stat3信号转导通路调控bcl2成员表达及抑制结肠癌细胞凋亡的机制论文

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1、Stat3信号转导通路调控bcl2成员表达及抑制结肠癌细胞凋亡的机制论文马向涛，余力伟，王杉，张在兴，杜如昱，崔志荣【摘要】目的转录信号转导子与激活子3（Signaltransducersandactivatorsoftranscription3,Stat3）通路受细胞因子与生长因子的刺激而活化，参与调节细胞的增殖、分化与凋亡，探讨Stat3反义寡核苷酸诱导结肠癌细胞凋亡的作用机制。方法用阳离子脂质体介导Stat3反义寡核苷酸转染人结肠癌HCT116细胞.freelilyMembersandPr

2、omotesSurvivalofHumanColonCancerCellsAbstract：ObjectiveSignaltransducerandactivatoroftranscription3(Stat3)isactivatedinresponsetocytokinesandgroulation,andactivationofStat3isinvolvedinmodulatingcellproliferation,differentiationandapoptosis.Thepurposeo

3、fthestudyinecoloncancercelllinestodetermineportantroleintheprocessofapoptosisincoloncancercells.MethodsProteinlysatescoloncancercells.HumancoloncancercelllineHCT116ediatedbyliposome,MTTassayeasuretheproliferation,floetryeasuredbyilymembers.ConclusionC

4、onstitutiveactivationofStat3isassociated；Signaltransductionpathine2000（美国GIBCOL/BRL公司），转染过程参照GIBCOL/BRL公司手册。1.4细胞增殖状态检测（MTT法）取第3～6代生长状态良好的对数生长期细胞，常规消化、分离、收集细胞、细胞计数及测定细胞活力，活细胞率达95%，按每孔4.0×105个细胞接种于96孔板中，贴壁后，无血清培养细胞16～24h，使细胞同步化。实验分为以下4组：（1）空白对照加无血清培养组；

5、（2）正义寡核苷酸组；（3）错配寡核苷酸组；（4）反义寡核苷酸组，每个研究点设置3组平行对照，重复3次实验取平均值。分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，浓度分别为0、5、10、20μM，第0、24、48、72h分别加入MTT5mg/ml（美国Sigma公司），继续培养4h，每孔加入DMSO200ml，酶标仪测定540nm吸收值，绘制生长曲线，见图1。1.5细胞周期检测细胞同步化后分别加入脂质体及Stat3正义寡核苷酸、错配寡核苷酸与反义寡核苷酸继续培养，第0

6、、24、48、72h分别消化细胞，0.5mlPBS重悬细胞，70%冰乙醇固定细胞过夜，加入RNAaseA至终浓度50mg/ml，37℃恒温水浴1h，加入PI（美国Sigma公司）至终浓度50mg/ml，4℃避光染色1h，上流式细胞仪FACScan（美国BectonDickinson公司）检测，资料用CellQuest细胞周期分析软件处理。1.6细胞凋亡检测同步化处理及单细胞悬液制备同前，应用凋亡检测试剂盒，PBS离心洗涤2次，200ml结合缓冲液重悬，加入ANNEXTINVFITC至终浓度1m

7、g/ml，加入PI至终浓度2.5mg/ml，室温避光染色15min，上流式细胞仪检测。1.7cl1、Caspase3抗体（美国SantaCruz公司），工作浓度1∶1000，GAPDH作为内参照，辣根过氧化物酶结合的二抗，工作浓度1∶1000。用ECL化学发光试剂盒检测杂交信号。1.8吸光度测定用PhosphoImager图像分析仪（美国MolecularDynamics公司）测定条带的吸光度（A值），以A值代表蛋白的相对表达量。1.9统计学方法应用SPSS12.0统计学软件，采用t检验，P0

8、.05差异有统计学意义。2结果2.1Stat3反义寡核苷酸可以抑制结肠癌细胞增殖Stat3反义寡核苷酸作用HCT116细胞72h后，G1期细胞比率由68.9%上升至85.6%，S期细胞比率由15.4%下降至7.6%，细胞增殖受抑制，见图2。2.2Stat3反义寡核苷酸可以促进结肠癌细胞凋亡HCT116细胞在转染Stat3反义寡核苷酸72h后，凋亡细胞百分比由5.6%增加至27.5%，见图3。2.3Stat3反义寡核苷酸可以使Stat3信号传导通路成员活性与表达下降HCT116细胞转