枯草芽孢杆菌防治玉米纹枯病的研究

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1、／论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：域彬7．oIo年占月力日关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，

2、允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。研究生签名：导师签名：别。年寸0lo年占月，)『日6月．)f日，摘要玉米纹枯病是玉米主产区内普遍发生的一类严重土传性病害，是由立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)，玉蜀黍丝核菌(Rhizoctoniazeae)和禾谷丝核茵(Rhizoctoniacereals)引起的一类真菌性病害。从患有玉米纹枯病的土壤中分离出的一株枯草芽孢杆菌，对玉米纹枯病有很好的

3、拮抗作用，具有很大的研究价值。从玉米叶鞘和玉米根际土壤中分别分离出玉米纹枯病原菌和123株土壤细菌菌株。经鉴定病原菌属于半知茵纲丝核菌属的立枯丝核菌AG．1．IA菌丝融合群。经过对峙培养筛选出26株拮抗菌株，测定拮抗菌株对环境的抗逆性，抗逆指标有培养温度，培养时间，培养Ph值，培养基成分；测定细菌菌株的几丁质酶含量，分别使用几丁质平板法和几丁质酶测定法，最终筛选出4株含有较高几丁质酶活性并对丝核菌有较好拮抗作用的细菌为芽孢杆菌，经鉴定得知1株为环状芽孢杆菌，另3株为枯草芽孢杆菌。其中抗逆性最强，几丁质酶活力最高，拮

4、抗玉米纹枯病拮抗圈最大的为515。采用PDA液体培养基对立枯丝核菌菌丝块进行培养，观察几丁质酶对立枯丝核菌菌丝生长的影响；将几丁质酶浓度稀释为0．4U／ml，O．89U／ml，1．6U／ml，分别加入三角瓶中，在三角瓶中放入五块同等大小玉米纹枯菌丝块，做3个重复，分别培养24h，48h，72h，96h，称菌丝干重，结果表明1．6U／ml的几丁质酶浓度对立枯丝核菌的菌丝生长拮抗作用最大，菌丝生长量与培养时间有关，培养时间越长，菌丝的干重越重。使用硫酸铵对拮抗细菌菌株的拮抗蛋白进行提取，浓度分别为10％，30％，45％

5、，60％，75％，90％，以45％硫酸铵浓度提取的初酶液几丁质酶活力最高，对玉米纹枯病也有较强的拮抗作用，拮抗圈达到了O．8cm，但拮抗蛋白里的几丁质酶不纯，需进一步分析。采用物理化学诱变的方法，对拮抗菌株进行复合诱变处理，以期从中筛选出几丁质酶活力高且遗传性能良好的菌株。以枯草芽孢杆菌515为出发菌，采用物理诱变方法，其紫外光的照射时间分别为150s，200s，250s，300s，化学诱变方法使用氯化锂和硫酸二乙酯，氯化锂的浓度为O．3％，O．6％，0．9％，1．2％，1．5％，硫酸二乙酯的培养时间分别为20，4

6、0，60，80min。试验结果表明紫外线最佳诱变时间为200s，LiCL的终处理浓度为O．9％，DES最佳诱变时间为60min，诱变最终得到几丁质酶活力较出发菌提高了2．09倍的菌株515．126，对诱变菌株进行连续10代的遗传稳定性测定，结果表明遗传性能良好。采用正交试验设计改进了培养基主要碳氮源、无机盐的配比及发酵条件，产酶培养基的最佳配比为：胶体几丁质1．0％，牛肉膏O．4％，蛋白胨0．4％，KH2P040．04％，MgS04．7H200．06％。优化发酵的条件为：温度35。C，发酵时间为18h，起始PH为6

7、．5，接种量为7％，通气量为、50ml／250ml。变异菌株产酶活力又有进一步提高，酶活达到了1．53U／，ml。对诱变菌株进行利福平标记，研究其在玉米植株的根际土壤、根表和玉米叶鞘的定殖能力及对玉米纹枯病的防治作用。结果表明，菌株在根际土壤、根表有很好的定殖力，在叶鞘的定殖力较差；在灭菌土中的定殖力要强于大田里的定殖力；其病情指数低于对照高于井冈霉素的处理，为26．67％，防效作用低于井冈霉素，为49．17％，具有一定的防治效果。关键词：枯草芽孢杆菌，几丁质酶，生物防治，诱变，定殖力，玉米纹枯Ⅱ(Rhizocto

8、niasolani)withBacillussubtilisHuXiao(PlantPathology，SichuanAgriculturalUniversity)DirectedbyZhangMinAbstractMaizesheathblightisamaizediseasesofcornwhichisdestructivesoil-bornedisea