分析纯),粉末。3.1%TTC溶液:准确称取TTC1.0g,溶于少量水中,定容到100mL。用时稀释至需要的浓度。4.磷酸缓冲液(1/15mol/L,pH7.0)。5.1mol/L硫酸:用量筒取比重1.84的浓硫酸55mL,边搅拌边加入盛有500mL蒸馏水的烧杯中,冷却后稀释至1000mL。6.0.4mol/L琥珀酸:称取琥珀酸4.72g,溶于水中,定容至100mL即成。  (三)仪

4、器设备  小烧杯3个,研钵1个,移液管:0.5mL1支、10mL1支、5mL3支,刻度试管6支,分光光度计,分析天平(感量0.1mg),电子顶载天平(感量0.1g),温箱,试管架,药勺,石英砂适量,滤纸。  三、实验步骤  1.定性测定  (1)配制反应液  把1%TTC溶液、0.4mol/L的琥珀酸和磷酸缓冲液按1:5:4比例混合。  (2)把根仔细洗净,把地上部分从茎基部切除。将根放入三角瓶中,倒入反应液,以浸没根为度,置37℃左右暗处放1~3h,以观察着色情况,新根尖端几毫米以及细侧根都明显地变成红色,表明该处有

5、脱氢酶存在。  2.定量测定  (1)TTC标准曲线的制作  取0.4%TTC溶液0.2mL放入大试管中,加9.8mL乙酸乙酯,再加少许Na2S2O4粉末摇匀,则立即产生红色的TTF。此溶液浓度为每毫升含有TTF80µg。分别取此溶液0.25mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL置10mL刻度试管中,用乙酸乙酯定容至刻度,即得到含TTF20µg、40µg、80µg、120µg、160µg的系列标准溶液,以乙酸乙酯作参比,在485nm波长下测定吸光度,绘制标准曲线。  (2)称取根尖样品0.5g,放

6、入小烧杯中,加入0.4%TTC溶液和磷酸缓冲液(pH7.0)各5mL,使根充分浸没在溶液内,在37℃下暗保温1~2h,此后立即加入1mol/L硫酸2mL,以停止反应。(与此同时做一空白实验,先加硫酸,再加根样品,37℃下暗保温后不加硫酸,其溶液浓度、操作步骤同上)。  (3)把根取出,用滤纸吸干水分,放入研钵中,加乙酸乙酯3~4mL,充分研磨,以提出TTF。把红色提取液移入刻度试管,并用少量乙酸乙酯把残渣洗涤2~3次,皆移入刻度试管,最后加乙酸乙酯使总量为10mL,用分光光度计在波长485nm下比色,以空白试验作参比测

7、出吸光度,查标准曲线,即可求出TTC还原量。  四、结果计算根系活力=C/(1000*W*h)[mgTTF/(g•h)]式中:C——四氮唑还原量,μg。W——根重,g。    h——时间,h。

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