新生儿耳聋基因的检测研究

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1、新生儿耳聋基因的检测研究　　上世纪80年代，北京、上海、广州率先开展新生儿两病筛查（先天性甲状腺功能减低症和苯丙酮尿症），后逐步推广到全国各地，新生儿疾病筛查逐步成为出生缺陷三级预防的重要手段。随着现代医学的发展，诊疗技术的提高，筛查的病种越来越多，医务人员对新生儿耳聋基因检测的认识也在逐步提高。我院在家长知情同意的情况下对2014-01-2015-03出生的9421例新生儿进行耳聋基因检测，现报告如下。　　1资料与方法　　1.1临床资料　　2014-01-2015-03在石家庄市妇幼保健院出生的9421例新生儿，其中男1例，女4528例。　　1.2方法　　新生儿出生

2、3d后采足跟血3滴，滴到专用滤纸片上自然晾干，每个血斑直径不得小于8mm.检测位点：所有新生儿均检测GJB2基因2位点（235delC和299-300delAT）、SLC26A4基因2位点（IVS7-2A>G和2168A>G）和线粒体12SrRNA基因2位点（1555A>G和1494C>T）。基因组DNA的提取：　　①待滤纸片上血滴晾干后，用打孔钳打下3mm血片放入1.5ml无菌离心管中。　　②离心管中加入500μl灭菌双蒸水，振荡混匀后静置5min,12000r/min离心1min.　　③吸弃上清，重复操作②1次。　　④吸弃上清，加入D

3、NA提取液200μl,100℃水浴8min.　　⑤12000r/min离心5min,上清为DNA扩增模板。　　1.3荧光PCR基因检测　　应用济南英盛先天性耳聋基因检测试剂盒、迟发性耳聋基因检测试剂盒和药物性耳聋基因检测试剂盒，每个反应孔加入23μl相应检测位点反应液，2μl上述DNA扩增模板，于ABI7300荧光定量PCR仪上进行反应。反应条件：50℃2min,95℃2min,40循环95℃10s~61℃33s.　　1.4结果判读　　　　根据试验调节基线和阈值，Ct值<35视为有效扩增，在此基础上观察实时荧光曲线判读结果：FAM通道曲线呈S型

4、增长判为野生型，HEX通道曲线呈S型增长判为纯合突变型，2条曲线同时呈S型增长判为杂合突变型，2条曲线同时不增长视为无效样本。　　2结果　　9421例新生儿中共发现突变携带者384例（男205例，女179例），6位点携带率为4.08%.其中158例（1.68%）携带235delC杂合突变，1例（0.01%）携带235delC纯合突变，55例（0.58%）携带299-300delAT杂合突变；133例（1.41%）携带IVS7-2A>G杂合突变，1例（0.01%）携带IVS7-2A>G纯合突变，19例（0.20%）携带2168A>G杂合突变；14例（0

5、.15%）携带1555A>G均质突变，3例（0.03%）携带1555A>G异质突变。其中1例（0.01%）同时携带有235delC杂合突变，IVS7-2A>G杂合突变和1555A>G异质突变，1例（0.01%）同时携带有235delC杂合突变，IVS7-2A>G杂合突变。　　本研究中235delC位点杂合突变的新生儿中有1例右耳中耳炎伴有腭裂且右耳听力筛查未通过，经治疗康复后于3月龄时进行听力诊断为单侧中度耳聋；1例携带有235delC纯合突变的新生儿左耳未通过听力筛查；1例携带有IVS7-2A>G纯合突变的新生儿未通过听力筛查，于

6、3月龄时进行听力诊断，CT结果示右耳前庭水管扩张，耳蜗发育不全；1例同时携带有235delC杂合突变、IVS7-2A>G杂合突变和1555A>G异质突变的新生儿和1例同时携带有235delC杂合突变、IVS7-2A>G杂合突变的新生儿均通过了听力筛查，并于6月龄回访时听力正常。见表1.耳聋基因突变者不论杂合突变还是纯合突变全部进行Sanger法基因测序验证，结果全部符合，部分测序图谱见图1.各突变位点占突变总数比例见表2.石家庄市耳聋基因热点位点突变率情况与周怡等〔1〕报道的北京市15343例耳聋基因突变率比较，差异有统计学意义（P<0.01）

7、.　　3讨论　　3.1石家庄市新生儿耳聋基因检测的必要性　　9421例新生儿血片样本中共检出耳聋基因突变者384例，六位点携带率为4.08%,其中GJB2基因杂合或纯合突变214例（携带率为2.27%）,SLC26A4基因杂合或纯合突变153例（携带率1.62%），线粒体12SrRNA基因均质或异质突变17例（携带率0.18%）。与周怡等〔1〕报道的北京市数据比较，发现石家庄市GJB2基因和SLC26A4基因的突变携带率高于北京市，mtDNA12SrRNA基因低于北京市；GJB2基因235delC位点、GJB2基因299-300delAT位点和SLC