呆聪液对痴呆大鼠模型脑内β淀粉样前体蛋白基因表达的影响

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1、呆聪液对痴呆大鼠模型脑内β淀粉样前体蛋白基因表达的影响【摘要】目的探讨呆聪液对痴呆大鼠模型脑内β淀粉样前体蛋白(βAPP)基因表达的影响。方法22月龄SD大鼠采用海人酸破坏脑基底核法造成学习和记忆功能障碍的痴呆动物模型。造模后的大鼠随机分为痴呆模型组、呆聪液(低、中、高剂量)组，同时设正常对照组，每组10只。呆聪液低、中、高剂量组每日呆聪液灌胃(低5g/kg、中10g/kg、高20g/kg)，痴呆模型组和正常对照组每天用生理盐水(10ml/kg)灌胃，共1个月。通过水迷宫法和反转录聚合酶链反应观察呆聪液对痴呆模型大鼠学习记忆能力和脑内βAPP基因表达的影响。结果老龄痴呆模

2、型大鼠学习记忆能力下降，脑内βAPP基因表达增强。呆聪液高、中、低剂量组能明显提高学习记忆能力，降低脑内βAPPmRNA含量，并有一定的量效关系，与痴呆模型组比较差异有显著性(P<0.05)。结论呆聪液能改善老龄痴呆大鼠的学习和记忆功能，下调βAPP基因的表达。【关键词】呆聪液;海人酸;动物痴呆模型;β淀粉样前体蛋白;基因表达研究表明，老年痴呆患者都有脑底动脉硬化、海马区额叶老年斑及神经元纤维缠结的病理变化。中枢meynert基底核神经元缺失伴胆碱能神经元功能障碍，海马区胆碱乙酰转移酶活性降低，可出现不同程度的脑萎缩。因此，中枢胆碱能神经功能障碍与痴呆程度密切相关。

3、为进一步阐明呆聪液治疗老年痴呆的作用机制，本文在研究呆聪液对老龄鼠痴呆模型脑M受体及免疫功能影响的基础上〔1〕，探讨呆聪液对老龄鼠痴呆模型脑M受体基因及β淀粉样蛋白(Aβ)受体基因表达的影响。　　1材料与方法　　1.1动物选用22月龄SD大鼠50只，体重250～300g，雌雄兼用，由山东大学医学院动物试验中心提供。　　1.2方法　　1.2.1药物、试剂与仪器呆聪液主要为人参、生地、知母、黄芪等组成，按中药水提液的制备工艺加工制成，每毫升含生药1g，由潍坊医学院附属医院药剂科配制加工而成;海人酸由潍坊医学院生理教研室李秀艳教授馈赠;3%戊巴比妥钠、乙醚、75%酒精、3%戊二醛、1

4、%锇酸等。江湾Ⅱ型立体定位仪，PCR仪(美国)，凝胶成像分析系统(美国FOTODYNE公司)，电泳仪(美国)。　　1.2.2模型制备将SD大鼠先用3%戊巴比妥钠腹腔内麻醉，然后固定于江湾Ⅱ型立体定位仪上，经消毒后正中矢状切口，按照文献〔2〕方法大鼠脑图谱于前颅前2mm中线旁开2.5mm处用自制打孔钻打开颅骨一小孔，固定移动装置，垂直进入微型注射针头7～8mm(即相当于基底核区)，轻轻注入1μg海人酸(1μg/μl)，静留针1～2min后，缓慢移动装置退针，先用石蜡粉溶化后封住颅骨开口，再在封口上撒适量青霉素和链霉素粉剂后缝合皮肤。　　1.2.3给药方法将造模后的大鼠随机分为痴呆模

5、型组、呆聪液低剂量组(5g/kg)、中剂量组(10g/kg)、高剂量组(20g/kg)，每组10只，同时设正常对照组。每日呆聪液各剂量组灌胃相应剂量呆聪液，痴呆模型组和正常对照组用生理盐水(10ml/kg)灌胃，1个月后取脑标本。　　1.2.4检测指标参照Trizol试剂说明书方法提取大鼠脑细胞总RNA，紫外分光光度法测定总RNA浓度，A260nm/A280nm为1.8～2.0，提取总RNA于-70℃保存。引物的设计与合成：β淀粉样前体蛋白(βAPP)mRNA，βactin通过Http://.ncbi.nlm.nih.gov获得cDNA序列，采用Primer5引物设计软件，

6、获得PCR引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。βAPP上游引物：(5′3′)AATCCTGCAGTACTGCCAAG,下游引物：(5′3′)TGGCAACAGTACTGCCAAG;βactin上游引物：(5′3′)CAACTTTACCTTGGCCACTACC，下游引物：(5′3′)TACGACTGCAAACACTCTACACC，产物150bp。RTPCR：用TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.3.0。取适量总RNA稀释至160μg/ml，65℃变性3min后，配置反转录反应液：MgCl22μl，10×RTBuffer1μl，RnaseFreedH2

7、O3.75μl，dNTPMixture1μl，RnaseInhibitor0.25μl，AMVReverseTranscriptase0.5μl，Random9mers0.5μl，RNA1μl。30℃反应10min，42℃反应30min，99℃反应5min，5℃反应5min;PCR反应液组成：5×PCRBuffer10μl，灭菌蒸馏水28.75μl，TaKaRaExTaQTMHS0.25μl，上游特异性PCR引物0.5μl，下游特异性PCR引物0.5μl，反转录反应液10μl，总