感染性疾病的分子诊断

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1、第八、九章感染性疾病的分子诊断感染的慨念感染是病原体和人体之间的相互作用过程病原微生物：致病菌（条件致病菌）微生物人体微生物人体不同的感染状态共生状态在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生感染性疾病：由某种病原体所致，通过不同方式引起人体发生感染并出现临床症状的疾病。病原体：病毒、细菌、原虫、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体、寄生虫。常规检测方法：免疫学方法微生物学方法受敏感性、特异性限制，不易早期诊断，并且不易提供病原体分型及耐药性方面的信息。感染性疾病的分子诊断策略一般性策略（检出病原体）：判断有无感染是何种病原体感染

2、常用方法：PCR＋杂交完整性策略：检出病原体分型（分类）－亚型－耐药性常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序感染性疾病分子诊断标志物病原体核酸分子（DNA/RNA）基因表达产物代谢物免疫应答分子细胞免疫体液免疫TT致敏T细胞淋巴因子B浆细胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出现临近恢复期出现与原虫和蠕虫感染有关二、感染性疾病分子诊断的常用方法根据目的基因是否被放大，可分为杂交法和扩增法。信号放大技术检测方法靶分子数目不变，而检测的探针信号放大采用多酶、多探针或二者结合等方法来增加探针标志物的浓度使检测信号得到放大。靶分子扩增

3、技术检测方法靶分子（RNA、DNA或探针）的扩增PCR、替代扩增、LCR等引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNAcDNA模板5'5'3'3'5'3'引物BRNAseHRTT7RNA聚合酶100-1000RNA扩增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A3'5'5'RNAseHRNARNAcDNAcDNA图8-3NASBA原理示意图引物A5’端带有T7RNA聚合酶结合位点，3’端碱基与靶RNA3’端序列互补;引物B的碱基序列与cDNA3’端序列互补nucleicacidsequence-bas

4、edamplification(NASBA)NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。引物A靶RNA引物BRNAcDNART3'5'5'5'3'5'3'5'3'cDNAcDNA模板5'5'3'3'5'3'引物BRNAseHRTT7RNA聚合酶100-1000RNA扩增子5'3'5'3'3'5'3'5'引物A3'5'5'RNAseHRNARNAcDNAcDNA图8-3NASBA原理示意图引物A5’端带有T7RNA聚合酶结合位点，3’端碱基与靶R

5、NA3’端序列互补;引物B的碱基序列与cDNA3’端序列互补nucleicacidsequence-basedamplification(NASBA)NASBA的特点为操作简便，不需特殊仪器，不需温度循环。整个反应过程由三种酶控制，循环次数少，忠实性高,其扩增效率高于PCR，特异性好。三、感染性疾病分子诊断的标本处理标本采集处理主要包括选择合适的标本种类、标本量、抗凝剂等及对标本进行合适的传送、保存和预处理。四、感染性疾病分子诊断的结果解释1.阴性结果假阴性可能性方法的灵敏度太低方法失败目标分子2.阳性结果假阳性可能性方法的特异性受到

6、污染3.定性检测结果有时不能提供病原体活力相关信息临床治疗病情缓解后一定时间内，在患者样本中仍可以检测出相应的病原体。有些病原体潜伏在进体内，没有临床症状。4.疾病状况的判断检测出病原体的存在并不能说此病原体就是引起疾病的直接原因。该病原体可能是一种正常菌群五、感染性疾病分子诊断的临床应用及评价用于感染性疾病治疗的监控和预测、病情发展过程的危险性评价及疾病预后等。耐药性的检测细菌的分型流行病调查第一节病毒的基因检测人类许多感染疾病由病毒引起，如病毒性肝炎、脑炎、流行性感冒等等，占人类传染疾病的75%左右。400多种不同病毒。病毒结构：

7、大小：20-300nm核心区：核酸（DNA或RNA）外周衣壳：蛋白质包膜：脂质（镶嵌有蛋白质）我国是HBV高流行区，50%－70%的人受过感染，8%－10%是HBV携带者，肝炎患者中60%是慢性肝炎患者，导致肝硬变，HBV又与原发性肝癌密切相关。外壳（HBsAg):外壳蛋白成分为表面抗原核心（HBcAg)：DNADNA聚合酶HBcAg一、乙型肝炎病毒Dane颗粒（完整的病毒）形态HBsAgHBcAgHBVDNADNAPol（外膜蛋白）（核衣壳蛋白）完整的乙肝病毒颗粒直径42纳米由双层外壳和一个核心组成的，核心直径为27纳米，内含DNA

8、双链和DNA多聚酶（一）病毒基因组结构3.2kb双链DNA病毒不完全双连环状DNA长链L为负链：有4个开放阅读框S、C、P、XS区编码外膜蛋白（HBsAg）C区编码HBeAg、HBcAgp区编码DNA聚合酶X区位编码X蛋