川芎嗪抗动脉粥样硬化机制的研究

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1、川芎嗪抗动脉粥样硬化机制的研究作者：彭小春，马红莺，尹刚，魏芸【摘要】　　目的研究川芎嗪对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)致人内皮细胞ECV304损伤的保护作用及机制，探讨其在动脉粥样硬化防治中的意义。方法ox-LDL诱导人血管内皮细胞损伤，以0.5mg/ml川芎嗪干预24h，试剂盒测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH)、丙二醛（MDA)含量以及细胞中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。结果川芎嗪对ox-LDL诱导的血管内皮细胞诱导的损伤有明显的抑制作用，主要是显著提高了血管内皮细胞抗氧化酶SOD、GSH-Px的活性。结论川芎嗪对ox-L

2、DL导致內皮细胞损伤具有保护作用，机制与其抗氧化效应有关。【关键词】川芎嗪；氧化型低密度脂蛋白；动脉粥样硬化；谷光甘肽过氧化物酶；超氧化物歧化酶内皮功能不全被认为是动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)炎症学说发病机制中的最早期事件。许多危险因素能引起内皮功能不全，诸如高胆固醇血症、高血压病、吸烟、糖尿病等［1］。但内皮功能不全的确切机制还不十分清楚。越来越多的证据显示氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein,ox-LDL)7在内皮功能不全中扮演重要角色。本实验以体外培养内皮细胞为研究对象，观察川芎嗪对ox-LDL诱

3、导的内皮细胞损伤的保护作用及其机制，为川芎嗪在治疗动脉粥样硬化中的应用提供实验依据。　　1材料与仪器　　1.1药物盐酸川芎嗪氯化钠溶液（100ml∶80mg），购于山东华鲁制药有限公司，用蒸馏水稀释成终浓度0.5mg/ml。　　1.2细胞人内皮细胞株(ECV304)购自武汉大学典藏中心。　　1.3试剂与仪器DMEM，胎牛血清以及胰蛋白酶购自美国Gibeco公司；乳酸脱氢酶（LDH)、丙二醛（MDA)，超氧化物歧化酶(SOD)、谷光甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒均购于南京建成公司。兔抗人Ⅷ因子抗体购于福州迈新生物技术公司。　　2方法　　2.1内皮细胞培养和鉴定

4、　　常规培养ECV304细胞，待生长至融合状态后，0.25%胰蛋白酶消化，吹散、均匀接种于预置盖玻片的6孔板中，加入细胞培养液，置孵箱培养247h取出细胞爬片。PBS洗涤两次，4％多聚甲醛固定后，细胞的鉴定采用Ⅷ因子抗原检测法、DAB染色阳性确定。　　2.2ox-LDL的制备参照文献［2］　　分离出人血浆LDL，4℃置磷酸缓冲盐透析24h，经琼脂糖凝胶电泳证实为单一区带。所得LDL经聚乙二醇(PEG)20000浓缩4～5倍后以Lowry's法测定蛋白含量。0.45μmol/L滤膜过滤除菌。采用CuCl2在室温下氧化。测定各组硫代巴比妥酸反应产物（TBARS）值，经0.

5、4%的琼脂糖凝胶电泳检测LDL氧化程度。　　2.3实验分组测定其它指标的细胞，无血清培养基同步化12h，随机分为４组：①空白对照组（ECV304）：不加任何刺激因素；②川芎嗪对照组（ECV304＋川芎嗪）：加入终浓度为0.5mg/ml的川芎嗪；③ox-LDL组（ECV304+ox-LDL）加入终浓度为0.1mg/ml的ox-LDL；④川芎嗪保护组（ECV304+ox-LDL+川芎嗪）加入终浓度为0.1mg/ml的ox-LDL和0.5mg/ml的川芎嗪。各组细胞加入处理因素后继续培养24h，收集细胞培养液，测定LDH、MDA含量；收集细胞检测SOD、GSH-Px活性。　

6、　2.4测定LDH、MDA含量以及SOD、GSH-Px活性收集12孔培养板中培养液，按照试剂盒说明书测定LDH和MDA含量；培养板中细胞用PBS洗2次，刮取细胞，加入冰冷PBS悬浮细胞，超声15s，反复冻融3次，离心，按照试剂盒方法测定SOD、GSH-Px活性。7　　3结果　　3.1内皮细胞第Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定细胞呈椭圆形，多角形或不规则形，胞浆中有黄褐色颗粒存在，Ⅷ因子相关抗原鉴定反应阳性。　　3.2川芎嗪对ox-LDL诱导内皮细胞损伤的保护作用细胞培养液中LDH检测表明：经ox-LDL刺激24h后细胞分泌的LDH含量（468.34±9.46）U/L，明显高

7、于未加任何处理因素的空白组（136.56±19.26）U/L。而经过终浓度为0.5mg/ml的川芎嗪处理的药物保护组细胞分泌的LDH含量为（75.34±6.89）U/L，明显低于ox-LDL组，两者差异显著（P<0.05）。川芎嗪保护组较ox-LDL组MDA含量明显降低，差异有显著性（P<0.05），其中ox-LDL组MDA为（1.58±0.02）μmol/L，而川芎嗪保护组MDA为（0.64±0.08）μmol/L；同时川芎嗪保护组的SOD、GSH-Px活性明显高于ox-LDL组，ox-LDL组SOD为（27.43±5.43）mU/L，