三氧化二砷诱导胃癌细胞凋亡和bcl

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1、三氧化二砷诱导胃癌细胞凋亡和Bcl：郑亦胡，周蒙滔，单云峰，张启瑜【摘要】　　目的：探讨三氧化二砷(As2O3)是否能够诱导SGC7901胃癌细胞凋亡，以及Bcl-2的表型变化是否在其中发挥了作用。方法：将不同浓度的三氧化二砷作用于SGC7901细胞，采用CCK-8进行细胞毒检测；采用DAPI染色进行细胞核形态分析；采用免疫荧光显微镜观察不同表型的Bcl-2表达的变化；采用ethods:SGC7901humangastriccancercellseasuredbyusingtheCellCountingAssayKit-8.Analysisofnuclearmorphologymunof

2、luorescencemicroscopy.TheexpressionofBcl-2inedangastriccancercells，andtheapoptosisaybeexpressedthroughtheinductionofBcl-2phenotpechangeratherthandoachneoplams；apoptosis；Bcl-2　　近年来，大量研究证实三氧化二砷在体外对于多种恶性肿瘤细胞具有诱导凋亡作用，包括胃癌、肺癌、乳腺癌、肝细胞癌、鼻咽癌、胆囊癌、宫颈癌和子宫内膜癌[1-2]，但是对于三氧化二砷诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制却仍然存在争议。下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表

3、达是一种重要的作用机制[2-4]。最新的研究却发现，Bcl-2具有细胞保护和破坏两种表型，其不同的表型被其蛋白构象所调控[5]，这种构象的改变可以使Bcl-2从一个细胞保护作用变成破坏作用。本实验拟研究三氧化二砷是否能够诱导SGC7901胃癌细胞凋亡并观察Bcl-2的表达量和表型的变化，探讨其诱导凋亡的机制。　　1材料和方法　　1.1主要试剂　　三氧化二砷购自哈尔滨伊达药业公司，浓度：10mg/10mL。RPMI1640培养液和胎牛血清购自美国Invitrogen公司。抗Bcl-2N端兔多抗IgG、抗Bcl-2鼠单抗IgG、抗β-actin鼠单抗IgG1购自美国SantaCruz公司。抗

4、Bcl-2BH3结构域抗体购自美国Abgent公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗鼠二抗、Cy3标记的抗兔IgG、DAPI染料购自碧云天生物研究所。CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所。哺乳动物蛋白抽提试剂购自美国ThermoScientific公司。聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国Millipore公司。ECL化学发光检测试剂盒购自美国Pierce公司。　　1.2细胞培养　　人胃癌细胞株SGC7901购自中科院上海细胞研究所，予含10%胎牛血清的RPMI1640培养液，在5%CO2饱和湿度的37℃孵箱中培养，细胞长满后经胰酶消化法传代。　　1.3实验设计　　首先使用细胞毒检测求

5、得三氧化二砷作用SGC7901胃癌细胞24h的50%细胞死亡的浓度（IC50），再用IC50的浓度作用SGC7901胃癌细胞，尔后进行细胞核形态分析、Bcl-2表型和Bcl-2表达的检测。　　1.4细胞毒检测　　细胞以1.5×104个/cm2的密度接种于100μL的96孔板中预培养24h。使用含0.1%BSA的RPMI1640培养液培养24h，使细胞同步化。尔后被不同浓度的三氧化二砷分别处理24h，利用日本同仁化学研究所生产的CCK-8试剂盒进行细胞毒检测，根据厂家的操作手册进行操作。按公式计算：细胞生长抑制率（%）=（1-实验组光密度值/对照组光密度值）×100%。　　1.5凋亡细胞核

6、形态分析　　细胞以1.5×104个/cm2的密度，接种于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷处理24h。细胞经4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。在暗室中经1μg/mL的DAPI染色15min后，使用免疫荧光显微镜进行观察（波长为340~380nm、放大倍数为1000）。　　1.6Bcl-2的表型观察和检测　　细胞以1.5×104个/cm2的密度，接种于6孔板上，使用10μmol/L的三氧化二砷处理24h。经4%的多聚甲醛固定后，用PBS清洗。使用1%的TritonX-100做透膜处理后，再使用5%的小牛血清蛋白进行封闭，添加一抗（1:50）在4℃过夜孵育，然后加入Cy3标记的二抗

7、（1:100）在室温下孵育2h，最后加入1μg/mL的DAPI复染细胞核。使用免疫荧光显微镜进行观察（放大倍数为1000）。一抗包括：抗Bcl-2N端抗体、抗Bcl-2BH3结构域抗体。　　1.72的密度接种于75cm2大小的培养瓶中，经10μmol/L的三氧化二砷处理24h。胰酶消化后收集细胞。蛋白抽提方法和WesternBlot蛋白印迹法参照美国Pierce公司说明书。使用BCA法测定蛋白浓度，β-actin作为参照。　　1.8