nox4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探

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1、NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探作者：赵丽君刘燕翔刘珍王伯瑶黄宁吴琦【摘要】目的：构建NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作，采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列(533bp)，插入质粒pGL3basic载体，构建重组质粒pGL3NOX4，重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3NOX4转染A549细胞，通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激，结果显示NOX4表达增强

2、。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，为进一步研究NOX4基因的表达规律及生理功能奠定了基础。【关键词】NOX4;报告基因;表达调控还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶首先发现于中性粒细胞和单核/巨噬细胞，在吞噬微生物病原体时，NADPH氧化酶被激活，细胞发生呼吸爆发，产生大量活性氧簇(reactiveoxygenspecies,ROS)，成为机体抵抗微生物感染的重要成分[1]。近年，在非吞噬细胞质膜上发现了NADPH氧化酶的同源物家族，被命名为NOX(NADPH9oxidase)蛋白家族。人类基因组

3、同源性检索发现了7种NADPH氧化酶，即NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、Duox1和Duox2[2-4]。。NOX家族广泛表达于机体的组织器官，它们的生物学功能成为当前研究的热点领域。为了探讨NOX家族中NOX4在机体炎症和免疫反应中的作用，我们构建NOX4报告基因重组质粒pGL3NOX4，并初步观察了炎症细胞因子对该基因表达水平的影响。　　1主要材料和试剂　　A549上皮细胞株、E.coliDH5α为本实验室保存。荧光素酶报告基因载体pGL3basic，海肾荧光素酶内对照报告载体pRLTK及DualL

4、uciferaseReportAssaySystem为Promega产品。质粒提取，PCR产物纯化及凝胶回收试剂盒购自Omega公司。DMEM培养基、转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，细胞因子TNFα、IFNγ购自PeproTech公司。Pfu酶，dNTP,限制性内切酶(Xho1，BamHⅠ)，T4DNA连接酶等购自Takara公司。基因组DNA提取试剂盒，DL2000DNAMarker购自天根生物技术有限公司。　　2方法　　2.1质粒载体的构建

5、9　　2.1.1引物合成通过GenBank检索NOX4基因全序列，参考相关文献，设计扩增出含有NFκB结合位点的NOX4基因上游调控序列。引物设计采用Primer5.0软件，其序列如下：　　P1：CCTCTCGAGGAGGGTCCCCACTTTTAGTATGAG　　P2：GGTGGATCCCATCCTACCAGGCAGAGGTGTTTA　　引物分别含限制性内切酶Xho1，BamHⅠ酶切位点，扩增片段全长533bp。引物由大连宝生物技术有限公司合成。　　2.1.2PCR以细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为25μL，

6、含10×PCR反应buffer2.5μL;dNTP2μL;上下游引物各0.5μL;Pfu高保真酶0.2μL;DNA模板0.5μL;其余加水补足。反应条件为94℃变性3min，之后进行30个循环(94℃30s，.51℃30s，72℃4min,，)，72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物做电泳胶回收。pGL3basic载体用Xho1，BamHⅠ双酶切，小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒载体。　　2.1.3重组质粒的构建经酶切纯化后的PCR产物和pGL3basic载体用

7、T4DNA连接酶连接，转化到E.coliDH5α感受态细菌中，涂布于LB培养板，37℃孵育过夜，挑取细菌克隆提质粒，用Xho1，BamH9Ⅰ进行双酶切鉴定，最后经ABI3730全自动DNA测序仪进行测序(上海英俊生物技术有限公司)。　　2.2细胞转染及报告基因活性检测　　2.2.1细胞转染用含10%新生小牛血清的DMEM培养基培养A549细胞。将对数生长期的细胞于转染前24小时，按每孔10×104个细胞密度接种于48孔培养板，当细胞达85-95%时，按照Lipofectamine2000说明书进行重组质粒pGL3basicNO

8、X4和pRLTK载体转染。具体操作为将细胞培养基换为无血清的DMEM(100μL/孔)，Lipofectamine2000与质粒DNA(报告基因重组质粒和内对照质粒pRLTK)以一定比例各加入100μL无血清的DMEM中，5min后混合，室温孵育20min，