光 合 关 键 酶 的 测 定 方 法

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1、光合关键酶的测定方法一、酶液的制备取植物样品0.5g左右放入用液氮预冷的研钵中,迅速研磨成粉末状,加入3.0ml(w/v为1:6)预冷的100mMTris-H2SO4提取缓冲液【PH8.2,内含7.0mM巯基乙醇,1.0mMEDTA-Na(乙二胺四乙酸钠盐),5%甘油和1%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)】,混匀后在4℃下反应20min,混合液于4℃下15000r/min离心15min,取上清液备用。二、RUBPC活性的测定方法(参照Racker方法并略加改动)反应混合液(总体积3.2ml)组成:0.1MTris-HCl缓冲液(pH8.0)、0.1MMgCl2、50

2、mM腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)、50mM二硫苏糖醇(DTT)、2.0mMNADH、1.0mMEDTA-Na各0.3ml,200µMNaHCO30.1ml,蒸馏水1.0ml,3-磷酸甘油酸激酶(PGK)/3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAP-DH)(15u/15u)0.1ml,酶提取液0.1ml,30℃恒温水浴预温10min,将反应体系摇匀倒入比色杯内,以蒸馏水为空白,于340nm下测吸光度值E0,最后加入9.0mM1,5-二磷酸核酮糖(RuBP)0.1ml启动反应,立刻每隔10~15s间隔测定光吸收的变化。三、PEPC活性的测定方法(施教耐等方法)反应液总体积3.1

3、ml,内含1.0ml0.1MTris-H2SO4(pH9.2),1.0ml酶提取缓冲液,0.1ml10mMMgCl2,0.1ml10mMNaHCO3,0.2ml40mM磷酸烯醇式丙酮酸(PEP),0.3ml1.0mg/mlNADH,过量的苹果酸脱氢酶(MDH,约10.5U)0.2ml,于28℃水浴预温10min,用0.2mlPEPC提取液启动反应,迅速在340nm下测吸光度的下降。RuBPCasereactionmedium1.0.1MTris-HCl(pH8.0)2.0.1MMgCl23.50mMATP4.50mMDTT各0.3ml5.2mMNADH6.1

4、mMEDTA7.200µMNaHCO30.1ml8.PGK/GAP-DH(15U/15U)0.1ml9.9mMRuBP0.1ml10.酶提取液0.1ml11.蒸馏水1.0ml总体积3.2mlPEPCasereactionmedium1.0.1MTris-H2SO4(pH9.2)1.0ml2.酶提取缓冲液1.0ml3.10mMMgCl20.1ml4.10mMNaHCO30.1ml5.40mMPEP0.2ml6.1mg/mlNADH0.3ml7.过量的MDH(约10.5U)0.2ml8.酶提取液0.2ml总体积3.1ml酶活性测定反应液组成:注:参考文献――董永

5、华等,ABA和6-BA对水分胁迫下玉米幼苗碳素同化关键酶的影响。植物营养与肥料学报,1997,3(2):182-187.四、RUBPC和PEPC活性测定操作步骤操作流程如下:准确称取0.5g±植物样品,剪碎放入预冷研钵中加入液氮,迅速研磨加入3.0ml提取缓冲液,4℃下反应20min溶液在4℃下15000r/min离心15分钟PEPC测定RUBPC测定上清液即为粗酶液,冰箱内保存备用(4℃)RUBPC反应液2.9mlPGK/GAP-DH0.1ml(15U/15U)酶提取液0.1ml蛋白测定PEPC反应液2.5mlPEP0.2mlMDH(约10.5U)0.2m

6、l取0.1ml粗酶液加5.0ml考马斯亮兰染色剂,混匀放置2.0min,于595nm比色30℃水浴10min340nm测光密度E028℃水浴10min加酶提取液0.2ml启动反应,迅速在340nm测吸光度的下降(3min)加RUBP0.1ml启动反应,迅速检测吸光度的减少(1min)说明:1.RUBPC反应液(2.9ml)包括:0.1MTris-HCl(pH8.0)、0.1MMgCl2、50mMATP、50mMDTT、2.0mMNADH、1.0mMEDTA-Na各0.3ml,200µMNaHCO30.1ml,蒸馏水1.0ml。2.PEPC反应液(2.5ml)

7、包括:1.0ml0.1MTris-H2SO4(pH9.2),1.0ml酶提取缓冲液,0.1ml10mMMgCl2,0.1ml10mMNaHCO3,0.3ml1.0mg/mlNADH。3.上述两种反应液的配制方法是:先按要求的浓度配制各组分试剂溶液,然后根据各试剂的体积按比例混合而成。4.为减小实验误差,粗酶液提取出来后,应先测RUBPC活性,其次测PEPC活性,最后测定可溶性蛋白含量。可溶性蛋白的测定反应液配制:0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇(用无水乙醇加水兑成)中,加入100毫升85%磷酸,定容至1000毫升,过滤。(配制时要避光)(1000ml

8、反应液可做330个样品)测定:20ūl酶液+3mlG

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