《目基因克隆》ppt课件

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1、第五章目的基因的克隆周毅峰2011年春目的基因的克隆D利用PCR分离目的基因的方法CcDNA文库法A鸟枪法E化学合成法B基因文库法基因工程或DNA重组技术三大用途的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因，目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是

2、利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。A鸟枪法鸟枪法克隆目的基因的基本战略鸟枪法操作的改进鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的基本战略随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目的基因的目的重组子，进而获得目的基因。鸟枪法适用于原核细菌目的基因的克隆分离鸟枪法克隆目的基因的基本战略染色体DNA的切断超声波处理：片段长度均一，大小可控，平头末端全酶切：片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控部分酶切：片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整与载体连接如果转化子采用菌落原位杂交法

3、或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为转化受体细胞受体细胞；如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞筛选含有目的基因的目的重组子菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）鸟枪法操作的改进使用这一改进方法的前提条件是：目的基因的酶切图谱已知。如果已知目的基因两端的酶切口，可用该酶处理染色体DNA，然后与载体拼接，这样可以保证目的基因的完整性，从而提高重组子中目的重组子的出现频率使用特征性限制性内切酶切开染色体DNA鸟枪法操

4、作的改进例如，已知某目的基因位于1.8kb的SalI片段中，将染色体DNA用SalI切开，琼脂糖凝胶电泳分离，用刀片切下相当于1.6-2.0kb大小区域内的凝胶块，从此凝胶块中回收DNA片段，然后与载体进行拼接在连接前将DNA片段进行分级分离2.0kb1.6kb1.8kb鸟枪法操作的改进冻融法滤纸法吸附法低融点凝胶法溶解法凝胶DNA片段回收技术鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构B基因文库的构建基因文库的基本概念基因文库的构建程序基因组文库重组克隆的排序基因文库的基本概念基因库与基因文库基因库（ge

5、nepool）特定生物体全基因组的集合（天然存在）基因文库（genelibraryorgenebank）从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式基因组文库（含有全部基因）存在（人工构建）。根据构建方法的不同，基因文库分为：cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）基因组DNA文库(genomiclibrary)：指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，与合适的载体体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性生物群落cDNA文库(cDNAlibrary)：指将某生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆

6、载体重组，贮存于受体生物群体中，这样的生物群体称为cDNA文库根据构建文库所用的载体不同可将基因文库分为质粒文库噬菌体文库黏粒文库人工染色体文库M13phagevector、λphagevector、P1phagevectoret.CosmidvectorYAC、BAC、PAC、TAC基因文库的基本概念基因文库构建的基本战略用鸟枪法构建基因组文库，材料来自染色体DNA用cDNA法构建cDNA文库，材料来自mRNA在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA种类不同（即基因的表达谱不同），因此同种生物体的cDNA文库一般还有组织细胞的界定，如肝组织cDNA文库或胚胎组织cDNA文

7、库等。很显然，cDNA文库的信息量远小于基因组文库基因文库的基本概念基因文库的完备性基因文库的完备性是指：在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：N=ln(1–P)/ln(1–f)其中：P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小例如，人的单倍体DNA总长为2.9x109bp，基因文库中克隆片段的平均大小为15kb，则构建一个完备