基因表达和基因重组

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1、基因重组和基因工程GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章概论基因重组：不同的DNA分子间发生共价连接形成重组DNA分子。重组DNA质粒DNA基因片段重组DNA技术发展史pSC101EcoRIBoyer和Cohen的实验Boyer和Cohen的实验pR6-5大肠杆菌pSC101pR6-5抗四环素抗卡那霉素EcoRI抗卡那霉素基因DNA连接酶重组DNA分子培养平皿四环素平板卡那霉素基因四环素卡那霉素基因大肠杆菌人体生长激素释放激素(SS)抑制和调节多种激素的作用从动物脑中提取:5mg---50万只羊

2、脑基因工程9升大肠杆菌培养液SS基因基因载体重组体分切接转筛表SS第一节DNA的重组DNARecombinationDNA重组接合作用(conjugation)转化作用(transformation)转导作用(transduction)转座(transposition)同源重组(homologousrecombination)位点特异的重组(site-specificrecombination)发生在同源序列间的重组称为同源重组(homologousrecombination)，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个D

3、NA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。一、同源重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用(transformation)。例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。（三）转导作用当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感

4、染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)例第二节重组DNA技术DNARecombinationTechnique相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理重组DNA技术与医学的关系本节主要内容一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平：分子克

5、隆(molecularclone)即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）DNA克隆应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称基因克隆或重组DNA(recombinantDNA)。生物技术工程:基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等目的①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）基因工

6、程(geneticengineering)——实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组DNA工艺学。（二）工具酶限制性核酸内切酶DNA聚合酶Ⅰ逆转录酶T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶TaqDNA聚合酶重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完

7、整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基限制性核酸内切酶定义限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用与甲基

8、化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。分类Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技术中常用Ⅱ型）第一个字母取自产生