敌敌畏纳米乳剂和普通乳油的施药周期对德国小蠊抗性相关酶活性抑制作用的对比研究

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1、敌敌畏纳米乳剂和普通乳油的施药周期对德国小蠊抗性相关酶活性抑制作用的对比研究【关键词】敌敌畏纳米乳剂普通乳油施药周期德国小蠊抗性相关酶目前已知道敌敌畏(DDVP)纳米乳剂与乳油的施药量对德国小蠊(GermanCockroaches)乙酰胆碱酯酶(AchE)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和碱性磷酸酯酶(ApE)活性的影响不同。德国小蠊酶活性改变不但与杀虫剂的种类和施药浓度有关，还与杀虫剂施药周期长短有关［1-2］。因此，有必要对敌敌畏纳米乳剂与乳油的施药周期对德国小蠊相关酶活性的影响做一对比性研究，以便了解敌敌畏纳米

2、乳剂杀灭德国小蠊的作用机理与乳油是否相同，进一步探讨敌敌畏纳米乳剂的毒性作用。本实验旨在通过微量点滴法，观察敌敌畏纳米乳剂、乳油的施药周期对德国小蠊相关酶活性的影响，进一步探索敌敌畏纳米乳剂对德国小蠊的毒作用机理。　　1材料与方法　　1.1试剂TritonX-100：上海化学试剂厂产品；碘化硫代乙酰胆碱、5，5′-二硫双硝基苯甲酸(DTNB)：Sigma公司产品；a-乙酸萘酯(1-NA)、1-萘酚：上海试剂一厂产品；对硝基苯磷酸二钠、固蓝B盐、考马斯亮蓝：Fluka公司产品；80%敌敌畏原油：南京电化厂产品；DDVP

3、纳米乳剂：本试验室自行研制，乳液呈浅黄色，透明、均匀、不分层，乳油粒径约为(11.2±1.9)nm，稀释10000倍后其粒径范围为76～103nm。原液理化性质稳定，(-20±2)℃和(52±2)℃下储藏14d，室温下放置2个月均未发生浑浊，稀释液使用时现配；其它试剂均为国产分析纯或化学纯。　　1.2供试虫源及施药方法德国小蠊由江苏省疾病预防控制中心昆虫饲养室提供。选用羽化后的健康成年雄虫，采用微量点滴法施药(死亡率为0或低于5%)。以微量点滴器将1μL(0.0001%)量点滴在试虫胸腹背板上，点滴后将试虫放入洁净果

4、酱瓶中，正常饲养。用不施加任何药物的德国小蠊作对照，不同施药浓度的德国小蠊作为实验组。　　1.3酶活性的测定　　1.3.1酶源制备　　(1)AchE酶源制备：将待匀浆的德国小蠊用流动的蒸馏水冲洗，在滤纸上吸干后，取头部，加1/15mol/L(pH8.0)含有0.5%的TritonX-100的磷酸盐缓冲液冰浴匀浆，然后再以4000r/min离心15min，取上清液作酶源。　　(2)1-NA酶源的制备：待匀浆德国小蠊用流动蒸馏水冲洗，以滤纸吸干，4℃下解剖，去消化道中食物，取中肠制备酶源。于磷酸盐缓冲液(pH7.0，0.

5、04mol/L)中冰浴匀浆，在3000r/min离心10min后，取上清液作酶源。　　(3)ApE酶源制备：取中肠，pH4.6醋酸缓冲液(0.1mol/L)中冰浴匀浆，8000r/min离心15min后，取上清液做酶源。　　1.3.2酶活性的测定　　(1)AchE活性的测定：按Groun改进的Ellman方法［3］，反应体系终体积0.2mL，10μL的1/15mol/LpH8.0的磷酸盐缓冲液，50μL的0.75mmol/L底物(碘化硫代乙酰胆碱)，50μL酶源(调整蛋白含量在40～80μg/mL)，30℃反应15m

6、in，加入1.8mLDTNB-磷酸盐-乙醇试剂，412nm波长下进行比色测定。　　(2)1-NA酶活性测定：参照Michael和杨俭美报道的方法［4-5］，3.6mL1-乙酸萘酯(3×104mol/L)加100μL酶液后，加0.9mL磷酸盐缓冲液(pH7.0)，30℃反应15min后，加1mLDBLS试剂(1%固蓝B盐水溶液与5%十二烷基硫酸钠水溶液，使用前以2∶5混合)，15min后在波长600nm处测定光密度，用1-萘酚制备标准曲线，定量反应产物的量。　　(3)ApE活性测定：以对硝基苯磷酸二钠作为底物，配制成0

7、.75×10-2mol/L水溶液。测定酸性磷酸酯酶活性的反应混合物为：2.3mLpH4.6醋酸缓冲液(0.1mmol/L)、0.5mL底物和200μL酶液。在37℃保温30min后，用2mLNaOH(0.1mol/L)终止反应，400nm处用热灭活后酶液作对照测定OD值，对硝基酚制备标准曲线［6］。　　1.3.3蛋白浓度的测定按Bradford方法［7］，取0.1mL酶液，加入5mL考马斯亮蓝，595nm处测OD值，在标准曲线上查得其对应的蛋白浓度。　　1.3.4数据处理用SAS9.0软件进行重复测量资料的轮廓分析。

8、　　2结果　　2.1两种DDVP乳液对德国小蠊AchE的影响对比(表1)　　表1DDVP纳米乳剂和乳油的施药周期对德国小蠊AchE活性的影响（略）　　随着施药周期延长，DDVP纳米乳剂组的AchE活性随施药时间延长呈波动性抑制趋势，至施药后第18天AchE活性仍表现为降低趋势；而乳油组的AchE活性在第3天时受到最大抑制，而后酶活性开始逐渐恢复