激活的acm对鱼藤酮诱导的细胞氧化损伤的抑制作用

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1、激活的ACM对鱼藤酮诱导的细胞氧化损伤的抑制作用刘辉尹芳秋高秋菊郭魁亮陈盛鹏刘杰贺森【摘要】目的观察激活的星形胶质细胞条件培养液(ACM)在鱼藤酮所致PC12细胞氧化损伤过程中的作用。方法收集激活的ACM，加入到鱼藤酮染毒PC12细胞中，观察其对染毒神经元胞内丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性的影响，并检测细胞活性氧(ROS)水平和线粒体呼吸链复合物Ⅰ的活性变化。结果ACM可明显降低染毒PC12细胞MDA和ROS水平;与完全培养基处理比较，ACM能有效增加染毒神经元SOD和GSHPx的合成和释放，保护和提高抗氧化酶活性。结

2、论ACM能有效抑制鱼藤酮诱导的PC12细胞氧化损伤。【关键词】星形胶质细胞条件培养液;鱼藤酮;氧化损伤研究发现，长期接触农药鱼藤酮是引起帕金森病(PD)等神经退行性疾病的重要环境诱发因素之一〔1〕。鱼藤酮属线粒体抑制类农药，由其引发的线粒体功能障碍及氧化应激与多巴胺能神经元受损密切相关〔2〕，而线粒体功能障碍主要原因是复合物Ⅰ活性被抑制。星形胶质细胞是体内产生神经营养因子的主要细胞，激活的星形胶质细胞条件培养液(ACM)中含有神经生长因子和胶质源性神经营养因子等多种神经营养成分〔3〕。本研究应用睫状神经营养因子(TF)激活星形胶质细胞，收集ACM处理正常及不同浓度鱼藤酮染

3、毒的PC12细胞，观察ACM对鱼藤酮诱导的神经元氧化损伤的保护作用，为阐明星形胶质细胞在神经退变过程中的作用提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1主要试剂和仪器鱼藤酮(纯度97.6%)、DCFDA购自Sigma公司，DMEM/F12培养基购自Gibco公司，睫状神经营养因子购自Peprotech公司，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所;MPF4荧光分光光度计购自Hitach公司，激光共聚焦显微镜购自Leica公司。　　1.2星形胶质细胞培养及ACM收集SD新生大鼠断头取中脑组织，按照

4、McCarthy〔4〕所述方法分离和纯化星形胶质细胞，经3次传代后常规免疫组化GFAP染色鉴定。用含有TF(40ng/ml)的DMEM/F12无血清培养基孵育12h，收集培养液，4℃，4000r/min离心5min，取上清即获得ACM。　　1.3染毒PC12细胞内MDA、SOD和GSHPx活性测定PC12细胞接种于12孔板中，于对数生长期加入鱼藤酮工作液处理，随机分成对照组、0.1、0.5、1.0μmol/L鱼藤酮组，各实验组分别用完全培养基和ACM进行处理，继续培养24h后，按试剂盒说明书操作进行活性检测。　　1.4染毒PC12细胞线粒体活性氧簇(ROS)的检测PC1

5、2细胞干预和分组同上，用100μmol/LDCFDA避光孵育30min，经PBS漂洗后，激光共聚焦显微镜记录各孔荧光强度(激发波长485nm，发射波长530nm)，荧光强度与ROS水平成正比，增加的荧光强度即被认为是增加的活性氧。　　1.5染毒PC12细胞线粒体复合物Ⅰ活性的检测PC12细胞干预和分组同上，将处理后的细胞用预冷的PBS漂洗2次，此后加入预冷的8mg/ml毛地黄皂苷溶液，冰浴10min，以10000r/min，4℃，离心5min，弃上清，立即用100μl氨基乙酸缓冲液溶解，再加入10%十二烷基麦芽苷溶液20μl，冰浴5min，以20000r/min，4℃，

6、离心30min，上清液蛋白质定量后取样品10μl进行线粒体复合物Ⅰ活性测定〔5〕，重复5次，取平均值。　　1.6统计学处理实验数据用x±s表示，采用SPSS11.0软件进行组间t检验。　　2结果　　2.1星形胶质细胞的培养、纯化和鉴定分离培养并纯化的星形胶质细胞经GFAP免疫组化染色发现，培养至第三代的星形胶质细胞纯度可达95%以上，符合实验设计需求。　　2.2ACM对染毒PC12细胞内MDA、SOD和GSHPx活性的影响用完全培养基处理的染毒PC12细胞内MDA含量显著增加，SOD和GSHPx活性随染毒剂量的增大而随之下降。与完全培养基处理比较，ACM培养染毒神经元

7、后，各实验组MDA含量明显下降(P0.01);0.1和0.5μmol/L鱼藤酮组SOD和GSHPx活性显著升高(P0.05)，见表1。　　2.3ACM对染毒PC12细胞ROS水平的影响完全培养基处理的染毒PC12细胞ROS荧光强度明显增强，而与之比较，ACM培养的0.5和1.0μmol/L鱼藤酮组PC12细胞ROS平均荧光强度显著降低(P0.05)，见表2。　　2.4ACM对染毒PC12细胞线粒体复合物Ⅰ活性的影响线粒体复合物Ⅰ活性随染毒剂量的增大明显降低。与完全培养基处理比较，ACM培养染毒神经元后，各实验组线粒体复合物Ⅰ