高脂饮食大鼠脂肪组织甘油三酯脂酶的表达及罗格列酮的干预

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1、高脂饮食大鼠脂肪组织甘油三酯脂酶的表达及罗格列酮的干预：唐勇宋光耀杨秀红张明明张蕾郝欣欣【摘要】目的观察高脂饮食胰岛素抵抗大鼠脂肪组织中脂肪甘油三酯脂酶的表达及罗格列酮的干预效果。方法5月龄雄性V,大连宝生物)测定ATGLmRNA表达量。ATGL引物采用DNAMAN软件设计，由上海生物工程公司合成。上游引物：5′CATCCAGTTCAACCTTCGCA3′，下游引物：5′CTCTGCTCTTTCATCCACCG3′，扩增长度950bp。反应条件：94℃预变性5min,94℃45s→54℃45s→72℃60s,72℃延伸10

2、min，循环次数为35个。扩增产物在2.0%琼脂糖凝胶中100V稳压电泳20～30min，凝胶图像分析仪照片，并用QuantityOne4.4（BioRad）软件进行光密度定量分析，将ATGL条带与内参照βactin条带的光密度比值作为mRNA表达的相对量。1.7脂肪组织ATGL蛋白表达1ml裂解液中加入脂肪组织匀浆，考马斯亮蓝法测定蛋白含量。取50μg蛋白进行10%SDSPAGE电泳，湿法电转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭1h，加入1∶200稀释的羊抗ATGL抗体（美国SantaCruz公司）4℃孵育过夜，漂洗后加入1∶2

3、000的兔抗羊IgG辣根过氧化物酶标记抗体（北京中杉金桥），孵育1h，DAB试剂显色。同样步骤进行内参照βactin测定。ATGL蛋白的表达量以其特异性结合条带与βactin的结合条带的光密度比值表示。1.8统计学方法所有数据处理均应用SPSS13.0软件统计，数值结果以x±s表示。两个样本均数比较采用t检验和方差分析，不同指标间采用直线相关分析及直线回归分析。2结果2.1一般项目结果喂养第8周末，三组之间体重无差异（P＞0.05）；与正常对照组相比较，高脂对照组甘油三酯、胆固醇、空腹血糖、空腹胰岛素及游离脂肪酸均明显升高，差异

4、有统计学意义（P＜0.01）；给予罗格列酮干预后，上述指标有所下降（P＜0.05，P＜0.01），见表1。表1各组大鼠8w时体重、血清指标的比较与高脂对照组比较：1）P＜0.01，2）P＜0.05；表2同2.4脂肪组织ATGLmRNA及蛋白表达与正常对照组相比，高脂对照组ATGL的mRNA及蛋白表达降低（P＜0.01）；罗格列酮干预组ATGLmRNA及蛋白表达较高脂对照组有所增加，但两组间差异无统计学意义（P＞0.05），见图1和表3。表2各组大鼠葡萄糖输注率的比较表3各组大鼠脂肪组织中ATGL的表达量2.5相关性分析ATGLmRN

5、A的表达与胰岛素、游离脂肪酸明显负相关，r值分别为-0.4539和-0.3786，与葡萄糖输注率呈正相关，r值为0.354（均P＜0.05）。3讨论脂肪代谢是机体能量代谢调节的重要环节。近年来，对脂质代谢的研究已经明确“脂毒性”在胰岛素抵抗发生发展中的作用〔6〕。本研究显示，尽管高脂饮食没有引起体重的变化，但空腹血糖、胰岛素、FFA较正常对照组增高，葡萄糖输注率降低，说明高脂喂养可导致胰岛素抵抗。脂肪组织是机体的储能器官，其甘油三酯分解和合成的动态平衡是影响循环中FFA水平的重要因素，本研究显示高脂饮食可引起内脏脂肪组织相对含量增加

6、，提示脂肪中甘油三酯的分解异常可能与胰岛素抵抗相关。ATGL是新近发现的脂肪酶，特异性水解甘油三酯，主要在脂肪组织中表达，此外，在心肌、骨骼肌、脑组织中也有少量表达〔7〕，其表达受多种因素如饮食、激素等调节。在体外培养3T3L1细胞的实验中，胰岛素可明显减低ATGLmRNA的表达，并且呈时间和剂量依赖关系〔8〕。高脂喂养大鼠模型存在明显的胰岛素抵抗和高胰岛素血症，本研究显示高脂喂养时脂肪组织中ATGLmRNA表达与胰岛素水平呈负相关，提示增高的胰岛素可能下调ATGL的表达。这与在ob/ob肥胖小鼠和db/db糖尿病小鼠中观察到的结

7、果是是一致的，ATGL表达在这两种动物模型中分别下调80%和50%〔9〕。同时，有研究显示在胰岛素抵抗时，脂肪组织游离脂肪酸的排泄率与空腹胰岛素负相关〔10〕,说明脂肪分解异常可能继发于胰岛素抵抗，推测高胰岛素血症可能抑制脂肪组织中甘油三酯的分解。罗格列酮是一类治疗2型糖尿病的新药物，激活PPARγ，增加外周组织的胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗。Kim等〔11〕研究发现ATGL基因的启动子区域存在PPARγ的结合位点，提示PPARγ可能参与了ATGL的基因表达。本研究显示罗格列酮干预后ATGLmRNA的表达尽管有所增加，但是与高脂对照

8、组相比没有差异，这与KershaanGI.Freefattyacidsinobesityandtype2diabetes:definingtheirroleinthedevelopmentofinsulinresistanceandb