ctla－4基因多态性与牙周炎的关系研究

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1、CTLA－4基因多态性与牙周炎的关系研究　　牙周炎是一类累及牙齿周围组织的感染性病变，其特点是炎症破坏牙周支持组织，导致牙周袋的形成及牙槽骨吸收最终造成失牙。研究发现许多免疫因子的基因多态性与侵袭性牙周炎、慢性牙周炎的易感性密切有关，如TNFα、IL－6、IL－10等。CTLA－4作为免疫反应中重要的负性调控因子，对于其基因多态性与牙周炎的关系还不是十分清楚。为进一步探明CTLA－4基因多态性与中国人群中的侵袭性牙周炎、慢性牙周炎的关系，我们检测了55例慢性牙周炎、48例侵袭性牙周炎以及80例健康者中的CTLA－4+49A/G、－318C/T位点基因多态

2、性分布，并进行相关统计学分析。　　1材料与方法　　1．1研究对象:选自2011－09～2012－11期间就诊于我院口腔科患者，诊断均符合牙周病分类国际研讨会制定的基于全口牙周袋深度(PD)和牙周附着丧失(CAL)的分类诊断标准，均无明显的颌面畸形及相关局部刺激因素，无糖尿病、心血管疾病等系统性疾病，无吸烟史。其中慢性牙周炎55例，男35例，女20例，年龄(40．7±10．2)岁;侵袭性牙周炎48例，男30例，女18例，年龄(31．2±8．3)岁;健康对照组为牙周健康、无口腔及系统性疾病70例，男39例，女31例，年龄(38．7&plusm

3、n;7．9)岁。　　1．2样本采集及DNA提取:采用Chelex－100法从颊膜拭子中提取DNA:用无菌棉签取双侧颊黏膜拭子，自然干燥过夜，无菌密封保存。随后取拭子表层，加入浓度为5%的Chelex－100溶液150μl浸没黏膜拭子，加入20mg/ml的蛋白酶K4μl，漩涡混匀，40℃水浴消化过夜后煮沸10min，并置于冰上冰浴3min，低温离心机14000rpm/min离心2min，取上清后－20℃保存。　　1．3CTLA－4+49A/G基因型测定:采用多聚酶链反应－限制性内切酶片段长度多态性(PCR－RFLP)法检测基因型:上、下游引物分别为5－GC

4、TCTACTTCCTGAAGACCT－3，5－AGTCTCACTCACCTTTGCAG－3，引物由上海生工公司设计合成;PCR反应试剂盒购于Takara公司，反应体系为20μl，其中DNA5μl，MgCl20．5μl，上下游引物各0．5μl，Taq酶2U，10缓冲液2μl，用ddH2O补足至20μl;反应程序设置为:预变性95℃10min，95℃15s，60℃30s，72℃60s，30个循环，最后72℃10min延伸;PCR反应产物为162bp的目的基因片段;酶切反应:162bp的PCR扩增产物8μl，加入BbvI限制性内切

5、酶(NEB公司)5μl，再加入10缓冲液1．5μl，后于37℃酶切12h;酶切产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，硝酸银染色进行基因型鉴定;CTLA－4+49A/G基因扩增片段为162bp，酶切后获得88/72bp片段的为等位基因G，仍为162片段的是等位基因A，兼有二者的为杂合子。　　1．4CTLA－4－318C/T基因型测定:方法如上所述，其上下游引物为为5－AAATGAATTGGACTGGATGGT－3，5－TTACGAGAAAGGAGGCCGTG－3;PCR扩增产物片段为247bp，MseI限制内切酶酶切以后获得226/21片段的为等位基因C

6、，获得130/96/21片段的为等位基因T，二者兼有者为杂合子。　　1．5统计学分析:直接计算法计算出基因频率和基因型频率，采用χ2检验进行各组基因型Hardy－Weinbery平衡吻合度检验;等位基因与基因型频率之间的差异通过χ2检验进行分析。　　2结果　　2．1CTLA－4外显子1第49位点A/G基因多态性与牙周炎关系:如表1所示，3组的基因分布均符合HWE;正常对照组与慢性牙周炎组比较结果显示，等位基因G在慢性牙周炎组的患者中频率显着高于健康对照组(P＜0．05，OR=1．84，95%CI1．09～3．09);而在基因型比较中发现，基因型GG在

7、慢性牙周炎患者中的频率同样高于对照组，二者具有显着的统计学差异(P＜0．05，OR=2．15，95%CI1．07～4．33)，但基因型AA在二组间的表达水平却不具有显着的统计学差异(P＞0．05，OR=0．45，95%CI0．17～1．24)，提示等位基因G及基因型GG可能是慢性牙周炎的易感因子。而对于急性牙周炎而言，结果并未发现等位基因G或基因型GG的频率在急性牙周炎患者中存在显着的差异。【表1】　　2．2CTLA－4基因启动子区318位点C/T基因多态性与牙周炎关系:如表2所示，与CTLA－4+49A/T相似，3组中的HWE检验均＞0．05;而对于牙周炎患者