人突变型低氧诱导因子1α对大鼠后肢缺血模型血管新生的影响论文

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1、人突变型低氧诱导因子1α对大鼠后肢缺血模型血管新生的影响论文【摘要】目的：探讨564与402双位点突变的HIF1α基因(AdHIF1α564Ala402Ala,简称AdH564/402）在大鼠下肢急性缺血模型中的表达及对血管新生的影响.方法：①将先期构建的AdH564/402在HEK293A细胞中进行扩增，用氯化铯浓度梯度离心法进行腺病毒纯化.用电子显微镜、PCR及测序的方法鉴定并用分光光度计法测定病毒滴度；②构建急性大鼠下肢缺血模型，随机分为4组，分别以AdLacZ,AdH0,AdH564/402和生理盐水（NS）转染术侧下肢骨骼肌，于转

2、染后1,3,5,7d，应用RTPCR测定骨骼肌中HIF1αmRNA的表达量；③基因转染后28d，选择性下肢动脉造影及血管铸型观察血管密度.结果：①经扩增、纯化后基因突变区信息保存完好，最终滴度达到（6.29±0.26）×1014OPU（opticalparticleunit,光学颗粒单位）/L.②突变体基因AdH564/402的相对表达量高于野生型HIF1α基因（P=0.000）；且以第7日最高（P=0.000）；经两两比较.freelRNA的表达.②外源性突变体AdH564/402基因可促进缺血骨骼肌的侧支血管形成及微血管新生.③突变体AdH56

3、4/402基因的生物学功能较野生型基因AdH0更强.【关键词】低氧诱导因子1血管生成逆转录聚合酶链反应动脉造影0引言人低氧诱导因子1(hypoxiainduciblefactor1,HIF1)是应答细胞氧张力变化的基因表达的重要调节因子［1］，由两个亚单位组成，即氧调节亚单位HIF1α和构成性表达的亚单位HIF1β［2］.HIF1α可调控下游60多种与血管生长、血管张力、糖代谢、红细胞生成及干细胞诱导分化等相关的基因，包括血管内皮生长因子(VEGF)及其受体（Flt1），神经纤毛蛋白1（Neuropilin1）,血管生成素(Ang)1,2

4、,4,血小板衍生生长因子（PDGF）和胎盘生长因子(PIGF)中的其他成员［3］.由于其独特的结构，HIF1α只有在低氧条件下才能发挥功能，其蛋白形式在常氧下5min即发生降解.我们先期对HIF1α的关键位点进行了定点突变，并将其成功包装腺病毒［4-5］.我们将其应用于大鼠下肢急性缺血模型中，观察其对血管新生的影响.1材料和方法1.1材料564与402双位点突变的人低氧诱导因子1α(AdHIF1α564Ala402Ala,.freelL/L水合氯醛按3～4μL/g腹腔注射麻醉大鼠.在严格无菌条件下暴露左侧后肢股动脉起始端及其分支，以细手术线结扎并

5、离断股动脉，造成急性后肢缺血模型.假手术组大鼠麻醉后仅切开皮肤再缝合，不处理血管.1.2.3动物分组与基因转染将模型大鼠随机分4组，每组18只，造模后即刻沿血管走向分5个位点（内侧3点、外侧2点）局部肌肉内注射基因：AdH564/402，AdH0，AdLacZ，滴度为1×1012OPU/L，总体积为0.5mL，对照组注射等量的生理盐水（NS）.缝合皮肤，继续分笼喂养.1.2.4RTPCR测定骨骼肌中HIF1αmRNA的表达于基因转染第1,3,5,7d，过量麻醉处死大鼠，取术侧下肢注射部位的骨骼肌快速液氮冰冻，取80mg在液氮下研碎，用RNAisoRe

6、agent提取组织总RNA，反转录合成cDNA，PCR扩增，条件为：95℃预变性5s，95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环.72℃5min,4℃备用.用GAPDH基因作为内对照，RTPCR测定HIF1αmRNA的相对表达量.1.2.5大鼠下肢动脉血管造影基因转染后第28日，麻醉大鼠后剖开腹腔，顺行穿刺腹主动脉，用稀释1倍的含碘3.5×105g/L欧乃派克行动脉造影，手推造影剂2～4mL/次，以6幅/s的速度连续摄像记录.以假手术组为阴性对照.1.2.6大鼠下肢动脉血管铸型基因转染后第28日，过量麻醉处死大鼠，切开腹腔，暴露腹主

7、动脉，顺行插管固定，分次灌注50g/L，100g/L的有色填充剂，充分凝固24～36h后去皮，并用酸腐蚀法去除骨骼及肌肉组织，仅保留动脉.以假手术组为阴性对照.统计学处理：用SPSS13.0进行数据分析.计量资料以x±s表示，组间比较采用析因设计的方差分析，两两比较用LSD检验，P0.05有统计学意义.以目的基因（HIF1α）Ct值的倒数与对照基因（GAPDH）Ct值倒数的比值代表目的基因mRNA的相对表达水平.2结果2.1扩增纯化后的病毒鉴定与病毒滴度测定经扩增、纯化后，PCR及测序证实所携带的目的基因信息无丢失或变异，AdH564/402滴度达到（6.

8、29±0.26）×1014OPU/L，