凋亡相关基因-bax在不同细胞中表达产物差异检测

《凋亡相关基因-bax在不同细胞中表达产物差异检测》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、细胞与医学遗传学实验江一舟06301010193凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测江一舟06级临八1班063010101931实验目的1.1通过测定凋亡相关基因－Bax在不同细胞中表达产物差异检测，研究缺糖对细胞增殖抑制作用的机制（引起细胞凋亡或坏死）。1.2掌握免疫组织化学法的原理。2实验原理2.1免疫细胞化学和亲和组织化学免疫细胞化学（免疫组化）将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，从而对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。亲和组织化学则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和

2、力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。2.2凋亡相关基因—BaxBax是Bcl-2家族成员。凋亡信号能激活Bax，使Bax蛋白从胞浆移位到线粒体膜上。随后其蛋白构象发生改变（寡聚化），使线粒体膜通透性增加，释放Cytc，引起细胞凋亡。3.3Bax表达产物差异检测本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。此复合物与SABC作用，使得检测物被放大，最后在显色剂DAB的作用下，Bax构象蛋白显色（褐色）。3实验材料仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜。材料：培养细胞。试剂：甲醇、

3、PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DAB、0.3％H2O2-PBS。4实验步骤培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复）—PBS洗，5minX3次(轻轻地洗涤)—甲醇固定10min—PBS洗，5minX3次—加入封闭液（1:10）25µl，37℃，30min—加一抗（1:300）25µl，37℃，1h—PBS洗，5minX3次—加二抗25µl，37℃，1h—PBS洗，5minX3次—加0.3％H2O2-PBS，37℃，30min—PBS洗，5minX3次—SABC工作液20-30µl，37℃，1h—PBS洗，5minX3次—DAB显色，观察结果。3细胞与医学遗传

4、学实验江一舟063010101935实验结果正常组的细胞形态饱满，胞质透明，基本不着色，核形态规则，为圆形或椭圆形。损伤组中，部分细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆、皱缩，胞质深染，核质比例增大；其余细胞胞质着色较正常组深。损伤恢复组中，少部分细胞呈现典型凋亡细胞形态，细胞变圆、皱缩，胞质深染，核质比例增大；其余细胞胞质着色较正常组深。免疫组化显示，Bax构象蛋白在正常组细胞中几乎没有表达，而在损伤组和损伤恢复组中均有表达，其中损伤恢复组的Bax构象蛋白表达量高于损伤组（图1）。CBA图1免疫细胞化学法检测Bax蛋白的表达A：正常组的CHL细胞；B：损伤组的CHL细胞；C：损

5、伤恢复组的CHL细胞6讨论6.1Bax可以被凋亡信号激活，从胞浆移位到线粒体膜上，随后其蛋白构象发生改变（寡聚化），使线粒体膜通透性增加，释放Cytc，引起细胞凋亡。Bax促进凋亡的机理主要是：①线粒体渗透性转换、氧化磷酸化和ATP的合成功能被破坏；②细胞氧化还原作用改变；③线粒体中的凋亡相关Apaf-1释放出来，与细胞色素c相互作用，激活Caspase信号转导途径。Bax构象蛋白含量可以作为评价细胞凋亡的指标。本实验用免疫组化法检测了正常组、损伤组、损伤恢复组的Bax构象蛋白表达变化，结果显示，Bax构象蛋白阳性表达量：损伤组>损伤恢复组>正常组。由此可知，①缺糖对CHL细

6、胞增殖的抑制作用是通过促进细胞凋亡实现的；②细胞凋亡程度：损伤组>损伤恢复组>正常组。6.2本实验中，损伤组细胞的Bax构象蛋白表达量高于损伤恢复组，原因可能是损伤时间（5h）不长，线粒体和细胞膜的正常功能未完全丧失，糖的重新加入一方面为细胞提供了能量来源，另一方面可以增强细胞质和线粒体内的应激蛋白（如grp75）的表达，而grp75的上调表达可以起到保护蛋白质，协助蛋白（特别是线粒体蛋白）转运，3细胞与医学遗传学实验江一舟06301010193提高细胞对应激反应耐受性的作用，从而延缓细胞凋亡。当缺糖时间过长时，由于线粒体和细胞膜的正常功能已基本丧失，糖的重新加入可能不会延缓

7、细胞的凋亡进程，甚至可能通过引起ROS的升高，造成缺糖恢复组的凋亡程度高于缺糖组（可以设计实验进行探索）。6.3正常组中，细胞密度较高区域的细胞呈现Bax构象蛋白高表达，原因可能是接种细胞过多以致部分区域细胞发生凋亡。6.4几种试剂的作用6.4.1封闭液可以封闭非特异性位点，从而保证抗原抗体间的特异性结合。6.4.20.3％H2O2-PBS（甲醇）可以消除内源性过氧化物酶活性作用，从而消除其对SABC-DAB显色的影响。6.4.3SABC是链酶亲和素——生物素——过氧化物酶复合，起到信号放大作用。6.5