盘外置管法注射胶原酶溶解髓核的实验分析

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1、上海第二医科大学硕士学位论文实验仪器l'LEICACM3050恒温冰冻切片机，LEICA公司2．SDJ一3超净工作台，上海淀山湖净化设备厂3．OLYMPUSAH2光学显微镜，OLYMPUS株式会社4．WZ一50G微型注射泵，浙江大学医学仪器厂5．TGL一16G离心机，上海医学分析仪器厂表1实验所用髓核的一般情况主要试剂l，鼠抗I型胶原单克隆抗体试剂，CHEMICON公司2．鼠抗II型胶原单克隆抗体试剂，CHEMICON公司3．鼠抗III型胶原单克隆抗体试剂，CHEMICON公司4．羊抗鼠，HRP／DAB二抗试剂盒，LA

2、BVISION公司5．注射用胶原酶1200u／瓶，乔源制药6，OCT包埋剂，LEICA公司7．胃蛋白酶，源聚生物科技公司8．多聚赖氨酸，博士德公司9．苏木素，FARCO公司上海第二医科大学硕士学位论文10．伊红，上海试剂三厂11．中性树脂，BDH公司髓核与胶原酶反应1．原理：临床上盘外置管法有多种穿刺途径，L3／4、L4／5采用椎间孔穿刺法，L5／Sl采用骶管裂孔穿刺法，穿刺成功后在髓核边缘留置导管，用微型注射泵控制速度，将胶原酶从导管缓慢推入，该方法能准确地将胶原酶注射到突出的髓核处(图1)。这次实验是胶原酶溶解髓核

3、的体外实验，我们把腰突症患者住院行髓核摘除术时所取出的髓核作为实验对象，模仿胶原酶盘外置管注射法，在髓核上滴注胶原酶溶液，并改变注药速度和给药剂量，观察短期内髓核的变化和胶原的分解(图2)。2．方法：实验所用的胶原酶是乔源公司生产的注射用胶原酶无菌冻干粉针剂，1200u／瓶，均为同一批号，使用时将1200u胶原酶用4m10．9％盐水溶解。实验所用的髓核是腰突症患者住院行髓核摘除术时所取出的髓核，共有7例，在获得髓核后立刻送至实验室，在无菌条件下，分成A、B、C、D四组，分别完成以下实验。取A组髓核放入特制容器中，放置于

4、超净台，在室温下，用微型注射泵控制滴速，将1200u胶原酶(4m1)以滴速为0．4ml／min均速滴加在髓核上，模仿临床上在手术室即刻推药法，10分钟推完，上海第二医科大学硕士学位论文滴完后再缓滴生理盐水，滴速为0．Olml／min，观察5天。取B组髓核放入特制容器中，放置于超净台，在室温下，用微型注射泵控制滴速，将1200u胶原酶(4m1)以滴速为0．Olml／min均速滴加在髓核上，模仿临床上置管缓慢滴注法，需6小时以上滴完，滴完后再缓滴生理盐水，滴速为0．Olml／min，观察5天。取c组髓核放入特制容器中，放置

5、于超净台，在室温下，用微型注射泵控制滴速，将2400u胶原酶(8m1)以滴速为0．4ml／min均速滴加在髓核上，模仿临床上在手术室即刻推药法，用2支胶原酶治疗大块突出的病人，滴完后再缓滴生理盐水，滴速为0，Olml／min，观察5天。取D组髓核放入特制容器中，用0．996生理盐水代替胶原酶，以滴速为0．Olml／min均速滴加在髓核上，持续观察5天。髓核反应完成后，用PBS缓缓冲液冲洗5分钟，将髓核至离心机离心1分钟，转速为2000次／分，离心后弃上清液，取出髓核进行下一步实验。图l胶原酶注射术穿刺示意图上海第二医科

6、大学硕士学位论文滴加胶原酶液及生理盐水髓核标本多余溶液流出图2胶原酶注射的体外实验示意图冰冻切片制作从四组反应后的髓核中分别取大小约0．5X0．5×0．5cm3样本，加适量OCT包埋剂浸没组织，将盛有组织块的小盒置于液氮杯约10秒钟，将髓核制成冻块，LEICACM3050恒温冰冻切片机切片，厚度5Hm。将玻片清洗干净后，涂上多聚赖氨酸以防止脱片，把冰冻切片附贴于玻片上，室温下自然干燥1小时，4％多聚甲醛磷酸缓冲液(PH7．4)浸泡，固定10分钟，干燥后贮存于低温冰箱内(一20oC)。HE染色冰冻切片至苏木精浸染3～5分

7、钟—卜自来水冲洗片刻—◆1％盐酸乙醇分化3～5秒—卜自来水冲洗15分钟—’碳酸锂饱和水溶液1～2分钟—◆自来水冲洗10分钟—◆0．5％伊红溶液浸染1～2分钟啼脱水，透明，中性树胶封片。观察结果：胶原纤维呈红色，上海第二医科大学硕上学位论文细胞核呈蓝色。免疫组化染色1．原理：鼠抗I、II、III型胶原单克隆抗体作为一抗，与髓核切片中的胶原成分反应，形成抗原一抗体复合物，用生物素化的羊抗鼠IgG二抗与一抗结合，再加入HRP标记的链霉亲和素，最后用DAB—H：0。显色。2．方法：(1)取出冰冻切片，室温下，加新鲜配制的0．3

8、％H20：甲醇溶液作用10～15分钟，PBS漂洗2次，每次3分钟。(2)胃蛋白酶消化：将含0．1％胃蛋白酶的0．01mol／L盐酸加入到样本，覆盖整个样本，37。C消化30分钟，PBS漂洗4次，每次3分钟。(3)一抗稀释：鼠抗I、II、III型胶原单克隆抗体用0．01mol／LPBS(PH7．4)稀释后备用。(4)一抗滴加：切片放