trbp及其截短体真核表达载体的构建与表达

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1、TRBP及其截短体真核表达载体的构建与表达：韩涛张勇孙书明,孟艳玲,李伟,郭张燕,杨安钢【摘要】目的:构建TRBP及其截短体真核表达载体,并检测其在HeLa细胞中的表达。方法:设计引物扩增TRBP全长及其截短体TAB、TAC、TBC基因序列,然后将各基因片段克隆入真核表达载体pFlagCMV4。用脂质体法转染HeLa细胞,经V4由本室保存,TaqDNA聚合酶、DNA限制性核酸内切酶、T4DNA连接酶购自TaKaRa公司、新生牛血清购自杭州四季青生物公司。RPMI1640及脂质体LipofectAMIM2000购自Invitrogen公司。小鼠抗Flag单克隆抗体(mAb)购自Sigma公司

2、。HRP标记山羊抗小鼠二抗购自中杉公司。1.2方法1.2.1引物设计根据TRBP的基因序列设计引物为X1(5′TTTGGTACCCACCATGAGTGAAGAGGAGCAAGGCTCCGGCACTACCACGGGCTGC3′),X2（5′TTTTCTAGAGTCGACTCACTTGCTGCCTGCCATGATCTT3′）,X6(5′TTTGGTACCGGGAGCATGCTGGAGCCG3′),X5(5′TTTTCTAGAATCCCGGGCATCCAGAGG3′),X8(5′GCCCTCAAACACCTCAAAGGGGTGCCTCTGGATGCCCGGGAT3′)和X9(5

3、′ATCCCGGGCATCCAGAGGCACCCCTTTGAGGTGTTTGAGGGC3′)。1.2.2RTPCR收集处于对数期生长的细胞,使用TRIzol试剂提取总RNA,使用SuperScriptTMFirstStrandSystemforRTPCR试剂盒进行反转录,操作均按说明书进行。获取基因组cDNA。1.2.3pCMVTRBP、pCMVTAB、pCMVTBC、pCMVTAC真核表达载体的构建以cDNA为模板,用X1和X2进行PCR,扩增出TRBP全长基因,分别用X1和X5,X6和X2,扩增出TAB段和TBC段,并分别用X1和X9,X8和X2,扩增出TAC段。用Ec

4、oRⅠ和XbaⅠ分别双酶切pCMV4与TRBP基因,用KpnⅠ和XbaⅠ分别双酶切pCMV4和TAB、TBC、TAC基因片段,胶回收,T4DNA连接酶连接,并转化E.coliDH5α菌株,挑克隆,提取质粒,酶切鉴定,鉴定正确的克隆由北京奥科公司测序,将测序正确的质粒命名为pCMVTRBP、pCMVTAB、pCMVTBC、pCMVTAC。1.2.4细胞转染于细胞转染前24h,用胰酶消化生长至对数期的细胞,置于细胞培养瓶中培养,待细胞达80%汇合率时进行转染。先用无血清RPMI1640洗2次,加500μL无血清RPMI1640,分别将8μgpCMVTRBP、pCMVTAB、pCMV

5、TBC、pCMVTAC和20μLLipofectAMIM2000分别加于500μL无血清RPMI1640中,轻轻振摇混匀,制成转染液,室温静置20min后,将转染液加入细胞中,轻轻混合,置37℃孵育6h,弃去转染液,加含100mL/L新生牛血清的RPMI1640。于转染后48h后,收集细胞。1.2.5A转移1h至NC膜上。将NC膜在封闭液（30g/LBSAinTBS）中,在室温下缓慢摇动封闭1h。加入1∶1000的小鼠抗FlagmAb,4℃过夜。用TBST洗膜,5min×3次。加入1∶2000的HRP标记的山羊抗小鼠二抗,室温放置1h,TBST洗膜,5min×3次。加入发光液,暗室内压片,

6、显影,定影。2结果2.1TRBP及其各截短体结构TRBP全长366aa,属于dsRNA结合蛋白家族,具有3个dsRBD,分别为dsRBDA,dsRBDB和dsRBDC。位于dsRBD2内部的KR螺旋模序负责RNA结合,第3个结构域即C末端碱性结构域主要介导蛋白质间的相互作用。依据TRBP的结构基础,我们构建了TRBP及其截短体TAB,TBC和TAC真核表达载体（图1）。图1TRBP及其各截短体结构示意图2.2pCMVTRBP、pCMVTAB、pCMVTBC、pCMVTAC的克隆及鉴定以cDNA为模板,用引物X1和X2进行PCR,扩增出约为1100bp的片段,用引物X1和X5进行PC

7、R,扩增出约为700bp的片段,用引物X6和X2进行PCR,扩增出约为800bp的片段,并分别用X1和X9、X8和X2进行PCR,扩增出约为700bp的片段。（图2）,与预期大小一致,将约为1100bp的片段经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后,连接入经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切后的pCMV4载体中,其余3个片段经KpnⅠ和XbaⅠ分别双酶切后,连接到经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后的pCMV4载体中,分别用EcoRⅠ