sirna对sgc7901-vcr细胞mdr1基因沉默效果的影响因素分析

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1、siRNA对SGC7901/VCR细胞mdr1基因沉默效果的影响因素分析【摘要】目的分析siRNA沉默人胃癌SGC7901/VCR细胞mdr1基因效果的相关因素。方法设计并体外转录合成4条靶向mdr1的siRNA(mdr1si326、mdr1si1513、mdr1si2631和mdr1si3071),转染SGC7901/VCR细胞，用RTPCR和免疫印迹检测mdr1mRNA和Pgp的表达、流式细胞仪检测细胞内阿霉素的蓄积和MTT法检测细胞对阿霉素的敏感性，综合这4方面结果评价4条siRNA的沉默效果情况；用分子生物学软分析siRNA沉默效果的

2、影响因素。结果沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631靶序列编码Pgp的跨膜区而且自身无茎和袢；沉默效果较差的mdr1si3071和最差的mdr1si1513靶序列编码Pgp的胞内区，前者自身成茎和成袢。沉默效果最好的mdr1si326和较好的mdr1si2631靶序列在靶位点和靶位点外间有较少的碱基配对和氢键。siRNA的沉默效果与siRNA3’5’端3个碱基中的A/U数量、N1和N19、GC含量间无规律可循。结论siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1的效果与靶序列的结构关系密切。【关键词】小分子干扰RNAmd

3、r1基因SGC7901/VCR细胞基因沉默效果siRNA设计　　0引言　　众多研究表明，靶向同一基因mRNA不同靶点的siRNA，封闭基因表达的效果明显不同[13]，判断不同靶点的siRNA沉默基因效果的手段是实验。本研究设计了以mdr1为靶标的4条siRNA，从其对人胃癌多药耐药SGC7901/VCR细胞mdr1的mRNA、Pgp表达、Pgp功能和对阿霉素耐药性逆转角度，综合评定各条siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1的效果，用分子生物学软件分析沉默效果的影响因素，以助于选择引发高效RNAi的siRNA靶序列。　　1材料和方法

4、　　1.1siRNA的设计和合成　　按Tuschl等的siRNA靶序列设计原则[4]，对GenBank中最新的mdr1cDNA全长序列（登录号NM_000927.3）设计并选定潜在靶点16个；结合潜在靶点的位置和结构等因素，选准4个靶序列，用T7RiboMAXTMExpressRNAiSystem(Promega)，体外转录合成siRNA，分别为mdr1si326、mdr1si1513、mdr1si2631和mdr1si3071。　　1.2siRNA沉默SGC7901/VCR细胞mdr1效果的检测　　培养人胃癌耐药SGC7901/VCR细胞（第四

5、军医大学西京医院消化病研究所樊代明教授惠赠）和其亲本SGC7901细胞（本研究室保存）于含10%灭活小牛血清的RPMI1640、37℃、5％CO2中。SGC7901/VCR的培养液中加入VCR0.5～1.0μg/ml，以维持其耐药表型，在实验前撤除VCR2周。用CodeBreakerTMsiRNA转染试剂（Promega），分别将siRNA以20nmol的终浓度转染SGC7901/VCR细胞，48h或72h后收获细胞进行检测，实验重复3次。数据以±s表示，用SPSS11.5进行统计学分析，组间比较采用配对t检验和方差分析，率的比较用行×列表的χ2

6、检验，水准α=0.05。实验分7组，(1)对照组：SGC7901/VCR细胞，PBS；(2)转染试剂组：转染试剂+PBS；(3)mdr1si326组：转染试剂+mdr1si326；(4)mdr1si1513组：mdr1si1513；(5)mdr1si2631组：mdr1si2631；(6)mdr1si3071组：mdr1si3071；(7)SGC7901组：SGC7901细胞，PBS。检测项目如下：　　1.2.1RTPCR用TRIzol试剂（GibcoBRL产品）按说明书提取转染24h后的细胞总RNA，紫外分光光度法测定RNA的纯度和浓度，电泳

7、判定RNA的完整性。取总RNA4.2μg，用上海生物工程公司的AMV第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA。用PRIME5.0设计mdr1（NM_000927）和β肌动蛋白(βactin，NM_001101)引物，由上海生物工程公司合成。mdr1引物上游序列为5′tgactaccaggctcgccaatgat3′，下游为5′tgtgccaccaagtaggctccaaa3′，扩增片段跨越3个内含子，产物457bp。βactin引物上游序列为5′tcctgtggcatccacgaaact3′，下游为5′gaagcatttgcggt

8、ggacgat3′，产物314bp。取5μlcDNA，用上海生物工程公司的PCR扩增试剂盒进行PCR，体系25μl。目的和内参引物同时