dna重组实验步骤

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1、DNA重组实验步骤要求：1每个同学需要的3张照片参见黄色字体。2写实验报告的时候请将相应的试剂盒的实验步骤写入，本文仅作参考，不能照抄。试剂盒的说明书在实验室桌子上都有。第一组：目的基因：GAPDH甘油醛-3-磷酸脱氢酶：片段大小：496bp第二组：目的基因：Actin肌动蛋白，片段大小：约200bp1.总RNA的抽提（参照植物组织RNA提取试剂盒，本部分直接以提供材料开始，可以不写）所取材料经DEPC水（蚕体或组织）清洗后，添加液氮充分研磨；然后转入1.5mLEppendorf管，加入1mLTRIzol，振荡2min，室温静置5min；4℃，12000r/min离心5min，上清转入新的

2、Eppendorf管中；以每毫升TRIzol0.2mL氯仿的比例加入氯仿，振荡15s左右，室温放置5min，12000g，4℃离心15min；取上清液，加0.6mL异戊醇，颠倒混匀，静置10min；4℃，12000g离心10min，弃上清；加入1mL用DEPC水配置的75%乙醇洗RNA沉淀，室温晾干；将沉淀溶于50µLDEPC水中，-70℃保存备用。2．RNA反转录(参照RT-PCR试剂盒)在Eppendorf管中加入组织总RNA1μL，Oligo(dT)181μL，40U/μLRNaseInhibitor0.5μL，5×reactionbuffer4μL,2.5mmol/LdNTP2μL

3、,200U/μLRTaseM-MLV1μL,然后加DEPC水至20μL；42℃水浴1h，然后70℃灭活10min，此即为第一链cDNA产物。3.PCR扩增反应程序及加样体系(参照RT-PCR试剂盒)PCR扩增反应程序（上海生工试剂）：94℃预变性3min，94℃50s，55℃（根据引物适当改变）50s,72℃50s,30个循环。终延伸72℃10min。反应体系总体积25μL，反应体系中加入：ddH2O16.3μL10×PCRBuffer（withoutMg2+）2.5μL25mmol/LMgCl22.0μL2.5mmol/LdNTPmix1.0μLPrimer-s1.0μL（约20pmol

4、/L）Primer-a1.0μL（约20pmol/L）cDNA1.0μL（约2.0ng）TaqDNA聚合酶0.2μL（约1.0U）总体积25.0μL1.2%Agarose凝胶电泳，记录拍照结果。4.PCR产物的回收与连接DNA回收参照天根AgaroseGelDNAPurificationKit使用说明书。连接：在微型离心管中依次加入纯化PCR产物8µL（目的基因），pUC192µL，buffer4ul，dNPT1ul，T4连接酶1ul，水4ul，共20ul体系。11度20分钟后70度5分钟即可。5感受态细胞制备挑取大肠杆菌DH5A划线培养得到的单菌落；挑单菌落接种于3mLLB液体培养基过夜

5、培养，然后取30µL菌液接种于3mLLB液体培养基，37℃200r/min震荡培养至OD550达0.5左右（液体变浑浊即可）；将培养液转入1.5mL离心管，冰浴10min；4℃，3500r/min离心5min，弃上清；用预冷的75mmol/LCaCl2750µL轻轻悬浮细胞，冰浴30min；4℃，3500r/min离心10min，弃上清；加入200µL预冷的75mmol/LCaCl2轻轻悬浮细胞，冰浴4h以上，即成感受态细胞。6.连接产物的转化取200µl感受态细胞悬液，加入连接产物10µL，轻轻混匀，冰浴30min；42℃水浴1min，立即置于冰浴中2-3min，然后向离心管中加入1mL

6、37℃预热LB培养基，于37℃200r/min振荡培养1h，使细胞恢复正常生长状态；4℃，3500r/min离心5min，弃900µL上清，加入5µLX-gal(20mg/mL)和5µLIPTG（100mg/mL），轻轻悬浮细胞，将菌液均匀涂布在含Amp+抗生素的LB固体培养基上；正面放置1h使吸收完全，然后37℃倒置培养过夜。7．重组质粒的筛选观察蓝白斑结果（拍照记录，培养皿上有自己的名字，没有的本次实验重做），挑取单个独立的白色菌落（可将培养基平板放置4°C冰箱显色），分别接种于3mL含有相应抗生素的LB液体培养基上，37°C200r/min震荡培养过夜。8质粒DNA抽提（参照试剂盒）

7、质粒DNA小量制备试剂盒。9酶切反应在1.5mL的Eppendorf管中依次加入ddH2O10µL，10×Buffer2µL，质粒6µL，两种不同限制性内切酶各1µL，组成20µL酶切体系，37℃水浴反应2h。取酶切产物10µL进行1.0%Agarose凝胶电泳，用凝胶成像仪拍照记录。