玄参对心室重构大鼠血管紧张素ⅱ及其1型受体基因表达的影响

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1、玄参对心室重构大鼠血管紧张素Ⅱ及其1型受体基因表达的影响【摘要】　　目的探讨玄参对心室重构大鼠血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）及其1型受体基因表达（AT1AmRNA)的影响。方法采用甲状腺素致大鼠心室重构及腹主动脉不完全结扎致大鼠心室重构两种动物模型，观察玄参对心脏指数（heartRNA）表达水平的影响。结果与模型组相比，玄参可显著降低动物HethodsTodelingmodelsinalaorticstenosisinrats.TheheartRNAexpressioninedafteraperiodofXuanshenadministration.Resultsparedodelingrats,

2、theH9700）；电泳仪（复旦科技，型号：FR-250）；凝胶成像（上海天能科技有限公司，型号：Tanon2500）；Biohit移液枪、Eppendorf移液枪。　　1.3药品试剂　　玄参（批号：060913），产地浙江，上海养和堂中药饮片有限公司；L-甲状腺素（L-Thy）（产品批号：1131479），Sigma公司；卡托普利（批号：060804），上海衡山药业有限公司；血管紧张素Ⅱ试剂盒（批号：20061230），北京北方生物技术研究所；考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（批号：20070104），南京建成试剂公司；醛固酮放免试剂盒（批号：061220），北京北方生物技术研究所；2×PCRMa

3、sterMix（批号：2007040822），上海欣百诺生物科技有限公司；RevertAidtTMFirstStrandcDNASynthesisKit,K1622（批号：00022047），Fermentas公司，上海中晶代理。　　1.4玄参药液制备玄参用8倍量水煎煮3次，每次微沸30min，合并滤液浓缩，冷藏备用。实验用量按每千克给予的生药量计算。　　1.5模型制备及分组给药　　1.5.1抗L-甲状腺素致大鼠心室重构观察选用220～250g的雄性SD大鼠50只，随机分为5组，每组10只，分别为：正常组、模型组、卡托普利组、玄参小剂量组和玄参大剂量组。除正常组外，各组连续7d腹腔注射L-甲

4、状腺素0.25mg·kg-1·d-1，1次/d，造成心室重构模型；正常组腹腔注射等量生理盐水。各给药组在给予L-甲状腺素后灌胃给予卡托普利40mg·kg-1或玄参水煎液13.5，27g·kg-1；正常组、模型组灌胃给予等量蒸馏水。连续灌胃给药9d后，于处理前禁食不禁水12h，然后取血和心肌进行各项分析。大鼠心肌肥厚指数的测定：大鼠称体重（Bg,加入2ml生理盐水在冰浴环境中快速匀浆，3500r·min-1离心10min，取上清200μl加生理盐水800μl，制备成2%的心肌组织匀浆，按血管紧张素Ⅱ试剂盒说明书及考马斯亮蓝蛋白测试盒说明书进行操作测定AngⅡ及蛋白浓度。结果以每毫克蛋白中的An

5、gⅡ含量表示。　　1.5.2抗腹主动脉缩窄致大鼠心室重构观察大鼠用戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉，仰位固定，打开腹腔，钝性分离腹主动脉，用内径为0.5mm的银夹不完全结扎左右肾动脉之间的腹主动脉，使之外径狭窄至0.5mm，制备压力超负荷性心室重构模型。假手术组动物仅分离腹主动脉后不做结扎。术后肌肉注射青霉素1×104U·kg-1·d-1,共3d,预防感染。　　造模后2周手术组大鼠随机分组，每组10只。给药1次/d，连续给药8周。玄参小剂量组灌胃给予玄参水煎液13.5g·kg-1；玄参大剂量组灌胃给予玄参水煎液27g·kg-1；卡托普利组灌胃给予卡托普利水溶液40mg·kg-1；假手术组

6、和模型组大鼠灌胃给予等量蒸馏水。　　心脏指数：给药8周后，动物称重，颈动脉取血处死后，快速打开胸腔，分离心脏称重如前“大鼠心肌肥厚指数的测定”项下所述。　　心肌组织AngⅡ含量测定:取大鼠的心肌组织测AngⅡ含量，步骤如前“心肌组织AngⅡ含量测定”项下所述。血清醛固酮（ALD）含量测定：取血，静置1h后，3500r/min离心10min取上清液，按醛固酮试剂盒说明书进行操作。心肌组织AngⅡ受体1型基因（AT1AmRNA）的表达水平观察：提取总RNA及逆转录反应:每组取5个心肌标本，每个约100mg，Trizol试剂盒提取总RNA，取2μg总RNA逆转录合成cDNA，－20℃保存。所有引物

7、均由上海生物工程技术有限公司合成。表1β-actin，AT1A引物序列（略）PCR反应：以稀释10倍后的cDNA为模板，用目的基因引物进行PCR反应，同时设β-actin作为内参，并根据实测的基因的mRNA丰度建立最佳循环数，优化反应条件。在冰上配制如下反应体系。见表2。表2PCR反应体系配制表（略）配制完毕，放入PCR仪中进行如下反应：95℃预变性5min；进行29个循环：95℃变性30s；55℃退火30s