乳腺癌转移抑制基因brms1真核表达载体的构建及鉴定论文

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1、乳腺癌转移抑制基因BRMS1真核表达载体的构建及鉴定论文唐鲁兵高海东田春艳孙靖中刘焕涛马榕王甜甜【摘要】目的：构建乳腺癌转移抑制基因（BRMS1）真核表达载体pcDNA3.1/mycBRMS1，为研究抑制恶性肿瘤转移的机制奠定基础。方法：设计含有HindⅢ和XhoⅠ酶切位点的一对引物，应用逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）技术从人乳腺癌细胞株MCF7中扩增到BRMS1的cDNA基因片断，经回收、纯化、酶切后，连接到质粒pcDNA3.1/mycHis(+)A上，鉴定正确后并转染人胚肾细胞HEK293进行S1cDNA的碱基组成与GenBan

2、k中的人BRMS1cDNA的基因片断组成相同。结论：成功构建了乳腺癌转移抑制基因BRMS1真核表达载体并测序鉴定。【关键词】乳腺肿瘤转移抑制基因BRMS1基因表达Constructionandidentificationofeukaryoticexpressionvectorforhumanbreastcancermetastasissuppressor1(BRMS1)【ABSTRACT】Objective:ToconstructrebinedeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1/mycBRMS1cDNA

3、successfully.Thisisusefulforresearchingthemechanismsofmetastaticsuppression.Methods:Todesignapairofprimers,entsplifiedfromhumanbreastcancerMCF7byRTPCR.TheproductycHis(+)Aplasmid.TherebinantstransfectedintoHEK293cellandycBRMS1cNDAanBRMS1cDNAfragmentsbyagarosegelelectropho

4、resisandDNAsequenceanalysis.Conclusion:Eukaryoticexpressionvectorforhumanbreastcancermetastasissuppressor1(pcDNA3.1/mycBRMS1)hasbeenconstructedsuccessfulyandDNAsequencesMetastasissuppressorgeneBRMS1Geneexpression与乳腺癌转移有关的基因分为转移促进基因和转移抑制基因两大类。乳腺癌转移抑制基因1（breastcancermetast

5、asissuppressor1,BRMS1）是新发现的肿瘤转移抑制基因，同其它肿瘤转移抑制基因（Nm23,KISS1,Kail,ECadherin,MKK4,TIMPs等）一样，BRMS1并不影响原发肿瘤的生长.freelycBRMS1。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞与质粒人乳腺癌细胞株MCF7及人胚肾细胞株HEK293为军事医学科学院放射医学研究所惠赠，质料PcDNA3.1/mycHis(+)A购自Invitrogen公司。1.1.2引物设计与合成根据BRMS1cDNA序列，设计一对特异性引物，上游引物：5’agaaagcttc

6、caccatgcctgtccagcc3’,含HindⅢ酶切位点；下游引物：5’gccctcgagaggtccatccgattttc3’，含XhoⅠ酶切位点：βactin上游引物：actatgtttgagccttcaaca,下游引物：5’catctcttgctcgaagtcca3’由上海博亚生物技术公司合成。1.1.3试剂RNA提取试剂TRIZOL、SuperScriptTMⅢReverseTranscriptase及LipofecamineTM2000为Invitrogen产品；T4DNA连接酶购自Promega公司；限制性内切酶Hin

7、dⅢ,.freelyc的单克隆抗体购自CLONTECH公司；HRP标记的羊抗鼠的Ig购自北京中山公司；CF7在含10%小牛血清，100IU/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、含5%CO2的孵育箱中培养。1.2.2细胞总RNA提取取对数生长期的MCF7细胞，0.25%的胰蛋白酶消化，1000r/min离心弃上清，按照TRIZOL说明书中的操作步骤提取细胞总RNA，紫外分光光度仪下测定光密度OD260/OD280值（纯度＞1.8）及RNA含量计算，根据所测RNA含量稀释至2μg/ul。1.2.3RT

8、PCR反应共分2部分进行：（1）RT反应参照Invitrogen试剂盒说明书进行。取总RNA1μl(2μg/μl)、Oliog(dT)1μl和10mMdNTPMix1μL、ReverseTranscript