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时间:2018-05-09
《病原菌的分离、纯化和保存》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、实验十七、病原菌的分离培养、纯化和保存一、目的要求 (1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。 (3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。 二、基本原理 植物病原菌的分离培养,是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养,一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同,而供给它们适宜的生活条件,即让病原菌生活在适宜的培养基上,或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长,而抑制其他菌生长的环境,从而得到纯菌株。 植物病原
2、真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法,而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用,在有些情况下也采用稀释分离法。 为了获得分离菌的纯培养,必须要进行分离菌的纯化,纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。 三、材料、仪器与用具 1.材料(依当地情况进行选择,下列材料供参考) (1)稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyriculariaorycae)。 (2)玉米大斑病叶(Exserohilumturcicum)。 (3)玉米弯孢菌叶斑
3、病叶(Curvularialunata)。 (4)玉米小斑病叶(Bipolarismaydis)。 (5)番茄灰霉病果(BotrytiscineFca)。 (6)黄瓜菌核病果(Sclerotiniasclerotiorum)。 (7)黄瓜细菌性角斑病叶(Pseudomonassyringaepv.1achrymans)。 (8)水稻白叶枯病叶(Xanthomonascampestmspv.oryeue)。 (9)大豆细菌性斑点病叶(Pseudomonassyringaepv.glycinea)。 (10)白菜软腐病叶(Erud
4、niacarotovorasubsp.carotovora)。 2.培养基PDA培养基;肉膏蛋白胨培养基;加寄主组织煎汁的培养基等。 3.仪器与用品超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70%酒精、0.1%升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。0.1%升汞溶液配制:升汞1e浓盐酸2.5ml蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中,待充分溶解后,再加水稀释。升汞是剧毒药物,在操作时应特别小心。 四、实验操作 (一)病原真菌的分离 1.组织分离法按照以下
5、步骤进行: (1)取灭菌培养皿一个,置于湿纱布上,在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示:为了保证无菌操作,应注意下面几点:工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内,工作中临时去取容易带来杂菌;保证工作人员自身的洁净,工作前用肥皂洗手;无菌操作前还要用70%酒精擦拭双手;工作中,特别在使用无菌操作间时,呼吸要轻,不要说话。 (2)用无菌操作法向培养皿中加入25%乳酸1--2滴(可减少细菌污染),然后将融化而冷至60C左右的PDA培养基倒人培养皿中,每皿倒10--15ml,轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示:
6、加入25%乳酸1~2滴,可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外,在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长,也是常用的方法。加青霉素(20μg/ml)可以抑制G+细菌生长;加多黏霉素B(5.0μg/ml)可以抑制G—细菌生长;加链霉素(40μg/ml)或氯霉素(50μg/ml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外,其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45C左右(以手背触三角瓶感到烫,但尚可以忍耐为宜)’时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领,不必在火焰上方,一般很少污染。 (3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料
7、),选择典型的单个病斑,用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(海边长3--4mm)病组织数块。提示:选择新患病的组织作为分离的材料,可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生,因此,一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。 (4)将病组织放人70%酒精中浸3—5s后,按无菌操作法将病组织移人0.1%升汞液中分别表面消毒0.5、1、2、3、5rain(也可使用其他表面消毒剂),如植物组织柔嫩,则表面消毒时间宜短;反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次,除去残留的消毒剂。提示:先用70%的酒精浸2、
8、3s是为了消除寄主表面的气泡,减少表面张力,70%的酒精亦用于表面消毒,处理的时间较短(一般数秒至lmin)。升汞溶液消毒的时间因材料而异,可自30s至30min不等,一般情况下
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