实时定量逆转录聚合酶链反应检测大肠癌患者术前外周血 ck20 mrna和cea mrna的临床意义

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1、实时定量逆转录聚合酶链反应检测大肠癌患者术前外周血CK20mRNA和CEAmRNA的临床意义：周海茵，葛成华，王世伟，叶古祥，唐文贤，赵旭鸿，范珍妮【摘要】目的探讨大肠癌患者外周血CK20mRNA和CEAmRNA的表达及其临床意义。方法采用实时定量逆转录聚合酶链反应（QRT-PCR）技术，对68例大肠癌患者及30例健康志愿者（对照组）术前外周血CK20mRNA和CEAmRNA水平进行检测。结果在对照组中CK20mRNA和CEAmRNA均无表达，而在大肠癌组中CK20mRNA阳性表达率为45.6%，CEAmRNA阳性表达率为39.7

2、%，二者联合检测阳性率为55.9%，较单项检测阳性率高（P>0.05），二者的表达与性别、肿瘤部位和肿瘤分化程度无明显相关，与肿瘤临床分期、淋巴结转移和肝脏转移明显相关。结论CK20mRNA和CEAmRNA可作为大肠癌细胞血行播散的标志，联合检测有助于提高肿瘤微转移的检出率及判断预后。【关键词】大肠肿瘤；微转移；外周血［Abstract］ObjectiveToinvestigatetheexpressionofCK20mRNAandCEAmRNAinperipheralbloodofpatientsRNAandCEAmRNA

3、RNAandCEAmRNARNAamongcolorectalcancerpatientsRNAethods.TheexpressionofCK20mRNAandCEAmRNAorordifferentiationlevelofcancercells,butcorrelatedphnodesmetastasisandlivermetastasis.ConclusionCK20mRNAandCEAmRNAakerofblooddisseminationofcolorectalcancercellandthepositiverateo

4、fmicrometastasisbemayberaisedbybinationdetection.TheexpressionofCK20mRNAandCEAmRNAmayberegardedasareferenceindicator.［Keyicrometastasis;peripheralblood大肠癌是我国发病率较高的恶性肿瘤之一，其发病率呈逐年升高趋势，其术后复发及远处转移率达20%～45%［1］。因此早期检测出循环癌细胞对判断肿瘤复发和转移及指导临床综合治疗有重要意义［2］。1对象与方法1.1研究对象68例大肠癌患者选自

5、2007年1月～2008年3月在我院接受手术治疗并经病理确诊的患者，男39例，女29例，年龄26～88岁，中位年龄65岁。临床分期：Ⅰ期6例，Ⅱ期24例，Ⅲ期27例，Ⅳ期11例。肿瘤分化程度：高分化腺癌26例，中分化28例，低分化11例，未分化3例。对照组30例健康志愿者来自同期我院健康职工。1.2仪器与试剂定量PCR仪（美国生物应用公司ABI7500），Trizol试剂（上海闪晶分子生物科技公司），CK20mRNA和CEAmRNAPCR试剂盒（上海达为科生物科技公司）。1.3RNA提取采集对照组及大肠癌组患者术前肘静脉血5ml（

6、草酸钾抗凝），1h内用淋巴细胞分离液分离有核细胞，将分离的有核细胞收集到1.5ml离心管中，12000rpm离心5min,弃上清，在沉淀中加入Trizol500μl,混匀置室温10min，加入氯仿200μl混匀，4℃10000rpm离心5min，吸取上层水相于1.5ml离心管中，并加入2倍体积预冷异丙醇混匀，置-20℃冰箱20min，4℃10000rpm离心10min（以沉淀RNA）。弃上清，用预冷75%酒精（DEPC处理水配制）500μl漂洗一次，4℃10000rpm离心10min，弃上清，留沉淀，充分吸尽残留液，65℃干式恒温

7、器，干燥10min，20μlDEPC处理水融解RNA,-80℃保持待用。1.4逆转录反应制备cDNA标本处理后的RNA70℃预变性5min，迅速置于冰浴以防RNA复性，反应体系的配制方法：RT反应液18μl，M-MLV逆转录酶1μl，RNasin1μl加入离心管中混匀，在每个反应管中加入20μl上述反应液，加入预变性的RNA5μl，37℃水浴60min，95℃预变性5min，以灭活M-MLV逆转录酶。1.5PCR扩增反应每管取PCR反应液43μl，Taq酶2μl加入总无菌离心管中混匀，每个反应管中加入45μl上述反应液，加入RT反

8、应液5μl，95℃预变性5min，95℃变性15s，60℃退火30s，60℃延伸30s，共40个循环，最后72℃延伸10min；根据所获得的标准曲线得到各检测标本的浓度（copies/ml）。1.6结果判断以RNA浓度≥1.0×103copies/