兔角膜上皮细胞用于热毒清滴眼液体外药效和安全性评价的可行性分析

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1、巴氏吸管杭州维特洁生化技术有限公司24、96孔细胞培养板杭州奥盛仪器有限公司DMEM粉、HamF12美国GIBICO公司10%胎牛血清及纯胎牛血清杭州四季青生物工程材料有限公司6.培养液的制备基本培养基为DMEM/F12（Gibico公司），另加入1.2g/LNaHCO3(pH为7.0～7.2)、10%U胎牛血清（杭州四季青公司）、10万/L青霉素（杭州华东制药厂）和100mg/L链霉素（杭州华东制药厂）。(二)实验方法1.建立细胞模型（1）兔角膜上皮细胞原代培养在新西兰大耳白兔耳缘静脉注入约10m

2、l空气，待兔死亡后，立即在无菌条件下取出U双眼球，浸入含有0.9%生理盐水和10万/L青霉素的溶液中15分钟。取出后用无菌纱布包绕兔眼，露出角膜，用直径7mm和9mm经消毒的环钻，在角膜上以瞳孔为中心各自轻轻捻转一圈，用眼科镊轻取两环状带之间的角膜上皮组织（图1）。将角膜上皮组织放入U含有10万/L青霉素和200mg/L卡那霉素D-Hank’s液中浸泡约30min，反复两次，预防细胞感染，并吸净D-Hank’s液。用无菌眼科剪将角膜缘组织剪成小块，用0.25%（W/V）胰蛋白酶与0.01mol/LE

3、DTA混合消化液消化到组织块变疏松（约10min），弃去消化液，加入含血清的培养基洗两遍，清除EDTA的消化作用。消化后的角膜缘组织块放入含少量纯胎牛血清的24孔培养板内，密闭培养2h。缓缓加入EDTA/F12培养基少量，置于5%～7%CO2和95%空气37℃培养箱中培养过夜。24h组织块贴壁后，再加入少许培养基，2天后移去角膜缘组织块，隔日纯化一次。纯化后较纯的角膜上皮细胞用0.25%（W/V）胰蛋白酶与0.01mol/LEDTA混合消化液，在5%～7%CO2和95%空气37℃培养箱中培养2～5m

4、in脱落角膜上皮细胞，加入含血清的培养基中止消化。经反复吹打，制成悬液，用805目不锈钢纱网滤过后，进行离心、复振、计数（计数为1×10个/ml），加入于96孔微量板（每孔100l）中培养，培养条件同上。（2）细胞纯化3万方数据用倒置显微镜观察，待原代培养细胞有生长晕形成后，将少量呈梭形生长的成纤维细胞做标记，弃除培养液，用自制的无菌细胞刮伸入到培养板中，刮除标记的空间，用D-Hank’s液漂洗2次，清除被刮除的细胞，注入培养液继续培养。隔日重复上述操作，直到培养的细胞成为较纯的角膜上皮细胞。2.

5、药物在兔角膜上皮细胞和猪肾细胞的细胞毒性对比将已长满单层的兔角膜上皮细胞和猪肾细胞，经消化计数后,分别制成细胞悬液，54调细胞浓度为2×10个/ml，接种于96孔培养板，2×10个/孔，置37℃，5%～7%CO2培养。取热毒清滴眼液用维持液2倍稀释成1：10（16000mg/L）、1：20（8000mg/L）、1：40（4000mg/L）、1：80（2000mg/L）、1：160（1000mg/L）、1：320（500mg/L）、1：640（250mg/L）、及1：1280（125mg/L）8种浓度

6、，分别加入于已长成单层的兔角膜上皮细胞和猪肾细胞的96孔微量板内，每浓度4孔，每孔100l，置于37℃5%～7%CO2条件下培养5天，观察CPE（细胞病变效应），以每孔50%以上细胞发生病变记为病变孔，分别测定热毒清滴眼液在兔角膜上皮细胞和猪肾细胞最大无毒浓度(TC0)。设正常细胞对照。3.药物在兔角膜上皮细胞和猪肾细胞的抗HSV-1病毒作用对比（1）病毒的毒种传代及病毒毒力测定将已长满单层的兔角膜上皮原代细胞和猪肾细胞，经消化计数后，分别制成细胞悬54液，调细胞浓度为2×10个/ml。接种于96

7、孔细胞培养板，2×10个/孔，置37℃5%～7%CO2培养。长满单层后，病毒株经无血清Eagla’s液溶解，分别接种于两种细胞。复壮三代后的病毒液部分置于液氮灌，余存-30℃。使用时在细胞培养内传代增毒，待病毒毒力稳-1-8定后收取病毒培养供实验用。用维持液以10～10稀释度将病毒稀释成８种浓度，分别加入96孔培养板内，每个浓度接种4孔，0.1m1/孔，吸附30min，洗3次，加入培养液，37℃5%～7%CO2条件下培养72小时，观察并记录细胞病变情况，记录病变程度和孔数，判定结果。根据Reed-M

8、uench法计算病毒在两种宿主细胞的半数致细胞病变的滴度(TCID50)。重复实验3次。（2）用最大无毒浓度的RDQ分别作用于接种HSV-1病毒后的兔角膜上皮细胞和猪肾细胞将10TCID50和100TCID50HSV-1病毒液分别感染96孔微量板上已长成单层的兔角膜[1]上皮细胞和猪肾细胞，37℃5%～7%CO2条件下吸附30min，吸出病毒，洗3次，弃去毒4万方数据液；用维持液2倍分别将药物稀释为最大无毒浓度，分别加入接种病毒后的两种细胞，每一病毒稀释孔各加4孔，3