植物乳杆菌亚油酸异构酶基因的定点突变的分析

《植物乳杆菌亚油酸异构酶基因的定点突变的分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、------------------摘要共轭亚油酸(conjugatedlinoleicacids简称CLA)是一种具有多种生理活性的天然脂肪酸，CLA具有抗癌、降低胆固醇、增强机体免疫力等多种生理功能。亚油酸异构酶可将亚油酸转化为生物活性的CLA。目前，亚油酸异构酶的结构和性质的研究以及利用生物工程和基因工程对亚油酸异构酶进行有效地改造已成为热点。但是在微生物发酵生产CLA的代谢途径和机理方面研究甚少，有待进一步深入研究。本实验以植物乳杆菌（Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumP8）基因组为

2、模板，设计引物，通过PCR扩增得到亚油酸异构酶基因，将其克隆到pMD19-T载体测序鉴定后，再亚克隆到表达载体pQE30中，双酶切鉴定表达载体pQE30-LAI成功构建。用http://www.ncbinlm.nih.gov/blast和vecterNTI等软件工具对亚油酸异构酶进行生物信息学分析并预测酶关键氨基酸，预测结果确定亚油酸异构酶的必要氨基酸为193位苯丙氨酸，将其定为突变位点，改变578位碱基T为C，将苯丙氨酸极性氨基酸突变为非极性氨基酸丝氨酸。设计突变引物，以重组质粒pQE30-LAI为模板，用Transgen公司开

3、发的QuickChange定点突变试剂盒进行定点突变，成功构建突变载体pQE30-F193LAI。突变前后的亚油酸异构酶在大肠杆菌中经IPTG诱导表达，分别用提取的粗酶和菌体直接催化测定酶活力，酶催化的结果分别为野生型1999.79U/ml，突变型1564.53U/ml，菌体催化的结果分别为野生型117.11U/ml，突变型87.96U/ml。两种结果均表明，重组菌pQE30-LAI的酶活力大于突变后重组菌pQE30-F193LAI，表明突变体表现出了酶活被破坏的特性，193Phe位点在酶的催化过程中都发挥着不可替代的作用。将表达

4、的野生型和突变型的酶提取后检测，结果表明，野生型和突变型均有68KD的条带，说明亚油酸异构酶均得到表达。关键词：亚油酸异构酶；表达载体构建；定点突变----------------------Site-DirectedMutagenesisofLinoleateIsomeraseGenefromLactobacillusPlantarumAbstractCLA(conjugatedlinoleicacids)isanaturalfattyacidswithavarietyofphysiologicalactivities,such

5、asanti-cancer,loweringcholesterol,enhancingimmunity.LinoleateisomerasecanconvertlinoleicacidintobiologicallyactiveCLA.Atpresent,theresearchesoflinoleicacidisomerasestructureandpropertiesandtransforminglinoleicacidisomeraseeffectivelywithbiologicalengineeringandgenetic

6、engineeringtechniqueshavebecomeahotspot.However,itisstilltomakefurtherstudyforfewerresearchesinthemetabolicpathwayandmechanismofmicrobialfermentationproductionofCLA.Inthisstudy,theLactobacillus(Lactobacillusplantarumsubsp.plantarumP8)genomewasselectedasatemplate,thenp

7、rimersweredesignedandlinoleicacidisomerasegenewasamplifiedwithPCR.ThePCRproductionwasclonedintothevectorpMD19-Ttoidentifythesequence,thenitwassubclonedintotheexpressionvectorpQE30.ItshowedtheexpressionvectorpQE30-LAIwassuccessfullyconstructedbydoubleenzymedigestionana

8、lysis.Usingthesoftwaretoolsuchashttp://www.ncbinlm.nih.gov/blastandvecterNTI，bioinformaticanalysisoflinoleicacidisomerasewas