mtt法分析含药血清对体外培养肺癌细胞增殖的影响论文

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1、MTT法分析含药血清对体外培养肺癌细胞增殖的影响论文.freelonarygiantcellcarcinoma，PG）的低转移亚系LH7（PGLH7）［1］由北京大学医学部病理系提供。1.1.2主要试剂及设备RPMI1640（美国GIBCO），胰蛋白酶（美国SIGMA）;噻唑蓝（美国SIGMA）;二甲基亚砜（北京北化精细化学公司）。高速低温离心机（美国SIGMA）;超净工作台（北京半导体设备一厂）;CO2恒温孵育箱（法国Jouan）。1.2实验方法1.2.1药物制备及剂量莪术瓜蒌汤（简称“莪瓜汤”）由莪术、天龙、沙参、全瓜蒌、龙葵组成，购于湖北中医学院附属医院。

2、将上述中药饮片置煎煮容器内，加水浸泡，煮沸，过滤浓缩，用蒸馏水倍比稀释成含生药2.10g/ml、0.70g/ml、0.23g/ml的水煎剂，分别作为高、中、低剂量灌胃药液。根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”［2］，本实验所选具体剂量为:家兔用药量（g.kg-1.d-1）=人日用剂量×0.07/1.5（g.kg-1.d-1）。莪术瓜蒌汤剂量标准为3.50（g.kg-1.d-1）。中剂量:为上述标准剂量;高剂量:为标准剂量的3倍;低剂量:为标准剂量的1/3倍。1.2.2含药血清的制备健康家兔16只（湖北中医学院动物房提供），雄性，体重1.8kg～2.0kg

3、。随机分成4组:空白对照组、莪瓜汤低剂量组、莪瓜汤中剂量组及莪瓜汤高剂量组。给药前禁食10～12h，不禁水。各组家兔于每日早、晚各灌胃给药一次，每次2.5ml/kg，共2次。按通法方案制备含药血清［3］，实验分组:对照兔血清组、莪瓜汤低剂量血清组、莪瓜汤中剂量血清组、莪瓜汤高剂量血清组、ATRA血清组。同组血清混合，56℃水浴中灭活30min，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，置-20℃保存备用。1.2.3人肺癌细胞的培养PGLH7细胞株，用含10%热灭活新鲜小牛血清的RPMI1640于37°C、5%CO2孵育箱中培养。生长旺盛的细胞每2天传代一次。1.2.4M

4、TT法检测癌细胞生长抑制率用胰酶消化细胞，用常规培养基配成细胞悬液种入96孔板，板周边的孔不加细胞，防止有边缘效应。留空白孔调零，以只加培养液不加细胞作空白对照。在37℃、5%CO2的培养箱内培养24h后，分别加入不同剂量的含药血清和对照血清。每组设4个平行孔，继续培养24h，加入MTT溶液20ul继续培养4h，终止培养，弃培养液，加入二甲基亚砜（dimethylsulfoxide，DMSO）150ul/孔，振荡，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度A值，比色时以空白孔调零。按照上述同样方法检测培养48h、72h的A值。根据公式计算细胞生长抑制率:细胞生长抑制率=（

5、空白对照组A值-实验组A值）/空白对照组A值×100%。1.3统计学分析数据处理采用方差分析。2结果10%的含药血清作用PGLH7细胞24h、48h和72h的吸光度值见表1。由表1可以看出:莪术瓜蒌汤低、中剂量血清组与对照血清组之间的PGLH7细胞吸光度差异无统计学意义，而莪术瓜蒌汤高剂量血清组则与对照血清组之间的吸光度差异有显著统计学意义（P0.01）;同时可以看到高剂量血清组随着作用时间的延长，其吸光度逐渐降低，抑制率逐渐增高，但无统计学差异。上述结果提示，10%莪术瓜蒌汤高剂量血清组对PGLH7细胞的增殖可能具有明显的抑制作用，并有随时间延长而作用愈明显的

6、趋势。表1莪术瓜蒌汤含药血清作用不同时间对PGLH7细胞增殖的影响注:*与同一时点对照血清组比较，P0.01。3讨论“莪术瓜蒌汤”是名老中医邱幸凡教授治疗肺癌的主要方剂，是根据“痰瘀浊气凝结于肺”的病理特点而立法、组方、用药的，临床治疗肺癌取得了一定疗效。中药复方多数是通过口服而起作用的，用中药粗制剂直接加入离体反应体系中进行实验研究，在方法学上存在很多问题，如中药中的杂质成分、各种电解质或鞣质、以及不同酸碱度的影响等，都会对实验结果造成一定的影响。中药血清药理学实现了体外实验和体内实验的较好结合，在方法学上具有创新性，可以排除以上各种因素的影响，比较接近药物体

7、内环境中产生药理效应的过程，目前是研究中药药理学的一种较为理想的方法［4］。为了减少因种属差异而造成的免疫反应，实验动物应尽量选用与人类生物学特性近似的物种，以家兔和大鼠为首选。李仪奎等［3］提出中药血清药理研究的通用给药方案（通法）并给出增大给药剂量以部分地弥补含药血清被稀释，较好地控制实际加入反应体系中含药血清的药量。在体外培养体系中宜采用同种单一血清，且含药血清在培养液中的浓度一般不能超过20%，其中以10%的浓度为最佳条件。MTT显色法［5］是近几年评价肿瘤细胞生存状态较受推崇的方法之一。当肿瘤细胞在光镜下尚未出现明显外形变化时，其活细胞的线粒体内琥珀酸

8、脱氢酶可还原MTT而形成