半滑舌鳎星形胶质细胞系的建立与鉴定

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1、半滑舌鳎星形胶质细胞系的建立与鉴定鱼类细胞培养始于20世纪60年代。自从1962年，g2+后使细胞间连接松散，铁壁细胞经吹打即可分散，但是缺点是该方法分散细胞效果较差，通常还需要与酶消化液联合使用。酶消化法是目前最为常用的方法，可用于绝大多数组织器官的消化培养，根据其解离组织的程度不同，可将其分成两种：一类是完全消化法，是通过酶消化辅以机械吹打的手段，将组织块最大限度的分散为单个细胞来培养；一类是不完全消化法，即酶作用时间较短，将组织块消化为小组织块和游离细胞的混合产物来进行培养。最常用的组织消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶。

2、这几种酶可单独使用，也可联合使用。常采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化，胰蛋白酶的常用浓度为0.25%-0.5%。胶原酶常用于内含较多结缔组织或胶原成分的较硬的组织的消化。胰蛋白酶消化法可以根据酶消化温度的不同分为冷消化法和热消化法。冷消化法是将组织剪成约2mm3大小的组织块，置于5～10倍体积的胰酶中低温4℃消化过夜；热消化法中酶的作用温度通常是15～20℃，作用时间30～60min。将组织分离进行原代培养是细胞培养的第一步也是最重要的阶段。悬浮培养的对象主要是淋巴细胞及部分肿瘤细胞。在鱼类细胞培养中，合适的培养基也是决定培养工作成功与

3、否的重要因素，不同鱼类，以及相同鱼类不同组织，适合其生长的培养基也不尽相同。鱼类细胞系常用典型培养基为MEM(Eagle’sMinimumEssentialMedium)，L-15(LeiboL-15)或M199(Medium199)，添加剂为10-20%胎牛血清，HEPES或碳酸氢盐缓冲液。血清能有助于细胞贴壁，能促进细胞生长，是细胞培养中不可缺少的营养成分，细胞初始培养时常用血清浓度为10～20%，继代培养时培养基中血清含量可减少为5～10%。胎牛血清不仅能为细胞生长提供营养补充，促进细胞贴壁，还能保护细胞免受重金属，蛋白酶等物

4、质的损伤。根据需要，有的时候可以添加鱼血清或组织提取物与胎牛血清配合使用，需要注意的是同种鱼的血清对细胞有毒性。此外，应尽可能选用同一批号的胎牛血清，使用前应先置于56℃水浴锅中1h以杀灭支原体，防止支原体污染。鱼类细胞培养常用的盐溶液有磷酸缓冲溶液（PBS）、Hank，s液（HBSS）等。还会向培养液中添加一种或几种促进细胞分裂增殖的生长因子，常见有碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）和表皮生长因子(EGF)，其中bFGF具有强烈促进体外培养细胞增殖的作用，作用浓度一般为2-10ng∕ml。EGF能促进表皮细胞、成纤维细胞等多种细胞

5、的分裂增殖，其作用浓度一般为1-25ng∕ml。为了防止细胞培养过程中由于培养者操作不当引起的细菌交叉污染，还需向培养基中添加适量的抗生素。常用青霉素（100U∕ml）和链霉素（100ug∕ml）来防止细菌污染，两性霉素B(2ug∕ml)可用来防止真菌污染。原代细胞经过一段时间培养后汇聚成单层，然后就要进行传代培养。用来消化鱼类贴壁生长的细胞所用消化液为0.05%胰酶加0.02%EDTA，酶的作用温度一般为室温。传代细胞经过一段时间的生长，数量急剧上升，此事要做好细胞的保存工作，暂时不用的培养细胞可以用含有冷冻保护剂（二甲基亚砜或者

6、甘油）的培养基进行梯度降温冻存，最终保存于液氮中。原代培养物由多种不同类型细胞构成的，随着传代，生长过程中分裂慢或不分裂的细胞类型逐渐被筛除，不适应培养及成分的细胞也被筛除，生长分裂旺盛的细胞类型逐渐占优势，适应生长的细胞成为培养的主体。大部分细胞系在体外培养过程中存在有限时间段，即约传代50次后，将停止分裂生长而逐渐衰老死亡，这些类型细胞系称为有限细胞系，然而有些细胞系则能通过转化获得永生性，从而在体外长期生存，这些细胞系称为连续性细胞系或永生性细胞系1.2鱼类细胞培养历史及进展从20世纪60年代鱼类细胞培养起步至今，其研究范围从

7、建立细胞系，分离病毒发展到进行环境毒理评估，基因功能分析，免疫调控研究，RNA干扰，以及IPS技术等方面的研究，取得阶段性的进展。20世纪60年代到20世纪80年代，鱼类细胞系的建立工作开始起步。在欧美发达国家，一些淡水及溯河洄游鱼类，如鲑鳟鱼类的细胞系被建立。1962年，美国科学家alsberger建立了一个肌肉细胞系（FHM）[9]，此后，剑尾鱼胚胎细胞系Senidiamenidia），实验发现在不同温度条件下获得的雌雄鱼比例不一样，低温处理的后代中雌鱼偏多。罗非鱼的性别决定主要是由遗传决定的，但其受到环境因子影响时，雌雄后代性

8、别比例发生变化。高温处理尼罗罗非鱼群体，群体中雄鱼比例显著升高，因为部分遗传雌性罗非鱼性反转成为雄性。高温对罗非鱼雄性化的影响主要原因可能是高温干扰了正常雌鱼性别分化发育的过程，促使遗传雌鱼反转为生理雄性；高温还可能参与了雄性化激素的