实验一 碱变性法抽提质粒dna

《实验一 碱变性法抽提质粒dna》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、梁晓红王晓燕山东大学医学院免疫学研究所2011-6医学分子生物学实验基因克隆实验技术部分共100分实验设计60%考勤+实验报告40%实验设计（3000~4000字）：选题：结合自己的专业，利用基因工程技术内容：1）立题依据；2）原理；3）实验材料；4）实验方法；5）预期结果；6）参考文献（＞3篇）评分标准：1）项目完整35分；2）创新性15分；3）可行性5分；4）合理性5分。注意事项1.分组（4人/组）2.隔离衣3.离心机、移液器等使用Restrictionenzymes:选（分）切接转→筛→扩重组

2、DNA技术的基本过程总体实验安排上午下午1碱变性抽提质粒DNA核酸浓度和纯度分析核酸电泳及分子量测定质粒DNA的酶切2感受态细胞的制备质粒DNA的酶切产物电泳试剂盒回收DNA目的基因与载体的连接3重组子筛选、鉴定方法蓝白斑筛选真核基因组DNA抽提1连接子的转化真核基因组DNA抽提24菌落的PCR鉴定PCR产物的电泳实验一碱变性法抽提质粒DNA质　粒（plasmid）质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中。质粒主要发现于细菌、放

3、线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力,能在子代细胞中保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子。（1）质粒在细胞内的复制一般有两种类型:严紧控制型(Strengentcontrol)：复制受宿主细胞的严格调控，拷贝数低；松驰控制型(Relaxedcontrol)：复制不受宿主细胞的调控，拷贝数高,适用于基因工程中做载体。分离质粒DNA的方法碱变性法；煮沸法；SDS法；羟基磷灰石层析法等一、实

4、验目的通过本实验掌握碱变性法提取质粒DNA。二、实验原理在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入pH4.8的NaAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA不能恢复，形成网状结构，通过离心可以把变性的染色体DNA和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。质粒DNA细菌染色体DNA分子量小分子量大超螺旋线性双螺旋三、实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速离心机5

5、.微量取液器（二）材料大肠杆菌JM109（pBR322-HBV）（三）试剂1.LB培养基2.LA培养基（LB+Amp）HBV片段pBR322-HBV四、实验步骤甘油保存的菌种JM109-PBR322-HBV,涂布于LA琼脂平板37℃，培养过夜挑取单克隆于2mlLA液体培养基中37℃，220rpm振荡培养过夜取1.4ml菌液入1.5ml的EP管中12000rpm、离心30s，弃上清重复上述步骤一次100ul溶液I悬浮菌体（充分振荡)加入200uL溶液II,颠倒混匀5次（轻柔），冰浴3～5

6、min。(出现拉丝现象)加入150μl溶液III，温和混匀10s，冰上放置3～5min。(云雾状沉淀)12000rpm离心5min，取上清到一新Ep管(约440μl)上清加等体积氯仿/异戊醇（24/1），颠倒混匀2min，12000rpm离心5min。(分离蛋白质及核酸，氯仿可使蛋白质变性，异戊醇防止发泡)取上清(约400μl)至新Ep管中。加入2倍体积100%冰乙醇,混匀，室温放置5min。12000rpm离心5min。(沉淀质粒DNA)弃上清，加入70％乙醇1ml，颠倒漂洗（保持沉

7、淀在管底），12000rpm离心3min。(清除残余离子)弃上清，将Eppendorf管于吸水纸上倒置1min，室温放置5min加40μlTE（pH8.0，含无DNA酶的RNA酶20μg/ml），溶解DNA，短暂混匀，室温放置30min以消化RNA。取10μl进行电泳，其余放置用于内切酶酶切实验，或-20℃贮存。注意事项碱变性的时间严格控制酸中和的时间可以适当延长离心取上清时，不要吸取中间的蛋白层漂洗沉淀时不要将沉淀冲掉溶液Ⅰ50mmol/L葡萄糖;25mmol/LTris-Cl(pH8.0)

8、;10mmol/LEDTA(pH8.0)(主要作用：SolutionI中的EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。加入solutionⅠ后一定要充分打散菌体。)溶液Ⅱ(pH12.6)0.2mol/LNaOH;1%SDS(现用现配)(主要作用：细胞壁肽聚糖碱性下水解，核酸和蛋白质变性.SolutionII要新鲜配置,NaOH可吸收空气中的二氧化碳而减弱碱性。加入solutionII后放置时间不要超过5min，以免变性