日本斑点热立克次体近缘株重组ompb蛋白抗原性研究

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1、日本斑点热立克次体近缘株重组OmpB蛋白抗原性研究宗佳刘伯玉陈振Adams李嘉嘉章孝成刘晓宁任翠平柳燕安徽医科大学微生物教研室目的探讨关于斑点热立克次体的临床诊断及流行病学调查而进行的诊断方法学研究。方法构建R.JaponicaAnhui120strainOmpB原核表达质粒,表达、鉴定并纯化重组蛋白，用其作为抗原建立间接ELTSA检测方法，检测120份临床样本屮口本斑点热立克次体特异性IgG抗体，并评价方法的敏感性和特异性。结果获得了高表达、高纯度的OmpB重组蛋白，建立的间接ELISA方法体系与美国食品和药物管理局认

2、可的诊断试剂盒相比有良好的特异性和敏感性，两者的特异性为100%，敏感性为96.7%，符合率为99.2%，Kappa值为0.98。结论OmpB重组蛋白具有很好的免疫反应性，能特异地检出斑点热立克次体TgG抗体，间接ELISA方法可作为临床诊断的技术储备及流行病调查和科学研宄。关键词：曰木斑、6:热立克次体;OmpB;蛋白纯化;涵体;间接ELISA;如康氏立克次体引起的地中海斑点热，立氏立克次体引起的落基山斑点热。斑点热的临床症状初期与普通的感冒相似，往往伴随着高烧，各种疼痛、恶心、呕吐和皮疹，严重的患者可能出现中枢神经系

3、统的症状。1984年日木学者从患者血中分离到斑点热立克次体，经血清学鉴定显示均与斑点热群参照株不同，于是就将其命名为口本斑点热立克次体m。2013年前，我国对斑点热的研宄主耍集中于黑龙江立克次体、四伯利亚立克次体和内蒙古立克次体3个种的流行病学调查位1。2013年，该研究团队在安徽省大别山区一例连续转诊的发热患者血液标木中分离到一株H木斑点热立克次体近缘株安徽120株(R.JaponicaAnhui120strain)，简称安徽120株，这是首次在我国发现并成功分离的人感染口本斑点热立克次体菌。OmpB蛋0是立克次体主要

4、表面蛋白，与致病密切相关位1，且可诱导机体产生相应抗体。由于目前我W还没有用于临床、流行病调查的日本斑点热立克次体检测试剂盒［4-6］，该研宄通过分子生物学和免疫学方法构建OmpB原核表达质粒、纯化表达的重组蛋白并建立间接ELISA检测方法以检测斑点热立克次体特异性IgG抗体，旨在为立克次体致病机制研究和血清学诊断提供实验方法学基础。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物4只新丙兰大白兔，由安徽医科大学实验动物中心提供，室温维持在24~301，提供食物和水。1.1.2实验试剂DNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒、TaqDN

5、A聚合酶限制性内切酶Hindlll、XhoI和DNA连接酶购自大连TaKaRa公司；大肠杆菌DH5a和大肠杆菌BL21感受态细胞由木实验室制备;96孔聚苯乙烯微量细胞培养板、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔TgG和辣根过氧化物酶标记的羊抗人TgG购自北京中杉金桥生物公司；斑点热立克次体、斑疹伤寒、恙虫病IgG抗体免疫荧光试剂盒购自美国Focus公司;中国食品和药物管理局认可的新布尼亚病毒lgG抗体检测试剂盒。1.1.3标本来源经美岡Focus公司和FDA认证试剂盒确诊的30份新布尼亚病毒IgG阳性血清，30份斑点热TgG阳性血

6、清，4份确诊的斑疹伤寒TgG阳性血清，26份FDA认证确诊的恙虫病IgG阳性血清以及30份正常人血清。1.2方法1.2.1菌种的复苏培养从-80°C冰箱取出冻存的R.JaponicaAnhui120strain,置于37°C水浴锅中，待融化后，取0.5ml感染含3%胎牛血清的RP-MT的人单核ft血病细胞(humanmonocyticleukemiacells,TIIP-1)并在34°C、5%C02饱和湿度下培养。感染5d后，每天通过Diff-Quick染色后在油镜下观察，当感染率接近100%的时候，即可作为日本斑点热立

7、克次体DXA提取的模板(活菌培养工作在生物安全III级实验室进行)。1.2.2PET-30a-0mpB原核表达载体的构建1.2.2OmpB重组蛋白的诱导与表达1.2.3.1复苏菌种按1:1000比率分别将氨苄青霉素、重组菌种加入种子液屮，置于摇床上(37°C,220r/min)过夜；向每瓶液态培养基中加入10ml菌液之后，置于摇床上(37°C、220r/min),培养2h后至光密度(opticaldensity,0D)值约0.8。1.2.3.2诱导表达与鉴定待培养基0D值约0.8之后，取出锥形瓶加入500u1异丙基-P_

8、d-硫代半乳糖苷诱导剂后置于摇床上(32°C,220r/min),诱导5h后将培养液倒入离心管屮，6500r/min离心15min，取出沉淀，将装有重悬液的烧杯置于超声破碎机中，破碎后取出备用(每次3个循环，每个循环6min,共3次)。取出破碎后的溶液，12000r/min离心15min,留取沉淀及部分上清液备用。利