棒曲霉菌中抗真菌肽的分离与纯化

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1、棒曲霉菌中抗真菌肽的分离与纯化【关键词】,棒曲霉菌;分离;真菌蛋白类〔摘要〕〔目的〕从棒曲霉菌培养上清液中分离纯化具有抗真菌活性的肽类物质（AFP）.〔方法〕用离子交换柱层析法分离AFP，利用反相高效液相色谱法进一步纯化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析确定相对分子质量.〔结果〕从棒曲霉菌培养上清液中分离出1种具有抗真菌活性的AFP，纯化后得到高活性的精制AFP，相对分子质量约为8ku，MTT法测定结果表明AFP对5种真菌均具有明显的抗真菌作用.〔结论〕棒曲霉菌培养上清液中含具有抗真菌活性的AFP.　〔关键词〕棒曲霉菌;

2、分离;真菌蛋白类ABSTRACT:OBJECTIVETopurifythepeptideAspergillusclavalusdesmculturefluid.METHODSThepeptidenchromatographyandfurtherpurifiedbyreversephaseHPLC，andthemolecularinedbytricinegelelectrophoresis.RESULTSAkindofpeptideolecularethodshoculturefluid.Key;dissectio

3、n;fungalproteins真菌在自然界分布广泛，其中有些真菌可使人致病，而在有些真菌中则可提取抗生素或防腐剂等.本文从棒曲霉菌（Aspergillusclavalusdesm）培养上清液中分离得到具有抗真菌作用的肽类物质真菌抑制肽（antifungalpeptide，AFP），旨在为抗菌药物及防腐剂的开发提供依据.　1材料与方法1.1材料棒曲霉菌菌种由韩国科学技术研究院生命工学研究所提供;CM-Sepharose离子交换树脂为瑞典Pharmacia公司产品;YPD，YM培养基及MTT试剂为美国DIFCO公司

4、产品.超滤浓缩系统为Millipore公司产品;700型高效液相色谱仪和500型酶标仪为美国BIORAD公司产品;全自动层析仪为北京应用新技术研究所产品.　1.2方法1.2.1粗提液的制备将棒曲霉菌置于YPD培养液中，振动培养（30℃）72h，取上清液用超滤方法（膜截留分子质量为30ku）除去大分子蛋白，取滤过液，4℃保存，待进一步纯化.1.2.2CM-Sepharose离子交换柱层析用0.1mol/LTris-HCl（pH值为7.0）缓冲液，将CM-Sepharose柱（30cm×26cm）洗柱平衡，待稳定后将

5、粗提液上柱，速度为80mL/h，完毕后用0.1mol/LTris-HCl（pH值为7.0）缓冲液洗柱，然后用含1.0mol/L氯化钠的0.1mol/LTris-HCl（pH值为7.0）缓冲液进行洗脱，利用紫外分光光度仪于波长280nm处进行检测，记录洗脱曲线，收集出现峰值的洗脱液.1.2.3反相高效液相色谱法（RP-HPLC）色谱柱为C18反相柱;流动相:A液为0.5g/L三氟乙酸，B液为800mL/L乙腈加0.5g/L三氟乙酸，流动速度为1.8mL/min，检测波长为214nm.将离子交换层析后收集的洗脱液经除

6、盐浓缩后上柱，每次进样量为10μL，梯度洗脱，分别收集洗脱峰，冷冻干燥，冻干品即为AFP样品〔1〕.1.2.4聚丙烯酰胺凝胶电泳主要组成为160g/L聚丙烯酰胺（含5g/LN，N-亚甲基双丙烯酰胺），110g/L甘油，1g/LSDS.电极负极缓冲液为0.1mol/LTris-甘氨酸（pH值为8.2，含1g/LSDS）缓冲液，正极为0.2mol/LTris缓冲液（pH值为8.9）.25mA电泳6h，行弱酸性艳蓝G染色.1.2.5抗真菌活性测定采用MTT法进行〔2〕，即取烟曲霉菌、黑曲霉菌、白色念珠菌及茄病镰刀菌4种

7、菌，分别用YM培养液加至96孔平底培养板上，每孔0.1mL，菌数为2×108个/L，待稳定后向每孔加入倍比稀释的AFP样品，作用24h（30℃），每孔加入10μLMTT溶液，继续培养4h，每孔加入200g/LSDS溶液20μL，作用2h，用酶标仪于波长405nm处检测吸收值.　2结果粗提后的AFP样品经CM-Sepharose柱层析后，收集1个大洗脱峰（图1）.RP-HPLC梯度洗脱得3个洗脱峰，其中峰1的峰值最高且对称，单独提取峰1并测定抗真菌活性，证实为高度纯化的AFP（图2）.聚丙烯酰胺凝胶电泳分析发现，在

8、相对分子质量约为8ku处AFP样品有一明显的蛋白带（图3）.抗真菌活性测定结果示从棒曲霉菌中分离纯化的AFP对4种真菌均具有抗真菌效应，其中对曲霉菌属和念珠菌的抗真菌效应优于对镰刀菌，见表1.图1CM-Sepharose离子交换柱层析洗脱图（略）图2反相高效液相色谱法洗脱峰（略）　3讨论本文应用离子交换层析法，首次从棒曲霉菌培养上清液中分离出具有抗真菌活性的多肽AFP，并