c27黑曲霉培养及分离纯化

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1、jjjjdj黑曲霉的分离筛选一、实验简介黑曲霉广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。黑曲霉的最适温度为37℃，黑曲霉对营养要求较低,只要培养基中含有碳源、氮源及磷、钾、镁、硫等元素即能生长良好，实验中采用察氏培养基进行培养。黑曲霉的菌落蔓延迅速，但生长稍局限，菌丝初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状，背面无色或中央略带黄褐色。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗双层褐色，梗基较短，上长有成串褐黑色的球状分生孢子。孢子直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。黑曲霉的个体形态和菌落形态都比较特殊，容易分辨，可利用平板划线法或稀释涂布法，

2、得到单菌落，并结合显微镜检测，多步鉴定、纯化，得到的纯的菌种。二、实验试剂与材料1、材料：黑曲霉孢子悬浮液2、溶液和试剂：硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钾、硫酸亚铁、蔗糖、琼脂、1mol/L氢氧化钠溶液、1mol/L氯化氢溶液、75%乙醇、乙醇乙醚混合液、溴甲酚绿、水。3、器材和其他用品：三角瓶、试管、搪瓷杯、培养皿、接种环、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、试管架、载玻片、盖玻片、光学显微镜、恒温培养箱、纱布、牛皮纸、滤纸、pH试纸、擦镜纸。三、实验步骤和过程1、无菌器材及无菌水的准备1.1培养皿：洗净的培养皿烘干后，每组将5套培养皿叠在一起，用报纸卷成一筒，然后进行灭菌。注意，一定要卷紧。1.

3、2试管：做合适的棉塞，每组捆扎5支试管，用报纸包在一起后，用线绳扎紧，扎成活结，另一头再用皮筋扎好，然后进行灭菌。1.3三角瓶：在三角瓶瓶口塞一八层纱布，盖上牛皮纸，用线绳扎成活结，然后进行灭菌。注意，装入的培养基不超过三角瓶的1/2。　　上述物品均要用记号笔注明班级、组别、日期。1.4高压蒸汽灭菌2、查氏培养基的配制称量→熔化→定容→调pH→分装→加塞→包扎标记→灭菌→搁置斜面与倒平板→无菌检查培养基配方：硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁（MgSO4·H2O）0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mlpH5.0-6.02.1称量：按照培养基配方，依次准确

4、地称取药品，放入搪瓷杯中。2.2熔化：量取自来水，加入所需水量的一部分至上述搪瓷杯中，用玻璃棒搅拌，待药品溶解后，加入琼脂，倒入余下的水，在电热板上加热熔化。2.3定容：将加热后的培养基导入量筒中，用自来水进行定容，至1000ml。2.4调pH：待培养基稍冷却后，用精密pH试纸测量培养基的原始pH，若偏酸，用1mol/LNaOH边滴加边搅拌，使之达到pH5.0-6.0。若偏碱，则用1mol/LHCl调节。2.5分装：用分装装置将培养基装入试管，高度为试管总长的1/5，共20支。余下培养基转入三角瓶中，培养基的量为三角瓶容量的1/3-1/2。2.6加塞、包扎、标记：试管加棉花塞，5支一捆包扎

5、好，棉塞外加一层报纸防灭菌时冷凝水湿润棉塞，在外用线绳扎成活结，；三角瓶用纱布塞住瓶口，并用牛皮纸的线绳包扎好。用记号笔注明培养基名称、班级、组别、配制日期。2.7灭菌：0.1MPa，121℃，20min高压蒸汽灭菌。2.8搁置斜面：待已灭菌的试管培养基冷却至50℃左右，将试管口端搁置在有合适高度的器具上，使培养基斜面长度不超过试管总长的一半为宜。2.9倒平板：待三角瓶中培养基冷却至50℃左右，倒平板。2.10无菌检查：灭菌培养基放入37℃培养箱中一天，若无细菌污染则说明灭菌彻底。3、菌种分离纯化3.1用接种环从黑曲霉孢子悬浮液，接种于小试管斜面中培养（5支）。然后放37℃培养箱中培养24

6、小时。3.2平板划线：左手拿平板，右手拿接种环在火焰上灭菌后沾取菌液或菌苔一环，在平板上划平行线三条，接种环在火焰上灭菌，左手转动平皿约70度，用无菌接种环通过第一次划线的末端作为起点作二次划线，依次作第三次、第四次划线（平行线划线法）。或将挑取有菌的接种环在平板培养基上作连续划线。培养：合上皿盖，倒置培养皿于37℃培养24小时。挑菌落：挑取单个菌落的菌苔少许，涂在载玻片上进行显微镜个体形态观察，结合菌落形态特征综合分析。若不纯，需再用平板划线法继续进行分离纯化。四、实验分析与检测1、黑曲霉菌落特征孢子呈圆球状，淡灰黑色，数目较多，清晰明显，个体较大。2、菌落计数情况培养平板1234567

7、8菌落数182016513179243、菌落形态特征第一天：直径约为5mm的菌落，扁平状，菌丝呈绒毛状，白色。第二天：菌落变大，菌丝基部白色，顶部浅黄色。第三天：菌落更大，菌丝基部浅黄色，顶部形成黑色球状形顶囊（即分生因子），菌丝密集，菌落呈现黑色。4、结果分析黑曲霉生长条件要求低，生长繁殖能力强，在平板上生长后，其他微生物难以生长繁殖，故黑曲霉较易实现扩大培养及分离纯化，对于利用黑曲霉进行工业发酵，如柠檬酸发酵具有一定