DB53∕T 447.4-2022 云岭牛 第4部分：胚胎移植(云南省)

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ICS65.020.30CCSB43DB53云南省地方标准DB53/T447.4—2022DB53/T447.4-2012云岭牛第4部分：胚胎移植

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2DB53/T447.4—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件为DB53/T447—2022《云岭牛》的第4部分。DB53/T447已经发布了以下部分：——第1部分：品种；——第2部分：养殖场建设规范；——第3部分：人工授精；——第4部分：胚胎移植；——第5部分：体外胚胎生产；——第6部分：饲养管理；——第7部分：饲草加工与调制技术；——第8部分：育肥技术；——第9部分：疫病防治；——第10部分：档案管理；——第11部分：胴体生产、评定及分割技术。本文件代替DB53/T447.4-2012《BMY牛第4部分：胚胎移植技术规范》，与DB53/T447.4-2012相比，除结构调整和编辑性改动以外，主要技术变化如下：a)更改标准名称为“云岭牛；b)更改全文“BMY牛”为“云岭牛”；c)“术语”中增加了英文名称，更改了3.5表述（见第3章）；d)更改了“胚胎移植的基本原则”中部分表述（见4.2）；e)更改了“供体牛饲养管理”中部分表述（见5.2.3）；f)更改了“超排方法”中部分表述（见6.1.2.1、6.1.2.3）；g)更改了“冲胚液的配制”中部分表述（见7.2.3）；h)更改了“冲胚步骤”中部分表述（见7.2.4.4）；i)更改了“检胚”表述顺序（见8.1）；j)更改了“胚胎的质量鉴定”中部分表述（见8.2.1.1、8.2.1.2、8.2.1.3）；k)更改了“胚胎解冻”中部分表述，并将细管装枪及移植部分内容并入10.5.4（见9.2、10.5.4.1、10.5.4.2）。本文件由云南省草地动物科学研究院提出。本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。本文件起草单位：云南省草地动物科学研究院。本文件主要起草人：黄必志、和占星、王安奎、金显栋、张继才、刘建勇、王喆、黄梅芬、亐开兴、杨世平、赵刚、袁希平、杨凯、李乔仙、杨寿军。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：——2012年首次发布；——本次为第一次修订。I

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4DB53/T447.4—2022引言DB53/T447-2022《云岭牛》是以2014年12月国家审定新品种“云岭牛”为载体制定的综合养殖标准，旨在从品种、养殖场建设、繁殖、管理、饲草加工调制、育肥、疫病、档案和胴体评定分割等方面指导和规范云岭牛的养殖，带动云岭牛规范化、标准化、产业化发展的同时，可提高养殖场（户）养殖水平和养殖效益，促进云南肉牛产业高质量发展。DB53/T447-2022由十一个部分构成。——第1部分：品种。目的在于确立云岭牛特征和特性、生产性能、种牛等级和良种登记，适用于云岭牛品种鉴定和种牛等级评定。——第2部分：养殖场建设规范。目的在于确立云岭牛选址、规划与布局、牛舍建设和辅助设施建设等技术要求。——第3部分：人工授精。目的在于确立云岭牛种公牛选择、母牛的初配年龄与发情鉴定、输精方法、母牛妊娠诊断等技术要求。——第4部分：胚胎移植。目的在于确立云岭牛快速扩繁受体牛同期发情、供体牛超数排卵与输精、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻保存与解冻、胚胎移植、受体牛妊娠诊断等技术要求。——第5部分：体外胚胎生产。目的在于确立云岭牛供体牛的选择与饲养管理、卵母细胞的获取、卵母细胞的检出与分级、卵母细胞的IVM、卵母细胞的IVF、受精卵的IVC等技术要求。——第6部分：饲养管理。目的在于确立云岭牛饲养管理的基本要求以及牛场卫生、各类牛的饲养管理等技术要求。——第7部分：饲草加工与调制技术。目的在于确立云岭牛养殖过程中青贮饲料、秸秆氨（碱）化饲料、青干草饲料的加工调制技术要求。——第8部分：育肥技术。目的在于确立云岭牛优质牛肉生产和雪花牛肉生产技术要求。——第9部分：疫病防治。目的在于确立云岭牛的生物安全、牛场消毒、疫病防治及无害化处理等技术要求。——第10部分：档案管理。目的在于确立云岭牛养殖过程中建档范围、内容及档案管理的技术要求。——第11部分：胴体生产、评定及分割技术。目的在于确立云岭牛胴体生产、评定、分割以及分割肉包装等技术要求。DB53/T447-2022包含的十一部分内容均是符合生产实际需要，涵盖了生产环节中的品种、养殖场建设、繁殖、饲养管理、饲草加工调制、育肥、疫病防治、档案管理和胴体生产、评定及分割多方面技术。该标准可规范云岭牛从养殖场到牛肉产品的全系列生产技术，充分发挥云岭牛生产性能，提高养殖水平，促进规模化标准化养殖的构建和肉牛产业的发展。III

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6DB53/T447.4—2022云岭牛第4部分：胚胎移植1范围本文件规定了胚胎移植的要求、供体牛的选择与饲养管理、供体牛的超排及输精、胚胎回收、胚胎质量鉴定、胚胎的冷冻保存与解冻、胚胎移植、受体牛的妊娠诊断等技术要求。本文件适用于云岭牛的超数排卵及胚胎移植（MOET）的各个环节。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4143牛冷冻精液DB53/T247.3肉牛养殖综合标准第3部分：繁殖技术DB53/T447.3云岭牛第3部分：人工授精3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1供体牛donor提供卵子和胚胎的优秀繁殖母牛。3.2受体牛recipient接受胚胎（移植）的母牛。3.3同期发情synchronousestrus使用外源激素来调控一群母牛的发情进程，使之在预定的时间内集中发情和排卵。3.4超数排卵（简称超排）superovulation在母牛发情周期的适当时间，使用外源性腺激素，诱导更多的卵泡正常发育，并多排卵。3.5胚胎冷冻保存embryocryopreservation按胚胎冷冻的原理和方法，对胚胎进行冷冻，并在液氮中长期保存。3.6胚胎移植embryotransfer将受精卵（胚胎）移植到受体母牛子宫角内。4胚胎移植的要求1

7DB53/T447.4—2022供体牛和受体牛应为同一属种，供体牛和受体牛的发情时间相差不应超过24h，且从供体牛输卵管内收集到的胚胎应移植到受体牛的输卵管内，从供体牛子宫角内收集到的胚胎应移植到受体牛的子宫角内。5供体牛的选择与饲养管理5.1供体牛的选择符合云岭牛的典型特征，系谱清楚，遗传性能稳定，种用价值高，健康、体质健壮、膘情中等。性周期正常，生殖机能好。年龄14月龄到10岁,体重280kg～600kg。经产母牛产后60天以上，生殖机能恢复正常。5.2供体牛的饲养管理保持环境卫生、避免各种应激、分群饲养、专人管理、加强蛋白营养、注重补充青绿饲料、优质青干草、维生素和微量元素，保持营养平衡。6供体牛的超排及输精6.1超排处理6.1.1超排激素

8DB53/T447.4—2022应符合GB4143的规定。6.4输精注射PG后48h采用直肠把握输精法进行第一次输精，间隔12h进行第二次输精，输精方法按DB53/T447.3的规定执行。在第一次输精时注射GnRH或其类似物50µg～100µg或在第一次输精时注射LH2000IU～3000IU。7胚胎回收（冲胚）7.1冲胚时间供体牛以超排发情后第一次输精当日为0天，在第（7±0.5）天，用非手术法回收胚胎。7.2冲胚前的准备7.2.1主要器材冲胚管及内芯、子宫颈扩张棒、子宫颈黏液吸除器、过滤式集卵（胚）杯、Y字型三通硅胶管，以及50mL注射器、20mL注射器、10mL注射器、5mL注射器、培养皿、量筒、毛剪、镊子等。7.2.2药剂新洁尔灭、2%利多卡因、0.9%生理盐水、酒精、青霉素、链霉素等。

9DB53/T447.4—2022b)关闭输入管开关，用直肠中的手将子宫角上扬并进行适度按摩，打开输出管开关，使回收液从输出管流到集收杯中；c)每侧子宫角冲洗6次～10次，每侧子宫角用250mL～300mL冲胚液，根据供体牛子宫角的大小，先少后多，逐渐增量；d)一侧子宫冲胚完毕后，用注射器筒接到冲胚管的注气口将气囊中的气体放出，抽出冲胚管；e)用同样的方法对另一侧子宫角冲胚；f)两侧子宫角冲胚完成后，冲胚管抽回至子宫体，灌注抗菌素（青霉素200万单位＋链霉素100万单位溶液20mL～50mL）或其它预防子宫炎的药物，同时，肌肉注射PG（氯前列烯醇0.4mg～0.6mg）；g)将回收液送回实验室或检胚室，用集卵漏斗过滤，保留10mL左右的液体，倒入培养皿中，供镜检。8胚胎质量鉴定8.1检胚8.1.1在实验室（检胚室）内20℃～25℃常温下，将盛有回收液的培养皿或集卵杯置于实体显微镜下按图1所示顺序检胚，重复3遍～4遍。图1检胚顺序8.1.2检出的胚胎及时移放到盛有含20%犊牛血清（CS）的PBS保存液或TCM-199培养液的培养皿中（同一头供体牛的胚胎放入同一培养皿中），并做好标记。8.1.3胚胎用PBS保存液或TCM-199培养液清洗3次～5次，然后进行胚胎质量鉴定。8.2胚胎的质量鉴定8.2.1形态学方法8.2.1.1观察在40倍～80倍的实体显微镜或倒置显微镜下观察所回收的胚胎受精与否、发育状态、形态轮廓、色泽、卵裂球的大小、均匀度、细胞密度、透明带间隔、变性程度以及胚胎本身的发育阶段是否与胚胎实际日龄相一致等。8.2.1.2发育期划分4

10DB53/T447.4—2022供体牛超排发情后第（7±1）天的胚胎发育期划分为以下6个时期：——早期桑椹胚（EarlyMorula，EM），卵裂球隐约可见，内细胞团基本占满卵周间隙；——致密桑椹胚（CompactMorula，CM），卵裂球进一步分裂变小，看不清卵裂球的界线，内细胞团致密收缩，占卵周间隙的60%～70%；——早期囊胚（EarlyBlastocyst，EB），出现透亮的囊胚腔，开始分为发暗的内细胞团和明亮的滋养层，但两层界线尚不明晰，细胞团占卵周间隙的70%～80%；——囊胚（Blastocyst，BL），囊胚腔增大明显，内细胞团和滋养层细胞界线清晰，细胞充满卵周间隙；——扩张囊胚（ExpandedBlastocyst，Exp），囊胚腔充分扩张，体积增至原来的1.2～1.5倍，透明带变薄，约为原厚度的1/3；——孵化囊胚（HatchedBlastocyst，Hed或HB），囊胚腔扩张到一定程度，透明带破裂，胚胎细胞团脱出透明带。8.2.1.3发育阶段供体牛排卵受精后不同时间的胚胎发育阶段见表1。表1供体牛排卵受精后不同时间的胚胎发育阶段时间0～11～22～33～44～55～66～77～88～10（天）胚胎形态致密发育16细早期桑早期囊扩张囊孵化囊1细胞2细胞4细胞8细胞桑葚囊胚阶段胞葚胚胚胚胚胚8.2.1.4胚胎质量等级胚胎质量划分为下列四个等级：——1级，即优质胚，胚胎发育阶段正常、形态完整、轮廓清晰、色泽正常、几乎无水泡样卵裂球，没有变性细胞；——2级，即良质胚，发育阶段正常、形态基本正常、完整、轮廓清楚，但有一部分突出细胞可见，变性部分占10%以下；——3级，即普通胚，发育阶段正常、突出的细胞或较明显不均匀，变性部分占10%～30%；——4级，即不良胚，细胞不均匀、变性细胞明显，变性部分占30%～50%；发育缓慢和未受精卵。8.2.1.5胚胎使用1级～3级为正常胚胎，其中1级～2级胚胎可供鲜胚移植和冻胚保存。3级胚胎需经培养，从形态判断存活力后决定是否移植或冷冻或舍弃。4级胚不能使用。8.2.2体外培养法将被鉴定的胚胎用TCM-199＋F1CS或TCM-199＋FCS＋β-ME（β-巯基乙醇）培养液，在5%CO2、95%空气、38.5℃、饱和湿度的培养箱中培养24h～48h，判断胚胎是否存活和活力。桑椹胚、早期囊胚以培养后的扩张囊胚率和孵化胚率来衡量胚胎的质量，扩张囊胚率和孵化率高表明胚胎质量好，形态正常的胚胎经培养后的孵化率应在70%以上。5

11DB53/T447.4—20229胚胎的冷冻保存及解冻9.1胚胎的冷冻保存9.1.1仪器、器材实体显微镜、胚胎冷冻仪、液氮罐、液氮、细管、封口仪、吸胚管、0.22µm过滤器、培养皿、记号笔等。9.1.2保存液与冷冻液含有20%犊牛血清(CS)的PBS液为保存液。用8%乙二醇（EG）＋0.1mol/L海藻糖（Tre.）＋m-PBS＋20%CS,用0.22µm滤器过滤灭菌分装为冷冻液。9.1.3胚胎装管胚胎先在保存液微滴中清洗4次，然后在冷冻液微滴中清洗4次。将胚胎吸入0.25mL细管内，用封口机封口、分类、标记，在4℃的冰箱内放置平衡10min～15min后放入冷冻仪。9.1.4胚胎冷冻保存胚胎冷冻仪温度降至-7℃，在-7℃保持2min后进行人工植冰，继续保持至10min，以0.3℃/min的速率降温至-30℃，在-30℃保持10min后，直接放入盛有液氮的液氮罐中保存，并定期检查和加液氮。

12DB53/T447.4—2022在受体牛发情周期的任意一天（除发情当日外），不论卵巢上有无黄体，先注射PGF2α或类似物一次(Lutalyse®或氯前列烯醇)，间隔11天～14天再用等量注射一次，在第二次注射PG后24h～96h内观察发情。10.3.2CIDR®（CUE-MATETM）＋PGF2α法TM在受体牛发情周期的任一天（除发情当日），无论卵巢上有无黄体，将CIDR®（CUE-MATE）孕酮阴道栓置入阴道内，以置栓之日为0天，在第7天一次性肌注PGF2α类似物（氯前列烯醇），第9天取出®TMCIDR（CUE-MATE），或在第8天撤栓的同时注射氯前列烯醇，第10天～12天（取栓后72h内）或第9天～10天观察发情。10.3.3EB+CIDR®（CUE-MATETM）＋PGF2α法TM在受体牛发情周期的任一天，将CIDR®（CUE-MATE）置入阴道内，同时肌肉注射EB（EstradiolBenzoate，EB，苯甲酸雌二醇)。第8天撤栓,同时肌注氯前列烯醇；第9天再次注射EB，不观察发情，在第16天～17天检查黄体状况。10.3.4GnRH+PGF2α法对受体牛不作黄体检查，第1天注射GnRH或类似物（Fertagy）或促排3号（LHRH-A3），第7天肌注PGF（Lutalyse®或氯前列烯醇），第9天再次肌注同等量的GnRH。不观察发情，在第16天检查黄体2αmn状况。10.4受体牛的发情鉴定

13DB53/T447.4—2022胚胎移植前一天或移植当天，对发情正常的受体牛进行直肠检查，根据黄体的大小、弹性、突出状况确定是否合格，只对黄体合格（A、B级）而且黄体所处的时期与胚龄一致的受体牛移植。云岭牛及其他品种受体牛胚胎移植时（发情第7±1天）的黄体级别判断参见附录C。10.5.4胚胎移植操作10.5.4.1细管装枪鲜胚装管或冻胚按9.2进行解冻，用消毒纸擦干细管，再用半干的酒精棉球擦拭细管表面，剪开细管封口端(如用细管塞封口的则拔出即可)，细管棉塞端装入移植枪中，套上灭菌的保护外套和保护膜。10.5.4.2胚胎移植受体牛保定好后清洗和消毒受体牛外阴部。用2%利多卡因进行硬膜外腔麻醉。采用非手术法把胚胎移植到黄体合格侧子宫角内。要求在解冻后10min内完成移植。10.5.5移植记录填写胚胎移植记录表，内容包括受体牛号、发情日期、黄体位置（左或右侧卵巢）、黄体级别（A、B、C级）、供体牛号以及移植日期、移植者、备注（如出血、子宫内膜炎和其它）等。11受体牛的妊娠诊断受体牛胚胎移植后第25天～30天，用B超作早期妊娠诊断，第60天～80天用直肠检查，确定妊娠与否。诊断方法按DB53/T447.3的规定执行。8

14DB53/T447.4—2022附录A（规范性）杜氏磷酸缓冲液配方表杜氏磷酸缓冲液配方见表A.1。表A.1杜氏磷酸缓冲液配方表试剂名称量NaCl8.00gKCl0.20gNa2HPO4（Na2HPO4∙12H2）1.15(2.16）gKH2PO40.20gCaCl2（CaCl2∙2H2O）0.10(0.132）gMgCl2（MgCl2∙6H2O）0.1(0.2133）g丙酮酸钠0.36g葡萄糖（葡萄糖∙H2O）1.00(1.10）g青霉素0.075g链霉素0.05g酚红0.005g超纯净水1L9

15DB53/T447.4—2022附录B（规范性）受体牛选择受体牛选择见表B.1。表B.1受体牛选择牛品种受体选择标准健康，年龄2～8岁，胎次1～6；体格较大，膘情中等，体重300kg以上；空怀或产后60天以上，性云岭牛周期正常，发情表现良好；泌乳性能好。健康，年龄1.5岁～8岁，胎次0～5；体格较大，膘情中等，体重350kg以上；空怀或产后90天以奶牛上，性周期正常，发情表现良好。纯种肉牛健康，年龄2岁～8岁，胎次1～6；体格较大，膘情中等，体重30mm0kg以上；空怀或产后60天以上，或杂交牛性周期正常，发情表现良好；泌乳性能好。健康，年龄3岁～8岁，胎次1～5；体格较大，膘情中上，体重250kg以上；空怀或产后60天以上，云南黄牛性周期正常，发情表现良好；后躯发育良好，泌乳性能好。注屡配不孕惯性流产或难产肢体疾病过或过瘦的不能作为受体

16DB53/T447.4—2022附录C（规范性）受体牛发情第（7±1）天黄体选择受体牛发情第（7±1）天黄体选择见表C.1。表C.1受体牛发情第（7±1）天黄体选择牛品种黄体判定参考标准A级：黄体明显突出卵巢表面，顶部有冠状开口，直径约1.5cm，弹性好。B级：黄体突出卵巢表面，直径约1.0cm，弹性适中。云岭牛C级：黄体突出不明显，直径＜1.0cm，硬、弹性差；直径＞1.0cm，但突出不明显或不突出，质地过软，弹性差。A级：黄体明显突出卵巢表面，顶部有冠状开口（呈火山口样），直径约2.0cm，弹性好。B级：黄体突出卵巢表面，直径约1.5cm，弹性适中。奶牛C级：黄体不突出，直径＜1.0cm，硬、弹性差；直径＞1.0cm，但突出不明显或不突出，质地过软，弹性差。

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