分子生物学实验报告

《分子生物学实验报告》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、PCR基因扩增实验目的：通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。实验原理：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2的n次方倍。实验仪器：基因扩增仪移液器实验试剂：10×PCR缓冲液(含Mg2＋)4种dNTPTaq酶DNA模板两种引物（正向引物和反向引物）实验步骤:`1、按顺序向微量离心管中依次加入：ddH2O20μlDNA样品

2、5μl10×PCR缓冲液5μldNTP4μl引物I5μl引物Ⅱ5μl混匀。2、PCR反应参数(1)94℃变性2min(2)94℃变性30sec，(3)66℃退火30sec，(4)72℃延伸1min。(5)重复(2)-(4)40次（6）72℃延伸7min。（7）4℃保存3、琼脂糖凝胶电泳检测PCR的结果：取10μlPCR扩增产物，琼脂糖凝胶电泳检测。保持电流40mA。电泳结束后，用EB染色15min，紫外灯下观察结果。实验结果：照片结果图12341.10ul样品2.样品3.DNA相对分子质量标准4.对照DNA琼脂糖凝胶电泳实验目的：通过本实

3、验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。实验原理：DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA在碱性的溶液中带有负电荷，因此，在电场作用下朝正极移动。在琼脂糖凝胶中电泳时，由于琼脂糖凝胶具有一定孔径，长度不同的DNA分子由于所受凝胶的阻遏作用大小不一，迁移的速度不同，从而可以按照分子量大小得到有效分离。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中。在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈

4、橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作荧光指示剂指示DNA含量和位置。实验仪器：1.电泳仪；2.紫外检测仪；3.水平电泳槽；4.移液枪；5.一次性手套。实验试剂：1.配置1000ml5xTBEpH8.0Tris54g硼酸27.5g0.5mol/LEDTA20ml2、EB溶液溴化乙锭溶液（0.5ug/ml）3、凝胶加样缓冲液（6x）溴酚蓝0.25％蔗糖40％4、琼脂糖实验步骤：1、琼脂糖凝胶的制备：（1）称取琼脂糖0.3g，加入30ml0.5xTBE缓冲液，在微波炉上加热溶解，取出摇匀，配制成1％琼脂糖凝胶；稍凉后加入配好的EB溶液数滴。（2）取有

5、机玻璃内槽，洗净晾干，用橡皮膏将机玻璃内槽两端密封，将有机玻璃内槽放置一水平位置，并放好样品梳子。将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶溶液倒入有机玻璃内槽，直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面。（3）冷凝后将梳子拨出，电泳胶放入电泳槽中。（4）加入电泳缓冲液至电泳槽中。2、加样用移液枪取缓冲液，依次点1—2ul缓冲液在一次性手套上。再取样品溶液5ul左右，加入缓冲液中，混匀后，将溶液加到样品孔中，并记录好点样顺序。同时在另一样品孔中加入标准分子量DNA。3、电泳：加入pH8.0Tris－硼酸－EDTA缓冲液后，接通电泳槽与电泳仪的电源，最高电压不超

6、过5V/cm，电泳至溴酚蓝走到胶底部边缘时停止电泳。染色及观察：电泳完毕，取出凝胶模具，将其浸入溴化乙锭染色液中，染色15min后将其推到一块干净的玻璃板上，于254nm、300nm或360nm波长紫外灯下观察，DNA存在的位置呈现桔红色荧光条带，照相。实验结果上图为质粒DNA和酶切产物的电泳结果DNA重组实验目的通过本实验学会重组DNA连接以及鉴定重组子的方法。实验原理：外源DNA片段和线状质粒载体的连接就是DNA重组，在Mg2+和ATP存在下，DNA连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源DNA的相同粘性末端联接成重组DNA分子。在这种情

7、况下产生的两个杂交体分子带有2个单链切口，当杂本导入感受态细胞后可被修复。相邻的5'磷酸和3'羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由两种不同的DNA连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌DNA连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。受体细胞经过CaCl2处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子，即带有异源DNA分子的受体细胞。关于转化子的筛选利用α-互补现象筛选方法。载体上带有

8、β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。宿主细胞带有β-半乳糖