结核病实验室诊断技术

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1、结核病实验室诊断技术刘丹阳文华邵阳市疾病预防控制中心痰涂片实验室RobertKochMycobacteriumtuberculosis结核分枝杆菌H37Rv全基因组大小为4411529bp，G+C含量为65.6%，基因组富含重复序列，特别是插入序列，以及新的多基因家族及管家基因，10kb以上的高G+C区域，即PE/PPE区域。整个基因组中G+C含量相对稳定细胞壁富含长链脂肪酸，68%~70%分枝杆菌生物学特性结核分枝杆菌是专性需氧菌，不形成芽孢、无动力的杆菌，空气中加入5%~10%CO2会刺激其生长。最适pH为6.4~

2、7.0。在35℃~40℃均可生长，最适宜温度是37℃，但牛分枝杆菌最适宜温度为36±1℃。生长缓慢，固体培养基上生长，代时为18h~20h，形成肉眼可见的菌落一般需要8天-8周；但液体培养基上稍快，代时为14h~15h。分枝杆菌细胞壁中的脂肪成分不能被常用的苯胺染料着色。虽然革兰氏染色法很难使分枝杆菌着色，但它仍归类为革兰氏阳性菌，特定的染色程序可促进染色；一旦着色，分枝杆菌则很难脱色，即使是使用酸性乙醇也很难使分枝杆菌脱色，这一特性被定义为抗酸性（acid-fastness）。结核分枝杆菌的抵抗力结核菌对干燥或干热、

3、冷冻抵抗力强；对热敏感，60℃10~30分钟、80℃以上5分钟以内死亡。对紫外线敏感，太阳光直射，2~7小时死亡，紫外线10W50厘米，5毫米厚度的菌悬液（10-1mg/ml）照射3分钟，可灭菌。结核病人的衣物、被褥、用品等可煮沸、或日光消毒。对大多数消毒剂敏感，75%乙醇5分钟（可用于手消毒，但不能用于痰消毒，因为乙醇能凝固蛋白质）、0.1%升汞液10分钟、1%~2%石炭酸5分钟，5%石炭酸1分钟，2%来苏儿液5分钟，0.1%~1%过氧乙酸1~小时，均可杀灭结核杆菌。121℃高压20~60分钟，可灭菌。实验室生物安全

4、结核分枝杆菌的感染剂量比较低（50%的感染剂量为<10个菌细胞）从现场标本中直接进行细菌分离培养、初步鉴定、药物敏感性试验、生化鉴定、免疫学试验、PCR核酸提取、涂片、显微镜检查等检测活动可在生物安全二级实验室中进行。大量进行结核分枝杆菌培养、与大量耐药菌株接触或者进行危险性未知的试验时，需要具有生物安全3级水平的操作和设施的实验室。动物感染实验要在动物生物安全三级实验室中进行属群种Mycobacterium根据分枝杆菌分类国际研究班（IWGMT）的分类方案将本属细菌分为三类，即缓慢生长菌：结核分枝杆菌；RunyonⅠ

5、（光产色菌）、Ⅱ（暗产色菌）、Ⅲ群（不产色菌）；快速生长菌：RunyonⅣ群；特殊营养要求：麻风杆菌；EvolutionoftheMycobacteriumtuberculosiscomplexFromBroschetal.PNAS2002M.canettii实验室检测的标本绝大多数做分枝杆菌培养的标本来自呼吸道：痰、盥洗液组织、胸水、腹水、尿液和胃液也是常用的标本。血和粪便标本多来自AIDS患者。关键点：采集合格的标本病原检测、鉴定技术及应用涂片染色显微镜检查细菌培养固体培养、液体培养（常规、快速）常规培养生化鉴定分

6、枝杆菌鉴定系统分枝生物学鉴定技术多位点PCR鉴定，PCR-RLFPIS6100-RLFP,Spoligotyping，MLVA应用病原学诊断病原学监测暴发流行的病原调查和溯源涂片染色显微镜检查病原检测、鉴定技术及应用-1荧光染色技术抗酸染色技术三、病原检测、鉴定技术-2细菌培养固体培养液体培养BACTECMGIT960常规培养生化鉴定耐热触酶试验堪萨斯分枝杆菌（+），结核分枝杆菌（-）硝酸盐还原试验结核分枝杆菌（+），牛分枝杆菌（-）吐温-80水解试验堪萨斯分枝杆菌（+），瘰疬分枝杆菌（-）尿素酶试验试剂结核分枝杆菌（

7、+），蟾蜍分枝杆菌（-）芳香硫磺酯酶试验偶然分枝杆菌（+），结核分枝杆菌（-）铁离子吸收试验偶然分枝杆菌（+），龟分枝杆菌（-）亚碲酸盐还原试验胞内分枝杆菌（+），次要分枝杆菌（-）烟酸试验结核分枝杆菌（+），牛分枝杆菌（-）病原检测、鉴定技术及应用-3PNB、TCH鉴别培养基鉴定病原检测、鉴定技术-4分枝生物学鉴定技术多位点PCR病原检测、鉴定技术-5分枝生物学鉴定技术PCR-RLFP病原检测、鉴定技术-6标准菌株Hsp65-PCRrpoB-PCRRFLP测序HaeⅢBstpIHaeⅢMspIBLAST模拟酶切注：先

8、用两种基因进行酶切，进行指纹图谱分析，仍然无法鉴定出的进行测序，在NCBI数据库上进行比对。分枝生物学鉴定技术IS6110-RLFP病原检测、鉴定技术-7结核分枝杆菌全基因组DNApvuII酶切产物IS6110-RFLP分析内对照标准分子结核分枝杆菌IS6110-RFLP结果结核分枝杆菌聚类分析树状图分枝生物学鉴定技术Spolig